Pracownia Hemogenetyki Sądowej Zakładu Medycyny Sądowej Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin
Kierownik: dr hab. n. med. Mirosław Parafiniuk
1 Zakład Technik Molekularnych Katedry Medycyny Sądowej Akademii Medycznej im. Piastów Śląskich we Wrocławiu ul. M. curie -Skłodowskiej 52, 50-368 Wrocław
Kierownik: prof. dr hab. n. med. Barbara Świątek
2 Pracownia Genetyki Sądowej Katedry i Zakładu Medycyny Sądowej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi ul. Sędziowska 18 a, 91-304 Łódź
Kierownik: dr hab. n. med., prof. UM Jarosław Berent
Summary
Introduction: Bad quality and slender amount of the material at our disposal during identity examination and ever growing number of expired and difficult identity cases compelled us to examine: 1) amplification grade and amount of human DNA in degraded biological material originating from diverse environments and historical periods; 20 operat-ing mode in case of biological material from its preparation through isolation, amplification till interpretation of the achieved results; 3) usefulness of the accepted identification and amplification method while creating an identification procedure pattern in case of strongly decayed material.
Materials and methods: The research material were samples isolated from: bone fragments collected from grave crypts, bone fragments collected during autopsies performed in the Forensic Medicine Institute PMA and during exhuma-tions. DNA isolation was done by means of modified osseous DNA preparation method proposed by Żołędziewska and Dobosz. DNA amount was determined by means of AbI PRISM 7900HT Sequence Detection System apparatus with the use of Quantifiler Human DNA Qualification Set. The samples were amplified by means of AmpFSTR SGM Plus set and were separated electrophoretically in the AbI PRISM 310 apparatus.
Conclusions: 1. environmental conditions like humid-ity, temperature, subsoil and microorganisms putrefying the body have the greatest influence on the preservation and DNA degradation grade. 2. Low amplification of long DNA fragments testifies that in the future the analysis of degraded DNA would be made with the use of sets based on the short fragments: ca. 100 pz. 3. Time that elapses since death is of less significance when we take into account tis-sues exposed to unfavourable, multifactoral environmental influence. 4. The method used and introduced modifications can be freely utilised in identification cases when the material is strongly decayed, coming from victims of mass disasters, terrorist attempts, genocide and natural cataclysms when the use of standard methods is impedimented or impossible.
K e y w o r d s: ancient DNA – STR – genetic identifica-tion.
Streszczenie
Wstęp: Biorąc pod uwagę często złą jakość i znikomą ilość materiału, jaki jest posiadany w badaniach identy-fikacyjnych, oraz ciągle wzrastającą ilość zadawnionych i trudnych spraw identyfikacyjnych, autorzy niniejszej pracy
140 ANDRZeJ OSSOWSKI, JAROSŁAW PIĄTeK, TADeUSZ DOBOSZ I WSP.
postanowili zbadać: 1) stopień amplifikacji i ilość ludzkiego DNA w zdegradowanym materiale biologicznym pochodzą-cym z różnych środowisk i z różnych okresów historycznych;
2) tryb postępowania z materiałem od jego przygotowania poprzez izolację, amplifikację aż do interpretacji uzyska-nych wyników; 3) przydatność zastosowanej metody izolacji i amplifikacji przy tworzeniu schematu postępowania identy-fikacyjnego w przypadku materiału o silnym stopniu rozkła-du, pochodzącym od ofiar katastrof i różnych kataklizmów, gdzie zastosowanie standardowych procedur w badaniach identyfikacyjnych jest utrudnione lub niemożliwe.
Materiał i metody: Materiałem do badań polimorfi-zmu DNA były próbki wyizolowane: z fragmentów kości pobranych z krypt grobowych (czas pochówku ustalono na XVII/XVIII w.), z fragmentów kości pobranych podczas sekcji przeprowadzanych w Zakładzie Medycyny Sądowej Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie, ze zwłok w różnym stopniu rozkładu, przechowywanych po zabez-pieczeniu w temperaturze -20ºc, oraz z fragmentów kości pobranych podczas ekshumacji szczątków ludzkich z okresu II wojny światowej. Izolacji DNA dokonano przy użyciu zmodyfikowanej przez zespół metody preparowania DNA z kości zaproponowanej przez Żołędziewską i Dobosza.
