Uzyskane wyniki analizy flawonoidów

Roztwory były analizowane przy zastosowaniu ujemnej polaryzacji w kilku trybach monitorowania: skanowania, monitorowania wybranych jonów (SIM), rejestrowania jonów potomnych (PI), rejestrowania jonów macierzystych (MI), śledzenia jonów tracących fragmenty obojętne o stałej masie (NL) oraz monitorowania reakcji metastabilnych (MRM).

Na chromatogramie zarejestrowanym w trybie skanowania zaobserwowano cztery piki, których czasy retencji odpowiadały czterem flawonoidom występującym w badanej mieszaninie (rysunek 12).

Rysunek 12. Chromatogramy zarejestrowane w trybie skanowania dla mieszaniny flawonoidów: a) chromatogram całkowitego prądu jonowego (TIC), (b-e) chromatogramy pików głównych odtworzone dla wybranych jonów (o m/z 315, 301, 285 i 269)

Intensywność, cpsx105Intensywność, cpsx105

5

TIC

2 BPC 315

5 BPC 301

Intensywność, cpsx105Intensywność, cpsx104

min

Intensywność, cpsx105Intensywność, cpsx105

5

TIC

2 BPC 315

5 BPC 301

Intensywność, cpsx105Intensywność, cpsx104

min

Intensywność, cpsx105Intensywność, cpsx104

min

Na podstawie widm mas odtworzonych dla obserwowanych sygnałów jonów pseudocząsteczkowych [M-H]^- odpowiadających poszczególnym substancjom stwierdzono, że:

 pik A o czasie retencji 13,7 min świadczy o obecności fizetyny (m/z 285, [M-H]^- ),

 pik B – 14,9 min odpowiada kwercetynie (m/z 301, [M-H]^-),

 pik C – o czasie retencji 17,1 min odpowiada genisteinie (m/z 269, [M-H]^-),

 pik D – 18,1 min zarejestrowano dla izoramnetyny (m/z 315, [M-H]^-).

Obecność poszczególnych pików obserwowano jednocześnie na chromatogramach odtworzonych dla każdego z wymienionych jonów (rysunek 12 b-e).

W następnym etapie analizę prowadzono z zastosowaniem trybu monitorowania wybranych jonów (SIM), uwzględniając jedynie jony pseudocząsteczkowe poszczególnych związków. Tak jak poprzednio na chromatogramie zarejestrowano cztery piki (rysunek 13), niemniej jednak tryb ten pozwolił na obniżenie linii bazowej w wyniku ograniczenia liczby rejestrowanych jonów i wyeliminowania powstających na skutek jonizacji składników matrycy.

Rysunek 13. Chromatogram całkowitego prądu jonowego otrzymany dla mieszaniny flawonoidów zarejestrowany w trybie monitorowania wybranych jonów

Kolejnym trybem stosowanym podczas rejestracji chromatogramów był tryb monitorowania jonów potomnych (rysunek 14), w którym obserwowano jony powstałe w wyniku fragmentacji jonów macierzystych jonów pseudocząsteczkowych badanych flawonoidów (o m/z 269, 285, 301, 315). Na otrzymanych widmach mas obserwowano od

0,5 2,5 4,5

TIC

5 10 15 min

Intensywność, cpsx105

A B

C

D

0,5 2,5 4,5

TIC

5 10 15 min

Intensywność, cpsx105

A B

C

D

107, 135 czy 151 występowały jednocześnie na dwóch bądź trzech widmach, podczas gdy inne były charakterystyczne dla określonych związków, np. jon o m/z 271 i 300 dla izoramnetyny, a m/z 133 dla genisteiny.

Rysunek 14. Chromatogram otrzymany dla mieszaniny flawonoidów zarejestrowany w trybie monitorowania jonów potomnych, powstałych dla jonów macierzystych o m/z 269, 285, 301 i 315; a) chromatogram całkowitego prądu jonowego, b) chromatogram pików głównych

0,3 0,6 0,9

1 3 5 Intensywność, cpsx105Intensywność, cpsx103

a)

b)

5 10 15 min

5 10 15 min

TIC

BPC

A B

C

D 0,3

0,6 0,9

1 3 5 Intensywność, cpsx105Intensywność, cpsx103

a)

b)

5 10 15 min

5 10 15 min

TIC

BPC

A B

C

D

Rysunek 15. Widma mas jonów potomnych otrzymane dla jonów macierzystych o m/z: a) 315, b) 301, c) 285

62,9 63,2 120,1 136,0 162,9 163,9 242,9 282 ,9270,9 299,9 315,0

0

62,9 83,0 93,1 107,1 301,0

121,0108,0

63,1 107,0 159,0 268,9

223,0

60 100 140 180 220 260 m/z

269  **

Intensywność% 65 91,1 134,9 182,9

100

62,9 63,2 120,1 136,0 162,9 163,9 242,9 282 ,9270,9 299,9 315,0

0

62,9 83,0 93,1 107,1 301,0

121,0108,0

63,1 107,0 159,0 268,9

223,0

60 100 140 180 220 260 m/z

269  **

Intensywność% 65 91,1 134,9 182,9

100

Chromatogramy zarejestrowane w trybie jonów potomnych dostarczają różnego typu informacji. Dzięki temu chromatogramy te mogą być odtwarzane na wiele sposobów, obrazując zmiany w występowaniu różnych jonów macierzystych bądź potomnych w funkcji czasu retencji. Przykładem może być izoramnetyna, dla której jonu macierzystego o m/z 315 obserwowano pik przy tR 18,1 min (rysunek 16a). Ten sam pik obserwowano na chromatogramie odtworzonym dla określonej ścieżki fragmentacji, a mianowicie dla jonu potomnego o m/z 151 powstałego w wyniku rozpadu jonu macierzystego o m/z 315 (rysunek 16b). Jednocześnie występowanie jonu potomnego o m/z 151 było obserwowane również przy czasach retencji piku B i C, a więc powstawał on na skutek rozpadu innych jonów macierzystych (rysunek 16c) w przeciwieństwie do jonu potomnego o m/z 300, który był charakterystyczny dla piku D (rysunek 16d).

