Metody retrospektywne

W dozymetrii retrospektywnej wykorzystuje się zarówno metody oparte na pomiarze zjawisk biologicznych jak i zjawisk fizyko‐chemicznych. Metody biologiczne, takie jak metoda mikrojądrowa, oznaczanie częstości występowania wymian odcinków chromatyd siostrzanych lub aberracji chromosomowych pozwalają na określenie częstości powstawania zmian genetycznych w wyniku nieprawidłowej naprawy DNA. Metoda fizyko‐chemiczna, taka jak spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) pozwala wykryd w tkankach cząsteczki chemiczne posiadające niesparowane elektrony (rodniki). Zaletą wymienionych metod jest możliwośd badania trwałych skutków działania promieniowania. Eliminacja komórek (tkanek) z takimi zmianami z organizmu jest stosunkowo powolna. Czułośd metod biologicznych określa się na 0,1‐0,5 Gy, a metody EPR na 0,1 Gy.

6.3.1.1 Metoda mikrojądrowa

Test mikrojądrowy jest metodą cytogenetyczną pozwalającą na wykrywanie podwójnoniciowych pęknięd DNA i uszkodzeo wrzeciona podziałowego ujawniających się po podziale komórek. Mikrojądro powstaje, jeżeli w czasie mitozy cały chromosom lub fragment chromosomu nie zostanie rozdzielony pomiędzy dwa jądra potomne. Według klasyfikacji zaproponowanej przez Fenecha i wsp. *3+ mikrojądro powinno byd mniejsze niż ⅓ wielkości normalnego jądra, (2) wyraźnie oddzielone od jądra, i (3) podobnie wybarwione jak jądro komórki. Mikrojądra stosunkowo łatwo liczy się przy użyciu mikroskopu i ich liczenie nie wymaga dużego doświadczenia. Początkowo mikrojądra liczono w czasie normalnych podziałów komórki,

44 następnie zaczęto stosowad cytochalazynę B, która blokuje podział cytoplazmy (cytokinezę) i zaczęto liczyd mikrojądra w komórkach dwujądrzastych (Rysunek 6.3-1Rys. 4). Zastosowanie cytochalazyny B podwyższyło czułośd metody i ją uprościło. Ostatnio wprowadzono kolejną modyfikację testu mikrojądrowego polegającą na połączeniu go z metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (patrz poniżej). Odpowiedni dobór sond pozwala na stwierdzenie czy mikrojądro zawiera cały chromosom, czy fragment acentryczny.

Rysunek 6.3-1. Schematyczne przedstawienie przebiegu testu mikrojądrowego bez zastosowania cytochalazyny B (A) i z zastosowaniem cytochalazyny B (B)

Dla celów dozymetrii biologicznej test mikrojądrowy wykonuje się z reguły na limfocytach krwi obwodowej (Rys. 5). Znane są jednak modyfikacje tego testu wykonywane na komórkach nabłonka worka policzkowego, erytrocytach lub komórkach szpiku kostnego.

6.3.1.2 Metoda wymian odcinków chromatyd siostrzanych

Metodą wymiany chromatyd siostrzanych (ang. sister chromatid exchange, SCE) bada się częstośd występowania wzajemnych, symetrycznych wymian fragmentów pomiędzy identycznymi sekwencjami DNA obu chromatyd w chromosomie *4+. Wymiana fragmentów chromatyd siostrzanych jest możliwa do oceny w płytkach metafazalnych uzyskanych z hodowli komórek prowadzonych w obecności bromodeoksyurydyny (BrdU). Po dodaniu BrdU do dzielących się komórek (stymulowane limfocyty) jest ona wbudowywana w nid DNA w czasie syntezy. Ponieważ przed podziałem mitotycznym DNA zawarty w komórce jest podwajany, ta nowa połowa DNA zawiera wbudowaną BrdU. W czasie podziału ta połowa segregowana jest do jednej z komórek potomnych. Obecnośd BrdU w DNA można wykryd stosując specjalne metody barwienia. Drugi podział przebiega podobnie i w drugiej mitozie obserwuje się symetryczne wymiany pomiędzy chromatydami zawierającymi BrdU i tymi, które BrdU nie zawierają (Rys. 6).