Wnioski: 1. Na zachowanie i stopień degradacji DNA największy wpływ mają warunki środowiskowe, takie jak wilgotność, temperatura, podłoże i mikroorganizmy roz-kładające ciało. 2. Niska amplifikacja długich fragmentów DNA wskazuje, że w przyszłości w analizie zdegradowanego DNA stosowane będą zestawy oparte na krótkich frag-mentach około 100 pz. 3. czas jaki minął od zgonu ma mniejsze znaczenia w przypadku, gdy mamy do czynienia z tkankami narażonymi na niekorzystne, wieloczynniko-we działanie środowiska. 4. Zastosowana metoda postępo-wania i wprowadzone modyfikacje mogą być swobodnie stosowane w procesach identyfikacyjnych w przypadku materiału mocno uszkodzonego, pochodzącego od ofiar katastrof masowych, ataków terrorystycznych, zbrodni lu-dobójstwa i kataklizmów naturalnych, kiedy zastosowanie standardowych procedur identyfikacyjnych jest utrudnione lub niemożliwe.
H a s ł a: zdegradowane DNA – STR – identyfikacja genetyczna.
Wstęp
Ustalenie tożsamości N.N. szczątków ludzkich stanowi jedno z zasadniczych zadań organów ścigania i wymiaru sprawiedliwości, stąd jest jednym z podstawowych zagad-nień medycyny sądowej [1].
Identyfikacja N.N. osób od zarania nastręczała medy-cynie sądowej wiele problemów. Odbywała się głównie na podstawie cech fenotypowych denata. W przeszłości duży problem stwarzała identyfikacja osobnicza w przypadku, gdy zwłoki były w znacznym rozkładzie lub gdy zostały
mocno uszkodzone, np. spalone lub rozkawałkowane [2, 3, 4]. Obecnie badania hemogenetyczne są wykonywane rutynowo, a dzięki osiągnięciom w tej dziedzinie wzra-sta ilość wykrytych sprawców przestępstw i identyfika-cji osób N.N. [3, 5, 6, 7, 8]. Pomimo ogromnego postępu technologicznego, sprawy, w których występuje materiał strupieszały, silnie rozłożony czy zeszkieletowany, nadal stanowią problem.
Biorąc pod uwagę często złą jakość i znikomą ilość materiału, jaki jest posiadany w badaniach identyfikacyj-nych, oraz ciągle wzrastającą ilość zadawnionych i trudnych spraw identyfikacyjnych, autorzy niniejszej pracy postano-wili zbadać: 1) stopień amplifikacji i ilość ludzkiego DNA w zdegradowanym materiale biologicznym pochodzącym z różnych środowisk i z różnych okresów historycznych;
2) tryb postępowania z materiałem od jego przygotowania poprzez izolację, amplifikację aż do interpretacji uzyskanych wyników; 3) przydatność zastosowanej metody izolacji i am-plifikacji przy tworzeniu schematu postępowania identyfika-cyjnego w przypadku materiału o silnym stopniu rozkładu, pochodzącym od ofiar katastrof i różnych kataklizmów, gdzie zastosowanie standardowych procedur w badaniach identyfikacyjnych jest utrudnione lub niemożliwe.
Materiał i metody
Materiałem do badań polimorfizmu DNA były prób-ki wyizolowane: z fragmentów kości pobranych z krypt grobowych (czas pochówku ustalono na XVII/XVIII w.), z fragmentów kości pobranych podczas sekcji przeprowadza-nych w Zakładzie Medycyny Sądowej Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie, ze zwłok w różnym stopniu roz-kładu, przechowywanych po zabezpieczeniu w temp. −20ºc, oraz z fragmentów kości pobranych podczas ekshumacji szczątków ludzkich z okresu II wojny światowej.
