POPULATION STUDY OF FOUR X-CHROMOSOMAL STR LOCI FROM THE NORTHERN PART OF POLAND

W dokumencie Annales Academiae Medicae Stetinensis = Roczniki Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie. 2007, 53, Supl. 2 (Stron 172-177)

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej Akademii Medycznej w Gdańsku ul. Dębowa 23, 80-204 Gdańsk

Kierownik: dr hab. n. med. Zbigniew Jankowski

Summary

Introduction, materials and methods: The allele fre-quencies of four short tandem repeats (STR) loci spe-cific to the human X chromosome (DXS101, DXS7423, DXS8377 and phosphoribosyltransferase HPRTB) were analyzed by means of a multiplex PCR reaction in a sam-ple of 200 unrelated individuals residing in the northern part of Poland. The separation and detection of PCR products were performed by capillary electrophoresis on the 3130 Genetic Analyzer. Testing for Hardy–Wein-berg equilibrium (HWe) showed no significant deviation for these loci.

Results: Statistical parameters such as: heterozygosity observed, mean exclusion chance, power of discrimination in males and power of discrimination in females showed that the examined multiplex is useful in forensic and paternity testing applications.

K e y w o r d s: multiplex PcR – population database of four X-STR loci – forensic genetics.

Streszczenie

Wstęp: W pracy przedstawiono dane populacyjne w za-kresie mikrosatelitarnych loci sprzężonych z chromoso-mem X: 2 markery o trójnukleotydowych powtórzeniach:

DXS101 i DXS8377 oraz 2 o czteronukleotydowych powtó-rzeniach: HPRTB i DXS7423.

Materiał i metody: Materiał biologiczny stanowiła pełna krew lub wymazy z jamy ustnej, pochodzące od 200

nie-spokrewnionych osób (kobiet i mężczyzn) z obszaru Polski północnej. Izolację DNA i pomiar jego stężenia przepro-wadzono opisanymi uprzednio metodami.

Reakcję kompleksowego PcR przeprowadzono przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych starterów (5-FAM i 5-JOe), o sekwencjach dostępnych w bazie danych (www. chx-str.org, www.gdb.org) i w piśmiennictwie. Roz-dział i detekcję produktów amplifikacji prowadzono drogą elektroforezy kapilarnej na automatycznym sekwenatorze 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Jako stan-dardu wewnętrznego użyto GeneScan-500 ROX. częstość alleli każdego locus obliczano oddzielnie dla kobiet i dla mężczyzn. Drogą sekwencjonowania skonstruowano dra-binę alleli oraz przedstawiono propozycję ich nazewnictwa zgodnie z wytycznymi komisji ISFH.

Wyniki: Uzyskane wyniki opracowano statystycznie, obliczając: heterozygotyczność obserwowaną, siłę dys-kryminacji u kobiet i u mężczyzn oraz teoretyczną szansę wykluczenia. Parametry statystyczne wskazują na dużą przydatność wymienionego multipleksu do badań gene-tycznych w medycynie sądowej.

H a s ł a: hemogenetyka – X-STR – polimorfizm.

Wstęp

Oznaczanie polimorficznych loci X-STR stanowi jedną z nowszych metod analizy genetycznej stosowanej w me-dycynie sądowej, szczególnie wówczas, gdy markery au-tosomalne nie dostarczają jednoznacznych wyników dla ustalenia pokrewieństwa.

BADANIe POLIMORFIZMU 4 LOcI STR cHROMOSOMU X W POPULAcJI POLSKI PÓŁNOcNeJ 171 W takich przypadkach badania wymagają poszerzenia

zakresu analizowanych markerów o dodatkowe polimorficz-ne loci, m.in. sprzężopolimorficz-ne z chromosomem X. Jednocześnie zastosowanie nowych markerów genetycznych w praktyce sądowo-medycznej wymaga opracowania baz danych popula-cyjnych zawierających częstości alleli oraz ustalenia parame-trów statystycznych oceniających ich przydatność w praktyce.