45

Rysunek 6.3-2 . Schematyczne przedstawienie przebiegu testu wymian siostrzanych. Chromatydę wyznakowaną BrdU przedstawiono kolorem białym

Przyczyny występowania SCE nie są do kooca wyjaśnione. Jest to prawdopodobnie proces naturalny (crossing‐over) zwiększający zróżnicowanie genetyczne. W preparatach kontrolnych występuje 4‐5 SCE na komórkę. Przyjmuje się, że więcej niż 14 wymian na komórkę nie jest stanem normalnym.

Obecnie metoda wychodzi z użycia i jest używana głównie do badania cytotoksyczności związków chemicznych in vitro. Wadą tej metody jest brak korelacji z dawką pochłoniętą promieniowania [5].

6.3.1.3 Metoda aberracji chromosomowych

Aberracje chromosomowe powstają w wyniku błędnej naprawy DSB. Jeżeli w komórce występują jednocześnie dwa lub więcej DSB, wolne kooce nici w trakcie procesu naprawy mogą zostad błędnie połączone. Koniec nici należącej do jednego chromosomu może zostad połączony z koocem nici należącej do innego chromosomu (translokacje międzychromosomowe) lub z innym koocem nici należącej do tego samego chromosomu (translokacje wewnątrzchromosomowe). Ponieważ przywrócona zostaje ciągłośd nici DNA, zmiany takie, o ile nie prowadzą do śmierci komórki, są trwałe i mogą byd przekazywane w czasie podziału komórkom potomnym. Czynniki genotoksyczne indukują uszkodzenia, które ujawniają się jako aberracje tylko wtedy, gdy w komórce następuje replikacja DNA. Do badao narażenia ludzi wykorzystuje się zwykle limfocyty krwi obwodowej, ale w badaniach in vitro można stosowad też inne komórki, na przykład komórki jajnika chomika chioskiego (CHO) lub fibroblasty płuc chomika (komórki V79). Jeżeli stosuje się komórki w fazie G⁰ (limfocyty) konieczne jest stymulowanie ich do podziałów komórkowych, przez podanie odpowiedniego antygenu (fitochemaglutynina). Po około 48 godzinach dodaje się do hodowli limfocytów kolcemidu, substancji blokującej tworzenie się wrzeciona podziałowego i rozchodzenie się chromosomów w czasie mitozy. W ten sposób podział komórki jest zablokowany na początku mitozy, co pozwala na ocenę wszystkich chromosomów (Rysunek 6.3-3).

Rysunek 6.3-3. Schematyczne przedstawienie przebiegu testu aberracji chromosomowych

Klasyczna analiza aberracji chromosomowych w komórkach metafazalnych pozwala na wykrycie

46 dostrzegalnych przy użyciu mikroskopu zmian w liczbie (aberracje numeryczne) i morfologii chromosomów (aberracje strukturalne). Aberracje numeryczne zwykle są nieprzydatne dla potrzeb dozymetrii biologicznej, z uwagi na często występujące artefakty związane z preparatyką komórek.

Natomiast aberracje strukturalne, takie jak złamania chromosomów i chromatyd, chromosomy pierścieniowe lub chromosomy dicentryczne i fragmenty acentryczne są z powodzeniem wykorzystywane do szacowania dawki pochłoniętej. Najlepszą korelację pomiędzy występowaniem określonego typu aberracji i dawką pochłoniętą uzyskuje się dla chromosomów dicentycznych i właśnie ocena częstości występowania tych aberracji jest dzisiaj stosowana najczęściej. Niestety powstanie chromosomu dicentrycznego prowadzi zwykle do śmierci komórki, co powoduje, że komórki zawierające dicentryki są stosunkowo szybko eliminowane z krwioobiegu. Stanowi to pewne utrudnienie przy oceni dawki pochłoniętej, zwłaszcza w dłuższym czasie po napromienieniu. Główną wadą metody aberracji chromosomowych jest jej duża pracochłonnośd i koniecznośd zatrudnienia do oceny preparatów wysokokwalifikowanego personelu. Istotnym ulepszeniem metody aberracji chromosomowych jest wprowadzenie metody hybrydyzacji in situ z zastosowaniem barwników fluorescencyjnych (FISH), która pozwala na wykrywanie niedostrzegalnych bez takiego barwienia translokacji fragmentów chromosomów.

