Ekstrakcja próbek

W celu przygotowania próbek żywności do analizy właściwej bardzo często

poddaje się je różnym metodom ekstrakcyjnym. Najbardziej popularne są: ekstrakcja w układzie ciecz-ciecz, ekstrakcja w układzie ciecz-ciało stałe, ekstrakcja do fazy stałej

oraz mikroekstrakcja do fazy stałej.

Ekstrakcja w układzie ciecz-ciecz

Jest to technika izolacji i wzbogacania analitów, którą zalicza się do grupy procesów

dyfuzyjnych. Z uwagi na różnicę stężeń, związki badane przemieszczają się do odpowiednio dobranego rozpuszczalnika i dzielą między matrycę a ekstrahent

zgodnie z prawem podziału Nernsta. Ekstrakcję tę prowadzi się przy wykorzystaniu rozpuszczalnika niemieszającego się z matrycą. Zazwyczaj jest to układ: woda-rozpuszczalnik organiczny. Technika ta może być stosowana zarówno w temperaturze

pokojowej jak też niższej, przez co nadaje się do izolacji substancji nietrwałych. W pierwszej kolejności analizowane próbki wstrząsa się wraz z rozpuszczalnikiem

112 | S t r o n a

w specjalnych rozdzielaczach, a następnie rozdziela się obie fazy poprzez np. wirowanie czy odstawianie, a na końcu wydziela się anality poprzez np. destylację,

liofilizację czy krystalizację. Podstawową niedogodnością tego typu ekstrakcji jest duże zużycie rozpuszczalnika, co daje zbyt dużą objętość ekstraktu w stosunku do potrzeb analizy. Ekstrakt trzeba zatem zatężać przez co proces jest pracochłonny oraz może prowadzić do pewnych strat analitu. Ponadto zatężony rozpuszczalnik może być

źródłem zanieczyszczeń próbki końcowej - minimalna obecność interferenta w rozpuszczalniku powoduje po jego zatężeniu pojawienie się sygnału, mogącego

zdecydowanie zmienić interpretację wyników oznaczeń.

Ekstrakcja w układzie ciecz-ciało stałe

Ekstrakcję typu ciecz - ciało stałe przeprowadza się w celu wyekstrahowania z ciała

stałego określonego składnika rozpuszczalnego w danym rozpuszczalniku. Metoda ta polega na wybiórczym rozpuszczaniu substancji znajdującej się w stałej próbce.

Ekstrakcję tego typu najczęściej prowadzi się w aparacie Soxhleta (Rys. 46)

1 - kolba destylacyjna 2 - ekstraktor

3 - rurka przelewowa 4 - chłodnica zwrotna

Rys. 46. Aparat Soxhleta

Aparat Soxhleta składa się z czterech części: kolby destylacyjnej (1) , ekstraktora (2), rurki przelewowej (3) i chłodnicy zwrotnej (4). Ekstrahowane ciało stałe umieszcza się w bibułowej gilzie w środkowej części aparatu. W kolbie znajduje się łatwo lotny rozpuszczalnik, który w wyniku podgrzania zaczyna wrzeć, a jego pary przedostają się do chłodnicy zwrotnej. Po skropleniu rozpuszczalnik gromadzi się w środkowej części aparatu, gdzie znajduje się gilza. W dalszej kolejności ciecz z wyekstrahowaną

113 | S t r o n a

substancją samoczynnie przelewa się do kolby, gdzie następuje ponowne oddestylowanie rozpuszczalnika. W efekcie wydzielona substancja pozostaje w kolbie rozpuszczona w nadmiarze rozpuszczalnika.

Ekstrakcja do fazy stałej SPE

Ekstrakcja do fazy stałej (Solid Phase Extraction, SPE) to technika izolowania analitu w układzie ciecz - ciało stałe oparta na chromatografii przy użyciu zmodyfikowanych

powierzchniowo materiałów krzemionkowych czy polimerycznych. Są to zazwyczaj adsorbenty takie jak żel krzemionkowy, florisil, tlenek glinowy, krzemionka modyfikowana grupami alkilowymi (np. C-18), fenylowymi, cyjanowymi, propyloaminowymi lub fazy stacjonarne typu SCX – kwas sulfonowy oraz SAX – czwartorzędowe aminy, czy też różnego rodzaju modyfikacje polimeru diwinylobenzenu (DVB). Zasada rozdziału metodą SPE zależy głównie od natury sorbentu, natomiast cały proces składa się z czterech etapów: kondycjonowanie kolumny, nanoszenie próbki, wymywanie zanieczyszczeń oraz elucja analitów (Rys. 47)