W oparciu o przeprowadzone badania opracowano własną bazę populacyjną i przeprowadzono analizę statystyczną.

Materiał i metody

Badaniu poddano DNA 200 dorosłych niespokrew-nionych mieszkańców Polski północnej (100 kobiet i 100 mężczyzn). Do izolacji wykorzystano krew oraz wymazy z jamy ustnej pobrane w Zakładzie Medycyny Sądowej Akademii Medycznej w Gdańsku do rutynowych badań w dochodzeniu ojcostwa oraz w sprawach identyfikacyjnych.

Zastosowano komercyjny zestaw do izolacji genomowego DNA z materiału biologicznego „Sherlock AX” (A&A Bio-technology) oraz metodę nieenzymatycznej ekstrakcji [1].

Ilość DNA oceniano metodą spektrofotometryczną.

Reakcję PcR przeprowadzono przy użyciu termocyc-lera GeneAmp® PcR System 9700 (Apptermocyc-lera, USA). Mie-szanina reakcyjna o całkowitej objętości 25 µL zawierała:

10–30 ng genomowego DNA, fluorescencyjnie znakowane startery o odpowiednich sekwencjach i stężeniu (tab. 1), 1,5 mM MgCl2, 5 nmol dNTP, 2U termostabilnej polimerazy AmpliTaq Gold™ (Applera, USA).

Amplifikację prowadzono w następujących warun-kach:

10 min – wstępna denaturacja w 94ºc;

– 8 cykli: denaturacja 1 min w 94ºc, przyłączanie (hybrydyzacja) 1 min w 62–59ºc (temp. zmniejsza się o 1ºc – na każde dwa cykle), wydłużanie (elongacja) 1 min w 72ºc;

24 cykli: denaturacja 1 min w 94ºc, przyłączanie (hybrydyzacja) 1 min w 58ºc, wydłużanie (elongacja) 1 min – w 72ºc, końcowe wydłużanie (elongacja) 30 min w 72ºc.

T a b e l a 1. Informacje o analizowanych loci T a b l e 1. Characteristics of multiplex PCR systems

Locus Rozdział i detekcję produktów amplifikacji prowadzono drogą elektroforezy kapilarnej na automatycznym sekwe-natorze 3130 Genetic Analyzer (Applera, USA), stosując polimer POP-4. Pozytywną kontrolę stanowiły komercyjne próbki o znanych allelach: K562 (Promega) i NA9947A (Applera, USA) [2]. Jako standard wewnętrzny wykorzy-stano DNA Size Standard GeneScan-500 ROX. Wyniki analizowano za pomocą programu GeneScan Analysis Software 3.7 (Applera, USA) oraz programu do obliczeń statystycznych PowerStats 1.2. Z badanych prób o wyróż-niającej się wielkości fragmentów, drogą sekwencjonowania [3] skonstruowano drabinę alleli oraz przedstawiono pro-pozycję ich nazewnictwa zgodnie z wytycznymi komisji ISFH [4] (ryc. 1).

Ryc. 1. elektroforegram drabiny alleli badanego multipleksu STR-X Fig. 1. Electrophoregrams of the allelic ladder investigated of multiplex

X-STR

Dokonano oceny rozkładu częstości alleli w badanej populacji. Dodatkowo obliczono wybrane parametry sta-tystyczne, takie jak: heterozygotyczność obserwowana, siłę dyskryminacji u kobiet i u mężczyzn oraz teoretyczną szansę wykluczenia [5, 6]. Porównano również rozkłady częstości alleli między badaną populacją a innymi euro-pejskimi populacjami.

172 LIDIA cYBULSKA, eWA KAPIŃSKA, JOANNA WYSOcKA, KRZYSZTOF RęBAŁA, ZOFIA SZcZeRKOWSKA T a b e l a 2. Rozkład częstości alleli dla 4 loci STR chromosomu X w badanej populacji z terenu Polski północnej (n = 200)

T a b l e 2. Allele frequencies for 4 X–chromosomal STR markers in northern Poland (n = 200)

DXS101 DXS7423 DXS8377 HPRTB

częstość alleli i parametry statystyczne obliczone w po-pulacji Polski północnej dla 4 mikrosatelitarnych markerów chromosomu X przedstawiono w tabeli 2. częstość alleli każdego locus obliczano oddzielnie dla kobiet i dla męż-czyzn. We wszystkich analizowanych loci nie stwierdzono

istotnych różnic statystycznych w rozkładach częstości alleli między grupami kobiet i mężczyzn (0,4 < p < 0,9).