6.3.1.4 Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (ang. fluorescent in situ hybridization, FISH) jest techniką cytogenetyczną, służącą do wykrywania w badanym materiale genetycznym określonej sekwencji DNA za pomocą fluorescencyjnych sond DNA. Odpowiednie przygotowanie komórek do badania wymaga usunięcia cytoplazmy i utrwalenia jąder komórkowych na szkiełku podstawowym. Fluorescencyjna sonda jest nanoszona na preparat i całośd podawana jest krótkotrwałej denaturacji w podwyższonej temperaturze, która powoduje rozerwanie się wiązao wodorowych pomiędzy nidmi DNA. Następnie preparat poddaje się kilkugodzinnej hybrydyzacji, w czasie której fluorescencyjnie wyznakowane odcinki znanego DNA (sonda) wiążą się z komplementarnymi odcinkami badanego DNA. Nadmiar niezhybrydyzowanej sondy usuwa się przez kilkukrotne płukanie preparatu. Tak przygotowany preparat można analizowad przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.

Metoda FISH może być wykorzystana do badania wielu typów komórek i tkanek

. W dozymetrii wykorzystuje się ją przede wszystkim do badania aberracji chromosomowych w limfocytach krwi obwodowej. Metodę FISH stosuje się w przypadkach, gdy zawodzi klasyczna analiza cytogenetyczna, ponieważ umożliwia ona dużo dokładniejszą analizę translokacji. W ostatnich latach gwałtownie rozwija się technika wielokolorowej FISH (ang.

multicolor FISH, m‐FISH), w której każdy chromosom hybrydyzuje z sondą wyznakowaną innym kolorem. Dzięki wyznakowaniu wszystkich chromosomów, technika ta umożliwia zbadanie translokacji złożonych z fragmentów kilku chromosomów (Rysunek 6.3-4). Metoda FISH, a szczególnie m‐FISH stanowi istotny postęp w analizie aberracji chromosomowych, i z pewnością będzie coraz szerzej stosowana w dozymetrii biologicznej. Głównym ograniczeniem szerszego zastosowania m‐FISH jest obecnie jej wysoki koszt i koniecznośd zastosowania specjalnych wspomaganych komputerowo systemów analizy obrazu.

Rysunek 6.3-4. Chromosomy człowieka wybarwione metodą m‐FISH. Komórka napromieniona dawką2 Gy jonów węgla o energii 11,4 MeV. Wyraźnie widoczne translokacje w obrębie chromosomu 3 i 10 (zdjècie dzięki uprzejmości dr Sylwestra Sommera, Instytut Chemii i Techniki Jądrowej)

47

6.3.1.5 EPR

Dozymetria metodą elektronowego paramagnetycznego rezonansu (EPR) przebojem wkroczyła na pole dozymetrii biologicznej w latach 90‐tych. Metoda ta polega na pomiarze ilości stałych rodników tworzących się w ciele człowieka pod wpływem promieniowania jonizującego. Najbardziej przydatny do tego celu okazał się hydroksyapatyt (Ca¹⁰ (PO⁴)⁶(OH)²) zawarty w kościach i szkliwie zębów. Szczególnie szkliwo zębów jest przydatne dla celów dozymetrii biologicznej, ponieważ zawiera bardzo dużo hydroksyapatytu (96%), tworzy się w dzieciostwie i, w odróżnieniu od kości, przez resztę życia człowieka nie ulega przebudowie ani odnowie. Węglany zawarte w hydroksyapatycie pod wpływem promieniowania jonizującego przekształcają się w anionorodniki węglanowe (CO^2•‐). Trwałośd takich rodników ocenia się na 10⁷lat *2+. Przygotowanie próbki obejmuje oddzielenie korzenia zęba od jego korony i usunięcie z niej dentyny. Dentyna zawiera więcej substancji organicznej (30%) niż szkliwo (2%) i jej obecnośd może zaburzyd otrzymane wyniki. Po oddzieleniu dentyny szkliwo kruszy się i rozciera na proszek, co poprawia wykrywanie sygnału EPR. Tak przygotowany materiał mierzy się w spektrometrze EPR w paśmie X. Dawkę pochłoniętą określa się na podstawie wielkości piku sygnału charakterystycznego dla CO^2•‐. Metoda ta została z powodzeniem użyta do określenia dawki pochłoniętej w wypadkach radiacyjnych, m.in. w Czarnobylu, Białymstoku czy w basenie rzeki Techa, a także u mieszkaoców Hiroszimy i Nagasaki.

Czułość metody szacuje się na 0,1 Gy

.

48

Bibliografia

Rozdział 1

[1] G J. Pan, ZY. Chang, HR. Schöler, D. Pei, Cell Research 12 (2002) 321‐329.

[2] HL. Persson, T. Kurz, JW. Eaton, UT. Brunk, Biochem J. 389 (2005) 877‐84.