Rysunek 16. Chromatogramy odtworzone dla a) jonu macierzystego o m/z 315, b) jonu potomnego o m/z 151 powstałego z fragmentacji jonu o m/z 315, c) jonu potomnego o m/z 151, d) jonu potomnego o m/z 300

W trybie monitorowania jonów macierzystych na chromatogramie zarejestrowano te piki, których jony macierzyste rozpadły się z utworzeniem określonych jonów potomnych, tj.

jonów o m/z 107, 121, 133 i 151 (rysunek 17). Na chromatogramach odtworzonych dla Intensywność, cpsx103Intensywność, cpsx103Intensywność, cpsx102

min Intensywność, cpsx103Intensywność, cpsx103Intensywność, cpsx102

min

jednego ze związków, a mianowicie genisteiny (pik C, t_R 17,1 min), podczas gdy pozostałe w różnym stopniu powstawały na skutek fragmentacji jonów macierzystych dwóch bądź więcej flawonoidów.

Rysunek 17. Chromatogramy zarejestrowane w trybie monitorowania jonów macierzystych fragmentujących do jonów potomnych o m/z 107, 121, 133 oraz 151: a) chromatogram pików głównych, (b-e) chromatogramy odtworzone dla kolejnych jonów potomnych

Kolejnym trybem monitorowana był tryb śledzenia jonów tracących fragmenty obojętne o stałej masie. Wyboru traconych fragmentów dokonano w oparciu o wcześniej otrzymane widma jonów potomnych. Wśród nich znalazły się zarówno masy małe (15, 18, 28, 30, 42 Da), jak i większe (150, 164, 208 Da). Utratę fragmentów obojętnych o masach od 18 do 42 Da obserwowano jedynie w przypadku genisteiny (rysunek 18), natomiast oderwanie fragmentu o masie 15 Da obserwowano dla izoramnetyny, która również traci cząstki o

Intensywność, cpsx103Intensywność, cpsx102Intensywność, cpsx103Intensywność, cpsx103

BPC

Intensywność, cpsx103Intensywność, cpsx102Intensywność, cpsx103Intensywność, cpsx103

BPC

Intensywność, cpsx103Intensywność, cpsx102Intensywność, cpsx103Intensywność, cpsx103

BPC

Rysunek 18. Chromatogramy zarejestrowane przy traconych fragmentach obojętnych w trybie monitorowania jonów tracących fragmenty obojętne o stałej masie

Rysunek 19. Chromatogramy zarejestrowane w trybie monitorowania utraty fragmentów obojętnych o stałej masie: a) chromatogram pików głównych oraz (b-e) chromatogramy odtworzone dla traconych fragmentów o masach 15, 150, 164 i 208 Da.

Intensywność, cpsx102Intensywność, cpsx102Intensywność, cpsx102Intensywność, cpsx102Intensywność, cpsx102

A

Intensywność, cpsx102Intensywność, cpsx102Intensywność, cpsx102Intensywność, cpsx102Intensywność, cpsx102

A

Fragmentacje wybranych flawonoidów obserwowano również w trybie monitrowania reakcji metastabilnych (MRM). Optymalne napięcie fragmentatora dla jonów macierzystych, jak i wartości m/z obserwowanych jonów potomnych i odpowiadające im energie kolizji określono za pomocą programu Mass Hunter Optimizer. W tym celu próbkę wprowadzono do spektrometru mas w sposób bezpośredni, z pominięciem etapu rozdzielania. Korzystając z czterech pomiarów program dobrał kolejno: optymalne napięcie fragmentatora dla wskazanych jonów macierzystych, najbardziej intensywne jony potomne i ustalił dla nich optymalną energię kolizji.

Rysunek 20. Chromatogramy zarejestrowane w trybie monitorowania reakcji metastabilnych (MRM)

Analizy prowadzono również w trybie dynamicznym MRM, gdzie rejestracja poszczególnych jonów następowała w ściśle określonych przedziałach czasowych ustalonych na podstawie czasów retencji związków, przez co nie obserwowano zmniejszenia się czułości.

Określono czułości analizy na przykładzie badanych związków, w tym celu wyznaczono wartości stosunku sygnału do szumu (S/N) pików obecnych na chromatogramach utworzonych dla poszczególnych jonów (tabela 7).

Tabela 7. Dane liczbowe (S/N) dla wybranych trybów monitorowania

Jon, m/z SCN SIM MRM

315 (→ 300)* 44,1 48,2 58,2

301 (→ 107)* 23,5 26,6 55,2

285 (→ 163)* 23,7 43,5 49,1

269 (→ 133)* 38,7 41,0 42,9

* reakcje następcze w trybie MRM 0

1 2

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 min

Intensywność, cpsx104

0 1 2

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 min

Intensywność, cpsx104