Łącznie przebadano 59 próbek, w tym:
46 fragmentów tkanki kostnej, – 13 próbek zębów.
–czas, jaki minął od śmierci aż do momentu pobrania materiału i dalszych badań, był bardzo różny. Starano się zebrać jak najbardziej różnorodny materiał badawczy, tak więc rozpiętość czasowa badanego materiału była bar-dzo szeroka, od kilku miesięcy do kilkuset lat. Podobnie do badań starano się pobierać materiał ze skrajnie różnych środowisk:
grobów zbiorowych zlokalizowanych na glebach piaszczystych (ryc. 1), –
grobów zbiorowych zlokalizowanych na glebach gliniastych (ryc. 2),–
szczątków przebywających w środowisku bagien-nym (ryc. 3),–
szczątków przebywających w środowisku słono-wodnym (ryc. 4), –
szczątków strupieszałych (ryc. 5), – szczątków nie pogrzebanych (ryc. 6).
–
IDeNTYFIKAcJA GeNeTYcZNA MATeRIAŁU KOSTNeGO Z RÓŻNYcH OKReSÓW HISTORYcZNYcH 141
Ryc. 1. Grób zbiorowy żołnierzy radzieckich Fig. 1. Mass grave of Soviet soldiers
Ryc. 2. Grób dwóch żołnierzy niemieckich Fig. 2. Grave of two German soldiers
warstwy sterylnym skalpelem. Po czyszczeniu wycinek zanurzano w ciekłym azocie w temp. −196ºc na 15 min.
Po upływie tego czasu kość przenoszono do moździerza wykonanego ze stali nierdzewnej i kruszono na drobny pył poprzez silne uderzenie młotkiem w tłuk moździerza. Po-wtórnie zalewano wstępnie skruszoną kość ciekłym azotem i domrażano, następnie ponownie kruszono (modyfikacja własna).
etap 1 – zamrażanie tkanki w ciekłym azocie w temp. −196ºc przez 15 min.
etap 2 – wstępne kruszenie poprzez stłuczenie w moź-dzierzu.
etap 3 – domrażanie wstępnie skruszonej tkanki cie-kłym azotem przez 2 min.
etap 4 – końcowe skruszenie zamrożonego materiału (ryc. 7).
Tak przygotowany proszek przesypywano do probówki 50 mL do wysokości 5 mL, zalewano 3 mL buforu eks-trakcyjnego pH 8,0.
Materiał inkubowano przez 48 godz. w temperatu-rze pokojowej i kilkakrotnie worteksowano. Po 48 godz.
do próbki dodawano 100 µL proteinazy K (20 mg/mL)
Ryc. 3. Szczątki wydobyte z bagien pod Berlinem Fig. 3. Human remains excavated from a swamp area near Berlin
Izolacji DNA dokonano przy użyciu zmodyfikowanej przez zespół metody preparowania DNA z kości zapropono-wanej przez Lebiodę i wsp., Żołędziewską oraz Żołędziewską i Dobosza [9, 10, 11, 12].
Materiał kostny do izolacji przygotowywano poprzez wycięcie za pomocą sterylnej piły fragmentu kości, który następnie oczyszczano poprzez zeskrobanie wierzchniej
142 ANDRZeJ OSSOWSKI, JAROSŁAW PIĄTeK, TADeUSZ DOBOSZ I WSP.
Ryc. 4. Szczątki wydobyte ze środowiska morskiego Fig. 4. Human remains excavated from the sea be
Ryc. 5. Szczątki pochodzące z krypt grobowych Fig. 5. Human remains from a crypt
Ryc. 6. Szczątki niepogrzebane Fig. 6. Unburied remains
na 1 mL preparatu (modyfikacja własna) i inkubowano w temp. 55°c przez 24 godz., worteksując kilkakrotnie.