[3] JD. Watson, FHC. Crick, Nature 171 (1953), 737‐738.

[4] http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml

Rozdział 2

[1] MM. Janiak, A. Wójcik, Medycyna zagrożeń i urazów radiacyjnych, Wydawnictwo Lekarskie PZWL,2004.

[2] MH. Bourguignon, PA. Gisone, MR. Perez, S. Michelin, D. Dubner, M. Di Giorgio, ED. Carosella, Eur.J. Nucl.

Med. Mol. Imaging. 32 (2005) 351‐368.

[3] JJ. Broerse, T MacVittle (eds), Response of Different Species to High Dose Total‐Body Irradiation,Maretinus Nijhoff, Amsterdam 1984.

[4]. TE. Wheldon, AS. Michalowski, J. Kirk, Br. J. Radiol. 55 (1982) 759‐766.

[5] 1990 ICRP Recommendations of the International Commission on Radiological Protection, ICRP Publication 60, Ann. ICRP 21/1‐3. Pergamon Press, Oxford, 1991.

[6] TM. Pawlik, K.Keyomarsi, Int J Radiat Oncol Biol Phys. 59 (2004) 928‐42.

[7] EJ. Hall, AJ. Giaccia, Radiobiology for the radiobiologist, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2006.

Rozdział 3

[1] HE. Poulsen, H. Prieme, S.Loft, Eur. J. Cancer Prev. 7 (1998) 9‐16.

[2] JF. Ward, WF. Blakely, EI.Joner, Radiat Res. 103 (1985) 383‐92.

[3] SS.Wallace, Radiat Res. 150 (19985) S60‐79.

[4] MA. Siddiqi, E. Bothe, Radiat Res. 112 (1987 ) 449‐63.

[5] Guidance on Potassium Iodide as a Thyroid Blocking Agent in Radiation Emergencies, Food andDrug Administration, Washington, 2001, http://www.fda.gov/cder/guidance/4825fnl.pdf

[6] World Health Organization Guidelines for Iodine Prophylaxis following Nuclear Accidents:

Update1999, WHO, Geneva, 1999,

http://www.who.int/ionizing_radiation/pub_meet/Iodine_Prophylaxis_guide.pdf

[7] Toxicological profile for uranium. U.S. Department of Health and Human Services. Public HealthService.

Agency for Toxic Substances and Disease Registry. (1999} Atlanta, USA.

[8] VF. Khokhryakov, AP. Belyaev, TI. Kudryavtseva, AE. Schadilov, GS. Moroz, VA. Shalaginov, Radiat.Prot.

Dosimetry 105 (2003) 499‐502.

[9] Guidance on Radiation Received in Space Activities, NCRP Report No. 98, 1989

[10] JK. Waselenko, TJ. MacVittie, WF. Blakely, N. Pesik, AL. Wiley, WE. Dickerson, H. Tsu, DL. Confer,N.

Coleman, T. Seed, P. Lowry, JO. Armitage, N. Dainiak, Ann. Intern. Med. 140 (2004) 1037‐1051.

[11] EA. Bump, K. Malaker, Radioprotectors: Chemical, Biological, and Clinical Perspectives, CRC Press, New York, 1997

Rozdział 4

[1] EJ. Hall, AJ. Giaccia, Radiobiology for the radiobiologist, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2006.

[2] H. Nagasawa, JB. Little, Cancer Res., 52 (1992) 6394‐6396.

[3] EA. Bump, K. Malaker, Radioprotectors: Chemical, Biological, and Clinical Perspectives, CRC Press, New York, 1997.

[4] CKK. Nair, DK. Parida, T. Nomura, J. Radiat. Res., 42 (2001) 21–37.

[5] ICRP 103. International Commission on Radiological Protection. The 2007 Recommendations ofthe International Commission on Radiological Protection, Publication 103, Ann. ICRP 37. ElsevierScience, Oxford, 2007.

[6] UNSCEAR 2000. Sources and Effects of Ionizing Radiation. Report to the General Assembly, withscientific annexes. United Nations, New York, 2000.

[7] ICRP 60. International Commission on Radiological Protection. 1990 Recommendation of the

International Commission on Radiological Protection. Publication 60. Ann. ICRP, 21/1‐3, PergamonPress, Oxford, 1991.

W dokumencie BIOLOGICZNE SKUTKI PROMIENIOWANIA JONIZUJĄCEGO (Stron 43-49)