Rys. 47. Etapy procesu ekstrakcji do fazy stałej

Kondycjonowanie kolumny - złoże przemywa się rozpuszczalnikiem (takim samym jaki zastosowany zastanie do elucji) w celu usunięcia ewentualnych

zanieczyszczeń z kolumny. Następnie poprzez dodanie rozpuszczalnika o właściwościach najbardziej zbliżonych do właściwości matrycy próbki, sorbent zostaje

aktywowany, dzięki czemu złoże jest przygotowane do selektywnego zatrzymywania

analitu. Przykładowo stosując niepolarną fazę stacjonarną taką jak żel krzemionkowy z grupami oktadecylowymi, podczas kondycjonowania, wstępnie skręcone łańcuchy

114 | S t r o n a

alkilowe rozprostowują się, co zwiększa powierzchnię adsorpcji. Należy zwrócić uwagę,

aby przed przystąpieniem do kolejnego etapu nad powierzchnią złoża pozostało ok. 1 mm cieczy, co zapobiega wysuszeniu złoża. W przeciwnym wypadku

kondycjonowanie należy powtórzyć.

Nanoszenie próbki - uprzednio przefiltrowaną lub odwirowaną próbkę wprowadza

się przy pomocy np. pipety Pasteura w całości na powierzchnię złoża, a następnie za pomocą próżni lub nadciśnienia powoli przepuszcza przez złożę. Przepływ nie

powinien przekraczać 5 ml/min. Ekstrahując duże ilości próbki, może dojść do utraty przez sorbent właściwości selektywnej adsorpcji analitów. Aby je utrzymać do próbki dodaje się niewielką ilość rozpuszczalnika organicznego stosowanego podczas kondycjonowania (do 10%).

Wymywanie - może być przeprowadzone na dwa sposoby:

 W pierwszym przypadku badane związki pozostają w złożu, natomiast zanieczyszczenia usuwane są za pomocą rozpuszczalnika, w którym znajdowała się

próbka, bądź innego, który nie usunie analitów (jest słabszym eluentem od rozpuszczalnika użytego do elucji analitów, a silniejszym od matrycy),

 W drugiej metodzie to anality zostają wymyte z kolumny. Sorbent przemywa się roztworem, w którym znajdowała się próbka. W tym przypadku jest to ostatni etap procesu ekstrakcji do fazy stałej.

Elucja analitów – w celu wymycia analitów zatrzymanych na kolumnie stosuje się

od 200 µl do 2 ml eluentu. Przepływ powinien być powolny, natomiast dla uzyskania lepszej skuteczności wymywania eluent powinien być podawany dwiema mniejszymi porcjami. Wyciek zbiera się i przygotowuje do dalszej analizy.

Mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME)

Podstawą tej metody ekstrakcji jest cienkie włókno ze stopionej krzemionki, którego powierzchnię pokryto cienką warstwą sorbentu. Włókno to przymocowane jest do tłoka mikrostrzykawki, dzięki czemu może być wysuwane lub wsuwane do igły strzykawki. Najczęściej stosowanymi sorbentami są: polidimetylosiloksan (PDMS), poliakrylan (PA) i różne ich mieszaniny, np. polidimetylosiloksan-polidiwinylobenzen (PDMS/DVB), Carbowax, Carboxen. Rodzaj i grubość włókna są dobierane w zależności od właściwości fizycznych analitów. Technika ta może być stosowana zarówno do próbek ciekłych jak i do próbek stałych i gazowych (HS).

115 | S t r o n a

Analiza techniką SPME składa się z dwóch etapów:

 I etap – włókno jest zanurzane bezpośrednio w badanej próbce ciekłej (DI- Direct Immersion SPME) lub jest umieszczony w fazie nadpowierzchniowej (HS- Head Space SPME) gdzie następuje podział związków organicznych pomiędzy fazę stacjonarną osadzoną na włóknie i matrycę (Rys. 48),

Rys. 48 Schemat bezpośredniej mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej (DI-SPME) oraz mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej w warstwie nadpowierzchniowej (HS-SPME)

 II etap – to desorpcja termiczna odbywająca się w dozowniku chromatografu gazowego, gdzie wysoka temperatura powoduje znaczną zmianę współczynnika podziału związków zatrzymanych na fazie stacjonarnej w kierunku desorpcji do fazy gazowej.

Wydajność tej metody ekstrakcji można modyfikować, przeprowadzając anality w pochodne. Ze względu na miejsce przeprowadzania procesu derywatyzacji możemy

tu wyróżnić:

 derywatyzację bezpośrednio w matrycy „in situ‖ – pochodne otrzymane w wyniku reakcji ekstrahuje się do włókna SPME;

 derywatyzację na włóknie SPME – włókno jest impregnowane odczynnikiem derywatyzującym, a następnie anality są wyodrębniane z matrycy do włókna, gdzie ulegają derywatyzacji;

 derywatyzację w komorze dozownika chromatografu – wprowadzenie

wyekstrahowanego analitu do włókna w postaci pary jonowej, a następnie do dozownika chromatografu gazowego, gdzie dzięki wysokiej temperaturze

116 | S t r o n a