Na rycinie 2 przedstawiono wyniki elektroforegramów w 2 przykładowych próbkach DNA kobiety i mężczyzny.

W analizowanym materiale, w żadnym locus nie obser-wowano przypadków mutacji.

BADANIe POLIMORFIZMU 4 LOcI STR cHROMOSOMU X W POPULAcJI POLSKI PÓŁNOcNeJ 173 miejsc genowych chromosomu X: 2 markerów o trójnu-kleotydowych powtórzeniach: DXS101 i DXS8377 oraz 2 o czteronukleotydowych jednostkach repetytywnych:

HPRTB i DXS7423.

Na podstawie uzyskanych wyników obliczono para-metry statystyczne i wykazano wysoką przydatność loci STR-X w medycynie sądowej zarówno w dochodzeniu ojcostwa, jak i w badaniach identyfikacyjnych, co przed-stawiono w tabeli 3.

Ryc. 2. elektroforegramy badanego multipleksu STR-X: (a) heterozygotyczna próbka DNA kobiety w: DXS101 (FAM), DXS7432 (JOE), DXS8377 (JOE) i HPRTB (JOE); (b) hemizygotyczna próbka DNA mężczyzny w: DXS101 (FAM), DXS7432 (JOE), DXS8377 (JOE)

i HPRTB (JOE)

Fig. 2. electrophoregrams of the multiplex assays: (a) heterozygotic female with the STRs DXS101 (FAM), DXS7432 (JOE), DXS8377 (JOE) and HPRTB (JOe); (b) hemizygotic male for DXS101 (FAM), DXS7432 (JOE),

DXS8377 (JOE) and HPRTB (JOE)

Dyskusja

W pracy zastosowano stosunkowo prostą metodę równo-czesnego określenia alleli 4 loci chromosomu X. W praktyce laboratoryjnej dostępne są komercyjne zestawy dla kom-pleksowej reakcji PCR kilku loci tego chromosomu. Autorzy niniejszej pracy w typowaniu alleli STR-X, w oparciu o dane z piśmiennictwa [7, 8, 9, 10], sporządzili własny zestaw umożliwiający jednoczesną amplifikację interesujących

T a b e l a 3. Parametry statystyczne charakteryzujące badany multipleks

T a b l e 3. Statistical parameters of investigated multiplex

Locus Ho PDF PDM MEC HO – heterozygotyczność obserwowana / observed heterozygosity; PDF

– siła dyskryminacji u kobiet / power of discriminating females; PDM siła dyskryminacji u mężczyzn / power of discriminating males; Mec – teoretyczna szansa wykluczenia / theoretical chance of exclusion

Powyższe parametry, a szczególnie wysoka wartość siły dyskryminacji, mieszcząca się w granicach 0,684–0,981, a także wysoki stopień heterozygotyczności: 0,720–0,930, wskazują na dużą przydatność badanych loci w praktyce laboratoryjnej.

Wnioski

W oparciu o wyniki badań sformułowano następujące wnioski:

Zastosowana w pracy metoda kompleksowej re-akcji PcR wykazała korzystne zróżnicowanie w zakresie 1.

4 mikrosatelitarnych markerów chromosomu X.

Analizowana populacja pozostaje w równowadze z prawem Hardy–Weinberga, w żadnym loci nie wykryto 2.

mutacji.

Wykazane częstości alleli poszczególnych loci nie odbiegają od wykazanych w innych populacjach europej-3.

skich.

Obliczone parametry statystyczne wskazują na przy-datność zastosowanego multipleksu w praktyce sądowej, 4.

szczególnie wówczas, gdy markery autosomalne nie do-starczają jednoznacznych informacji w ustaleniu pokre-wieństwa.

