10. Wyniki
10.1. Brak HO-1 wpływa na wczesne i późne procesy przebudowy serca po
i wieku myszy kontrolne typu dzikiego poddano trwałemu podwiązaniu tętnicy wieńcowej LAD lub zabiegowi pozorowanemu (sham) polegającemu na podkłóciu tego naczynia bez jego podwiązania. Prawidłowe podwiązanie tętnicy LAD (Ryc. 11A), polegające na umieszczeniu igły pod naczyniem krwionośnym (Ryc. 11A-1), powyżej miejsca rozgałęzienia (Ryc. 11A-2), a następnie założenie szwu (Ryc. 11B) jest trudne, ze względu zmienność anatomiczną przebiegu i odgałęzień lewej tętnicy wieńcowej. LAD wygląda jak jasnoczerwona smuga przebiegająca od uszka lewego przedsionka w kierunku koniuszka serca [171] i istotne jest jej podwiązanie w odpowiednim miejscu, a nie np.: jedynie jednego z jej odgałęzień (Ryc. 11A-3). W celu jednoznacznego określenia czy wykonanie zabiegów u poszczególnych osobników charakteryzuje się wystarczającą powtarzalnością, 90 minut po indukcji zawału oznaczono odsetek niedotlenionych komórek serca. Oznaczenie
Rycina 11. Weryfikacja chirurgicznej indukcji zawału serca w modelu mysim. (A) Przykładowy przebieg tętnicy LAD (1), z zaznaczonym miejscem rozgałęzienia naczynia (2) oraz jego dwoma gałęziami (3), (B) a także miejscem umieszczenia szwu. (C) Pośrednie określenie obszaru zawału poprzez oznaczenie odsetka niedotlenionych komórek w mięśniu sercowym po zawale z użyciem znakowania chlorowodorkiem pimonidazolu (HP), przedstawione jako procent żywych komórek, 90 minut po podwiązaniu LAD (MI) lub zabiegu pozorowanym (sham). (D) Pomiar stężenia sercowej troponiny I (cTnI) testem immunoenzymatycznym ELISA w osoczu myszy w pierwszej dobie po podwiązaniu LAD (MI) lub zabiegu pozorowanym (sham); Sham: n=18 osobników/grupę, MI: n=36-46 osobników/grupę. * p≤0.05, ** p< 0,01, *** p<0,001; Rycina zaadoptowana i zmodyfikowana za [101].
64 wykonano korzystając z chlorowodorku pimonidazolu. Analiza cytometryczna zawiesiny komórek uzyskanych z serc myszy po zawale (Ryc. 11C) wykazała, że niezależnie od obecności lub braku HO-1, po indukcji MI dochodziło do zwiększenia odsetka komórek niedotlenionych (HP+) do około 14%. W przypadku zwierząt, u których przeprowadzono zabieg pozorowany, obserwowano około 2% takich komórek. Nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic pomiędzy grupami zwierząt HO-1+/+ i HO-1-/- poddanymi podwiązaniu LAD. Co więcej, immunoenzymatyczny pomiar stężenia sercowej troponiny I (cTnI) w osoczu zwierząt w pierwszej dobie po zawale (Ryc. 11D) potwierdził, że u zwierząt z prawidłowo podwiązaną tętnicą LAD stężenie cTnI sięga wysokich wartości, ponad 25 ng/ml. Dla porównania, u zwierząt kontrolnych bez żadnej ingerencji stężenie cTnI w osoczu było poniżej granicy detekcji (dane niezaprezentowane), zaś pozorowany zabieg powodował pewien wzrost stężenia cTnI do wartości około 2-5 ng/ml, co mogło być związane z niewielkim uszkodzeniem serca poprzez podkłócie tętnicy. Pomiary cTnI umożliwiły zatem potwierdzenie czy zabieg wykonano prawidłowo. Podobnie, jak w przypadku analizy komórek HP+, nie obserwowano istotnych statystycznie różnic pomiędzy grupami zwierząt HO-1+/+ i HO-1-/-, u których indukowano MI.
