Oznaczanie białka w nasionach rzepaku – porównanie metody odbiciowej i transmisyjnej.

Krzysztof Michalski

Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Oddział w Poznaniu

Oznaczanie białka w nasionach rzepaku

– porównanie metody odbiciowej i transmisyjnej

Measurement of protein content in oilseed rape seeds

– comparison of reflectance and transmittance methods

W pracach hodowlanych nad rzepakiem istnieje potrzeba szybkiego oznaczania zawartości różnych składników chemicznych w nasionach, w tym również białka. Oznaczanie białka metodami chemicznymi jest kosztowne i czasochłonne. Alternatywą może być spektrometria w bliskiej pod-czerwieni. Do oznaczania można stosować dwie wersje tej metody, tj. pomiar w świetle przecho-dzącym i odbitym. Podjęto próbę porównania wyników otrzymanych za pomocą obu wersji metody. Otrzymane wyniki wskazują, iż kalibracja w świetle odbitym daje nieco lepsze wyniki (SEP = 0,609) niż test na tych samych danych w świetle przechodzącym (SEP = 0,628), niemniej obie metody są w stanie dawać odczyty ze zbliżoną dokładnością. Obie metody można stosować do celów badawczych, choć z uwagi na możliwość połączenia pomiaru białka z oznaczaniem zawartości glukozynolanów bardziej przydatna jest metoda odbiciowa.

Key words: near infrared, rapeseed, protein, NIR, NIT

In breeding works on rapeseed there is a need for fast seed analysis of different chemical compounds, including protein content. Wet analysis of protein is a time consuming and expensive procedure, an alternative method can be an instrumental analysis by NIR/NIT method. There are two versions of near infrared analysis: measurement of transmittance or reflectance. An attempt to compare both methods was made. Samples were measured on reflectance machine NIRS 6500 and on transmittance machine Infratec 1255. Calibration set consists of 170 seed samples (reflectance) and 264 seed samples (transmittance), validation set consists of 45 seed samples. Protein range was 17– 26% of mass. Obtained results show, that calibration method for transmittance gave slightly worse results (SEP = 0,628) than subsequent calibration for reflectance method (SEP = 0,609), but both methods were able to estimate protein content with similar accuracy although the calibration sets were different. For a bigger sample, better representative results were obtained by transmission method due to cuvette construction 5 independent subsamples in one measurement cycle).

Both methods can be used for research purposes, although in reflectance method protein measurement can be joined with glucosinolate calibration, and therefore this method is better suited for breeders’ expectations.

Wstęp

W pracach hodowlanych nad rzepakiem istnieje potrzeba szybkiego

ozna-czania zawartości różnych składników chemicznych w nasionach, w tym białka.

Oznaczanie białka metodami chemicznymi jest na dużą skalę kosztowne i

czaso-chłonne. Alternatywą są metody instrumentalne, a mianowicie spektrometria

w bliskiej podczerwieni. Do oznaczania można stosować dwie wersje tej metody,

tj. pomiar w świetle przechodzącym i odbitym. Pierwsze, wprowadzone w latach

60-tych aparaty pracowały w oparciu o technologię odbiciową opartą na

wykorzy-staniu koła filtrowego zawierającego od 3 do 20 flitów monochromatyzujących.

Z uwagi na niedostępność technologii komputerowej kalibracja aparatów była

żmud-nym zadaniem, a zastosowane rozwiązania techniczne mało doskonałe.

Upow-szechnienie mikrokomputerów oraz rozwój metod matematycznych polepszyły

sytuację, lecz dopiero upowszechnienie aparatów skanujących oraz wprowadzenie

obok technik odbiciowych także transmisyjnych spowodowało szerokie

zastoso-wanie bliskiej podczerwieni, zwłaszcza w przemyśle zbożowym i paszowym, jako

szybkiej i wygodnej metody analitycznej. Z uwagi na ograniczenia energetyczne

aparaty transmisyjne mogą pracować w zakresie tylko poniżej 1100 nm — jest to

zakres trzeciego nadtonu. Grubość kuwety zależy od wielkości ziarna i waha się od

3 cm dla kukurydzy do 6 mm dla rzepaku. Technologia odbiciowa obejmuje

szer-szy zakres widma — do 2500 nm. Penetracja promieniowania maleje wraz ze

wzros-tem długości fali i może wynieść poniżej 0,3 mm w zakresie powyżej 2000 nm.