Próbkę wirowano przez 1 min przy 10 000 obr./min, super-natant ściągano i przenoszono do probówek eppendorfa.
Do supernatantu dodawano odczynnika fenolowego pH 8,0 w stosunku 1:1, mieszano i odwirowano przez 1 min przy 10 000 obr./min.
Ryc. 7. etapy przygotowania materiału kostnego do izolacji Fig. 7. Preparation stages of osseous material for isolation
IDeNTYFIKAcJA GeNeTYcZNA MATeRIAŁU KOSTNeGO Z RÓŻNYcH OKReSÓW HISTORYcZNYcH 143 Następnie zbierano górną frakcję zawierającą DNA
i przenoszono do nowej probówki eppendorfa, pozostałość odrzucano. Etapy 6 i 7 powtarzano dwukrotnie. Zbierano supernatant do nowej probówki eppendorfa, zalewano od-czynnikiem chloroformowym pH 8,0 w stosunku 1:1 i mie-szano, dalej wirowano przez 1 min przy 10 000 obr./min.
Odciągano supernatant do nowej probówki eppendorfa (DNA znajdowało się w supernatancie). Supernatant oczyszczano zestawem QIAquick PcR Purification Kit (QIAGeN).
Supernatant mieszano z buforem PB według instrukcji producenta (w stosunku 1 mL buforu Pb, 0,4 mL ekstraktu z DNA) i nakładano na kolumnę z krzemionką. Inkubowa-no 5 min w temp. pokojowej, a następnie wirowaInkubowa-no przez 30–60 s przy 10 000 obr./min. Przesącz wylewano, a czyn-ność powtarzano do momentu zużycia całości ekstraktu.
Kolumnę przemywano 0,75 mL buforu płuczącego Pe i wirowano przez 1 min przy 10 000 obr./min, następnie wy-lano przesącz i wirowano przez 1 min przy 13 000 obr./min by osuszyć sączek.
Na kolumnę nałożono 200 µL buforu elucyjnego Eb, pozostawiono w temp. pokojowej na 10 minut i wirowano przez 1 min przy 12 000 obr./min.
Oczyszczony ekstrakt mieszano z buforem Pb i na-noszono na nową kolumnę. Proces oczyszczania przepro-wadzano jak poprzednio, pkt 9–11 (w punkcie 11 do elucji używamy 50 µL buforu eB) [10, 11, 12].
Reakcje PcR przeprowadzono poprzez amplifikowanie uzyskanych izolatów zestawem komercyjnym AmpFlSTR®
SGM Plus™ firmy Applied Biosystems. W zestawie tym amplifikowane są powtarzalne regiony następujących STR loci: D3S1358, vWA, D16S539, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, TH01, FGA i marker amelogeniny. Każda para primerów jest wyznakowana którymś z barwników:
5-FAM, JOe, NeD. Barwnik 5-FAM jest odczytywany jako niebieski, JOe jako zielony i NeD jako żółty. Reakcje PcR przeprowadzono przy użyciu termocyklera GeneAmp® PcR System 2400 firmy Perkinelmer [13]. Analizę zamplifiko-wanych fragmentów przeprowadzono na urządzeniu ABI PRISM 310 Genetic Analyzer, przy zastosowaniu opro-gramowania Gene Scan i Genotyper Applied biosystem [5, 14, 15].
Do badań przygotowywano mieszaninę reakcyjną złożoną z 10,5 µL miksu reakcyjnego, 0,5 µL Gold DNA Polimerazy, 5,5 µL AmpFSTR SGM Plus Primerów w każdej probówce reakcyjnej, następnie dodawano 10 µL izolatu DNA [13].
Oznaczenia ilości DNA w badanych próbkach doko-nano za pomocą urządzenia ABI PRISM 7900HT Sequen-ce Detection System. Zestaw Quantifiler™ Human DNA Quantification Kit posłużył do oznaczenia ilości ludzkiego DNA i obecności inhibitorów reakcji PcR [16].