Monitorowano przeżywalność myszy przez 21 dni, czyli do końca eksperymentu.
Zaobserwowano zwiększoną śmiertelność myszy WT pomiędzy 3 a 5 dniem po wykonaniu podwiązania LAD (Ryc. 12A). W przypadku zwierząt poddanych pozorowanemu zabiegowi, niezależnie od genotypu przeżywalność wynosiła 100%. U myszy WT z indukowanym MI obserwowano statystycznie istotne zmniejszenie przeżywalności o ponad 20% w porównaniu do osobników HO-1 KO (Ryc. 12A). W celu określenia przyczyny większej śmiertelności obserwowanej u myszy HO-1+/+, w czasie opieki i obserwacji pooperacyjnej w przypadku zauważonego upadku przeprowadzano badane pośmiertne (Fig. 12B-D). Takie postępowanie ujawniło, że główną przyczyną śmierci myszy WT był krwotok wewnętrzny do klatki piersiowej (Ryc. 12B), a źródłem krwawienia było pęknięcie wolnej ściany lewej komory serca (LVFWR; left ventricle free wall rupture;
Ryc. 12C-D), zlokalizowane poniżej miejsca podwiązania tętnicy wieńcowej LAD (Ryc.
12 C). W celu wyjaśnienia tych różnic, określono zwartość kolagenu w sercach myszy.
Wykorzystując metodę western blot wykazano, że w czasie, kiedy najczęściej dochodziło do LVFWR – w dniu 4 po MI, serca myszy HO-1-/- zawierały znacznie więcej kolagenu typu I w obszarze zawałowym, zarówno w porównaniu do odpowiadającego mu obszaru u myszy z pozorowanym zabiegiem, jak również w stosunku do myszy typu dzikiego po MI (Ryc. 12E). Przezklatkowe echo serca, wykonane z użyciem ultrasonografu wysokich częstotliwości pokazało, że frakcja wyrzutowa lewej komory serca (LV EF; left ventricle
65 Rycina 12. Zmniejszona przeżywalność myszy typu dzikiego po zawale w porównaniu do myszy pozbawionych HO-1. (A) Krzywe przeżywalności po zawale lub zabiegu pozorowanym myszy WT i HO-1 KO. (B-D) Fotografie klatki piersiowej i serca z badania post-mortem, ukazujące pęknięcie wolnej ściany lewej komory serca (LVFWR) jako przyczynę krwotoku i śmierci myszy WT.
1. skrzepnięta krew w klatce piersiowej; 2. miejsce podwiązania LAD; 3. LVFWR. (B) Klatka piersiowa myszy po MI i LVFWR wypełniona skrzepniętą krwią. (C-D) Zdjęcia uwidaczniające LVFWR w okolicy koniuszka serca, po usunięciu skrzeplin. (E) Detekcja kolagenu typu I w obszarze zawałowym serca na 4 dni po wykonaniu zabiegu (MI lub sham). * względem odpowiadającej grupy sham; # względem grupy HO-1-/- MI; * p≤0.05, ** p< 0,01, *** p<0,001; Rycina zaadoptowana i zmodyfikowana za [101].
ejection fraction) myszy po MI, kolejno w 7, 14 i 21 dniu po zabiegu, była zmniejszona w porównaniu do tego parametru mierzonego u myszy po zabiegu pozorowanym (Ryc.