Dla nasion o grubej okrywie nasiennej może to powodować konieczność mielenia,

aby otrzymać reprezentatywną próbkę. Zaletą jest natomiast znacznie szerszy

zakres widma, pozwalający mierzyć substancje takie jak glukozynolany, których

pomiar poniżej 1100 nm w transmisji nie jest możliwy. Białko jest jednym z

waż-nych składników nasion rzepaku i jego pomiar za pomocą bliskiej podczerwieni

jest od dawna stosowany i opisany w literaturze zarówno jako oznaczanie

pojedyn-czego składnika, jak i w powiązaniu z innymi składnikami (Tkaczuk 1981;

McGregor 1990; Michalski, Mroczyk 1992; Morgan, Starr 1983; Renard i in. 1987;

Panford i in. 1988). Pomiary prowadzono także w pojedynczych nasionach

(Velasco 2002). Dostępne prace nie sugerują jednoznacznie, która z metod jest

lepsza, dlatego podjęto próbę sprawdzenia zgodności obu metod na tym samym

zbiorze kalibracyjnym próbek nasion rzepaku.

Materiały i metody

Do badań użyto spektrometru odbiciowego NIRS 6500 pracującego w świetle

odbitym w zakresie widma 400–2500 nm i wyposażonego w moduł spinning

sample (w trakcie skanowania, pomiędzy pomiarami kuweta jest obracana o pewien

kąt, aby uzyskać uśrednione widmo) oraz spektrometru transmisyjnego Infratec

1255 pracującego w świetle przechodzącym w zakresie widma 700–1100 nm (taca

pomiarowa zawiera 5 kuwet, mierzonych kolejno w jednym cyklu pomiarowym,

po czym zebrane widma są uśredniane w celu otrzymania bardziej

reprezentatyw-nego widma)

Równania kalibracyjne obliczono za pomocą programu WINISI II (Foss)

z zastosowaniem metody globalnej, wykorzystując zbiór 170 próbek nasion do

kalibracji aparatu NIRSystems 6500 oraz 250 próbek nasion do kalibracji aparatu

Infratec 1255. Równania przetestowano na niezależnym zbiorze 45 próbek. Zakres

zmienności białka w zbiorze testowym wynosił od 17 do 26% masy wagowej nasion

Wszystkie próbki pochodziły z prac badawczych i hodowlanych Zakładu

Roślin Oleistych IHAR. Białko oznaczono chemicznie za pomocą metody Kjeldahla

(Polska Norma (1975) — PN-75/A-04018) w Laboratorium Biochemicznym IHAR.

Próbki użyte do kalibracji aparatów pochodziły ze zbioru w latach 1998–2003,

natomiast próbki tworzące zbiór sprawdzający wybrano ze zbioru roku 2003.

Wyniki

Obliczone parametry kalibracji dla Infratec 1255 i NIRS 6500 przedstawiono

w tabeli 1. Sprawdzenie kalibracji wykonane zostało za pomocą zbioru 45 próbek

zeskanowanych równolegle na NIRS 6500 oraz na Infratec 1255. Oba aparaty

różnią się typem otrzymywanych widm, dlatego istniała konieczność niezależnego

pomiaru), a otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 2.

Graficzne przedstawienie kalibracji i wyników sprawdzania przedstawiono na

rysunkach 1–2.

Otrzymane wyniki wskazują, iż kalibracja w świetle przechodzącym daje

nieco gorsze wyniki (SEP = 0,628), niż test na tych samych danych w świetle

odbitym (SEP = 0,609), niemniej obie metody są w stanie dawać odczyty ze

zbli-żoną dokładnością. Obie metody można stosować do celów badań przesiewowych

(screening). Wybrane na tej podstawie rośliny wymagają jednak potwierdzenia za

pomocą analiz chemicznych.

Tabela 1

Parametry kalibracji dla Infratec 1255 — metoda transmisyjna zakres widma 700–1100 nm

oraz NIRS 6500 — metoda odbiciowa zakres widma 400–2500 nm

Calibration parameters for Infratec 1255 — transmission method, spectra range 700–1100 nm

and NIRS 6500 — reflectance method, spectra range 400–2500 nm

Infratec 1255 NIRS 6500

Transformacja matematyczna

Math treatment 0, 0, 1, 1 1, 4, 4, 1

Liczba próbek — Number of samples 250 170

Zakres zbioru — Range 16,97–26,29% białka

ogólnego — raw protein ogólnego — raw protein 17,07–24,66% białka

Liczba PC — PC number 13 6

Błąd standardowy kalibracji

Standard error of calibration 0,446 0,414

Współczynnik korelacji kalibracji

Correlation coefficient 0,961 0,932

Błąd walidacji skrośnej

Crossvalidation error 0,501 0,455

Współczynnik korelacji walidacji skrośnej

Crossvalidation correlation coefficient 0,951 0,917

Tabela 2

Porównanie wyników sprawdzenia kalibracji na niezależnym zbiorze 45 próbek nasion rzepaku

Comparison of calibration validation results on independent 45 sample set of rapeseed