Piśmiennictwo

Lahiri D.K., Bye S., Nurnberg J.I., Hodes M.E., Crisp M.

1. : A non-organic

and non-enzymatic extraction method gives higher yields of genomic DNA from whole-blood samples than do nine other methods tested.

J. Biochem. Biophys. Methods, 1992, 25, 193–205.

Szibor R., Edelmann J., Hering S., Plate I., Wittig H., Roewer L. et al.

2. :

cell line DNA typing in forensic genetics – the necessity of reliable standards. Forensic Sci. Int. 2003, 138, 37–43.

a)

b)

174 LIDIA cYBULSKA, eWA KAPIŃSKA, JOANNA WYSOcKA, KRZYSZTOF RęBAŁA, ZOFIA SZcZeRKOWSKA Rębała K., Szczerkowska Z.

3. : Identyfikacja bardzo krótkiego allela

YcAII w populacji północnej Polski. Arch. Med. Sądowej Kryminol.

2004, 54, 17–24.

Lincoln P.J.

4. : DNA recommendations – further report of the DNA com-mission of the ISFH regarding the use of short tandem repeat systems.

Forensic Sci. Int. 1997, 87, 181–184.

Desmarais D., Zhong Y., Chakraborty R., Perreault C., Busque L.

5. :

Development of a highly polymorphic STR marker for identity testing purposes at the human androgen receptor gene (HUMARA). J. Forensic Sci. 1998, 43, 1046–1049.

Szibor R., Krawczak M., Hering S., Edelman J., Kuhlisch E., Krause D.

6. :

Use of X-linked markers for forensic purposes. Int. J. Legal Med. 2003, 117, 67–74.

Toni Ch., Presciuttini S., Spinetti I., Domenici R.

7. : Population data of

four X-chromosome markers in Tuscany, and their use in a deficiency paternity case. Forensic Sci. Int. 2003, 137, 215–216.

Zarrabeitia M.T., Amigo T., Sanudo C., Zarrabeitia A., Gonzalez-La-8.

muno D., Rancho J.A.: A new pentaplex system to study short tandem repeat marker of forensic interest on X chromosome. Forensic Sci.

Int. 2002, 129, 85–89.

Edelman J., Szibor R.

9. : DXS101: a highly polymorphic X-linked STR.

Int. J. Legal Med. 2001, 114, 301–304.

Edelmann J., Deichsel D., Hering S., Plate I., Szibor R.

10. : Sequence

variation and allele nomenclature for the X-linked STRs DXS9895, DXS8378, DXS7132, DXS6800, DXS7133, GATA172D05, DXS7423 and DXS8377. Forensic Sci. Int. 2002, 129, 99–100.

Komentarz

Przedstawiona praca należy do klasycznych opracowań metodyczno-epidemioloigicznych, charakterystycznych dla współczesnej hemogenetyki. Autorzy podjęli próbę oceny częstości występowania alleli 4 loci STR specyficznych dla ludzkiego chromosomu X w badaniach populacyjnych dla ludności Polski północnej. Przedstawiono własną modyfi-kację metody amplifikacji oraz przygotowano bazę dancyh dotyczących badanych parametrów. Jednakże, jak się wydaje, dane oparte o badania 200 pacjentów są niewystarczające dla szerszego wnioskowania.

dr hab. n. med. Krzysztof Borowiak

A N N A L E S A C A D E M I A E M E D I C A E S T E T I N E N S I S

R O C Z N I K I P O M O R S K I E J A K A D E M I I M E D Y C Z N E J W S Z C Z E C I N I E 2007, 53, SUPPL. 2, 175–178

TOMASZ JANUS, KRZYSZTOF BOROWIAK, BARBARA POTOCKA-BANAŚ

BIOCHEMICZNY PROFIL ŁOJOWO-POTOWY SKÓRY

W dokumencie Annales Academiae Medicae Stetinensis = Roczniki Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie. 2007, 53, Supl. 2 (Stron 172-177)

Outline

Related documents