13A). Niemniej, w przypadku myszy pozbawionych HO-1 upośledzenie funkcji serca, odzwierciedlone przez zmniejszenie frakcji wyrzutowej, było znacznie większe w porównaniu do myszy typu dzikiego, począwszy od 7 dnia po zawale i utrzymywało się w kolejnych dniach aż do 3 tygodni (Ryc.13A). U myszy HO-1-/- obserwowano znacznie bardziej obniżoną wartość frakcji skracania lewej komory (LV FS; left ventricle fractional shortening) w trzy tygodnie po zawale, w porównaniu do myszy poddanych zabiegowi pozorowanemu (Ryc. 13B). U osobników pozbawionych HO-1 i poddanych podwiązaniu LAD doszło do powiększenia lewej komory serca, co odzwierciedlają pozostałe parametry:
końcowoskurczowa (Ryc. 13C) i końcoworozkurczowa (Ryc. 13D) objętość lewej komory (odpowiednio: LV Vs; LV volume in systole oraz LV Vd; LV volume in diastole) a także
66 Rycina 13. Większe upośledzenie funkcji lewej komory serca u myszy HO-1-/- w porównaniu do kontroli typu dzikiego. (A) Frakcja wyrzutowa lewej komory serca (LV EF) u myszy kontrolnych oraz we wskazanych punktach czasowych po zabiegu pozorowanym lub po indukcji MI. Zmierzone u myszy kontrolnych i 21 dni po zabiegach wartości (B) frakcji skracania lewej komory (LV FS), (C) końcowoskurczowej i (D) końcoworozkurczowej objętości lewej komory serca (odpowiednio LV Vs i LV Vd), a także (E) końcowoskurczowej i (F) końcoworozkurczowej wewnętrznej średnicy lewej komory serca (odpowiednio LV IDs i LV IDd), określone dzięki ultasonografii wysokich częstotliwości (7-10 osobników/grupę). † względem odpowiedniej grupy sham; # względem grupy HO-1+/+ MI. * p≤0.05, ** p< 0,01, *** p<0,001; Rycina zaadoptowana i zmodyfikowana za [101].
końcowoskurczowa (Ryc. 13E) i końcoworozkurczowa (Ryc. 13F) wewnętrzna średnica lewej komory (odpowiednio: LV IDs; LV internal diameter in systole oraz LV IDd; LV internal diameter in diastole). Po barwieniu skrawków mrożeniowych uzyskanych z serc 21 dni po zawale, za pomocą aglutyniny kiełków pszenicy (WGA; wheat germ agglutinin) sprzężonej z rodaminą oraz wyznakowaniu jąder komórkowych DAPI (Ryc. 14A), określono wielkość kardiomocytów w mięśniu sercowym. Wykonany został pomiar pola ich poprzecznego przekroju (CSA; cross-sectional area) w obszarze okołozawałowym oraz obszarze oddalonym od blizny zawałowej (Ryc. 14A). Pomiar wykazał, że w sercach zarówno myszy HO-1+/+ jak i HO-1-/- trzy tygodnie po zawale serca dochodzi do przerostu kardiomiocytów w obszarze okołozawałowym w porównaniu do obszaru oddalonego od
67 blizny (Ryc. 14A-B). Efekt ten był mocniejszy w obszarze okołozawałowym serc myszy HO-1 KO w porównaniu do myszy typu dzikiego (Ryc. 14A-B).
Rycina 14. W obszarze okołozawałowym serc myszy HO-1-/- dochodzi do większego przerostu kardiomiocytów niż u myszy typu dzikiego. (A) Reprezentatywne obrazy skrawków uzyskanych z serc po barwieniu aglutyniną kiełków pszenicy (WGA; wheat germ agglutinin) sprzężoną z rodaminą (czerwony) oraz DAPI dla uwidocznienia jąder komórkowych (niebieski) w strefie okołozawałowej i strefie oddalonej od miejsca uszkodzenia mięśnia sercowego. (B) Wykres podsumowujący ilościowo dane dotyczące pola przekroju poprzecznego (CSA) kardiomiocytów. * p≤0.05, ** p< 0,01, ***
p<0,001; Rycina zaadoptowana i zmodyfikowana za [101].
10.2. Brak HO-1 przyczynia się do większej mobilizacji monocytów po zawale