Aparat Machine

Zakres widma i metoda Spectra range, metod

Błąd pomiaru (SEP) Prediction error [%] NIRS 6500 400–2500 nm, odbiciowa — reflectance 0,609 Infratec 1255 700–1100 nm, transmisyjna — transmission 0,628

a

b

Slope — nachylenie

RSQ — współczynnik korelacji kalibracji — calibration correlation coefficient SECV — błąd walidacji skrośnej — validation error

SEC — błąd kalibracji — calibration error

1-VR — współczynnik korelacji walidacji skrośnej — validation correlation coefficient

Rys. 1. Graficzny wynik kalibracji białka dla Infratec 1255 (a) oraz NIRS 6500 (b) — Infratec 1255 (a) and NIRS 6500 (b) protein calibration plot

a

b

Slope — nachylenie BIAS — stała

RSQ — współczynnik korelacji kalibracji — calibration correlation coefficient SEP — błąd sprawdzania (walidacji) — prediction error

SEP(C) — błąd skorygowany — corrected prediction error

Rys. 2. Graficzny wynik pomiaru białka w 45 próbkach sprawdzających dla Infratec 1255 (a) oraz NIRS 6500 (b) — Infratec 1255 (a) and NIRS 6500 (b) validation plot for protein (independent 45 sample set)

Wnioski

• Mimo

iż równania kalibracyjne liczono na różniących się zbiorach

kalibra-cyjnych, otrzymane wyniki są zbliżone.

•

Błąd pomiaru SEP otrzymany dla pliku sprawdzającego jest minimalnie

lep-szy dla wyników zmierzonych za pomocą NIRS 6500, ale różnica ta nie jest

na tyle istotna, aby wskazać na jedną z metod jako faworyzowaną.

• Większa uniwersalność NIRS 6500 z uwagi na możliwość połączenia pomiaru

białka z oznaczaniem zawartości glukozynolanów powoduje, że bardziej

przydatna jest metoda odbiciowa.

• Jeśli zachodzi konieczność analizy większej próbki, to bardziej

reprezen-tatywny wynik daje metoda transmisyjna ze względu na konstrukcję kuwety

dającą pomiar w 5 niezależnych podpróbkach.

Literatura

McGregor D.I. 1990. Application of NIR to the analysis of oil, protein, chlorophyll, and glucosinolates in Canola / rapeseed. Canola Rapeseed, Shahidi, Fereidoon, 221-231.

Tkachuk R. 1981 Oil and protein analysis of whole rapeseed kernels by NIRS. Journal of the American Oil Chemists Society, 588: 819-822.

Michalski C.M., Mroczyk W.B. 1992. Protein, NDF, ADF, lysine and sulphur amino acids determination on rapeseed – NIR and NIT comparison. Near Infrared Spectroscopy: bridging the gap between data analysis and NIR applications. Eds. Hildrum, Isaksson, Nes, & Tandberg, Ellis Horwood, Chichester, UK, 259-264.

Morgan A.G., Starr C. 1983. A comparison of the use of milled and whole rapeseeds for the mesasurement of nitrogen and oil content by NIR. NIR analysis – how near infrared reflects composition, Ed. Murray, North of Scotland College of Agriculture, Aberdeen.

Renard M., Bernard C., Deschamps M., Furtoss V., Lila M., Quinsac A., Regnier J.M., Ribaillier D. 1987. Analysis of oil, protein, fibre and glucosinolates in whole rapeseed by NIR reflectance spectroscopy Proc. 7th Int. Rapeseed Cong., Poznań, Poland, 1547-1549.

Panford J.A., Williams P.C., deMan J.M. 1988. Analysis of oilseeds for protein, oil, fibre and moisture by NIRS. Journal of the American Oil Chemists Society, 6510: 1627-1634.

Panford J.A. 1988. Analysis of oilseeds for protein and oil by NIR reflectance spectroscopy. Methods for protein analysis, Eds. Cherry & Barford, Am. Oil Chemists Soc., Champaigne, 1-12.

Stevenson S.G., Williams P.C. 1978. The determination of protein, moisture and oil in diverse cereals, cereal products and oilseeds by NIRS. Cereal Foods World, 23: 462-463.

Starr C., Suttle J., Morgan A.G., Smith D.B. 1985. A comparison of sample preparation and calibration techniques for the estimation of nitrogen, oil and glucosinolate content of rapeseed by NIRS. Journal of Agricultural Science, Cambridge, 104: 317-323.

Velasco L., Möllers C. 2002. Nondestructive assessment of protein content in single seeds of rapeseed Brassica napus L.) by near-infrared reflectance spectroscopy. Euphytica, 123: 89-93.

Polska Norma. 1975. PN-75/A-04018. Produkty rolniczo-żywnościowe. Oznaczanie azotu metodą Kjeldahla i przeliczanie na białko.