[2007/Nr 2] Próba zastosowania wysokich ciśnień hydrostatycznych (UHP) do dekontaminacji mięsa zarażonego larwami włośnia (Trichinella spiralis)

Irena Kłoczko, Tadeusz Chudoba

PRO

´

BA ZASTOSOWANIA WYSOKICH CIS

´NIEN

´

HYDROSTATYCZNYCH (UHP) DO DEKONTAMINACJI MIE˛SA

ZARAZ

˙ONEGO LARWAMI WŁOS

´NIA (TRICHINELLA SPIRALIS)

Katedra Z

˙

´

1)_{Instytut Wysokich Cis´nien´ Polskiej Akademii Nauk w Warszawie} Kierownik: doc. Witold Łojkowski

Pro´bki mie˛sa zainfekowanego larwami włos´nia poddawano działaniu cis´nienia hydro-statycznego 50 – 300 MPa przez 15 min. w temperaturze pokojowej. Badaniom mikro-skopowym poddawano larwy w normalnym otoczeniu tkanki mie˛snej, larwy wyizolowane z tkanki mie˛snej metoda˛ wytrawienia i preparaty histologiczne larw, barwione hemato-ksylina˛ i eozyna˛. Pełna˛ dekontaminacje˛ mie˛sa uzyskano przy cis´nieniu 200 i 300 MPa.

Hasła kluczowe: wysokie cis´nienia hydrostatyczne, Trichinella spiralis,

dekon-taminacja, larwy.

Key words: high hydrostatic pressures, Trichinella spiralis, decontamination,

larvae.

W krajach rozwinie˛tych coraz wie˛ksza˛ uwage˛ pos´wie˛ca sie˛ zagadnieniu

z˙ywno-s´ci bezpiecznej. Zagroz˙eniem dla z˙ywnoz˙ywno-s´ci bezpiecznej sa˛ wyste˛puja˛ce w niej

zanieczyszczenia, ws´ro´d kto´rych szczego´lne miejsce zajmuja˛ zanieczyszczenia

chemiczne i biologiczne. Te ostatnie sa˛ o tyle groz´niejsze, z˙e stopien´ zagroz˙enia

wynikaja˛cy ze spoz˙ycia danego produktu ros´nie wraz z czasem jego

przechowywa-nia.

Mo´wia˛c o czystos´ci biologicznej mamy przewaz˙nie na mys´li zanieczyszczenia

mikrobiologiczne – obecnos´c´ bakterii, ples´ni czy grzybo´w i metody ich zwalczania.

Znacznie mniej miejsca pos´wie˛ca sie˛ zagadnieniom bezpieczen´stwa

parazytologi-cznego.

Jedna˛ z najbardziej znanych choro´b pasoz˙ytniczych, przenoszonych droga˛

pokarmowa˛, jest włos´nica, spowodowana przedostaniem sie˛ do organizmu

ludz-kiego wie˛kszych ilos´ci z˙ywych larw włos´nia kre˛tego Trichinella spiralis. Z

´

ro´dłem

inwazji włos´ni dla człowieka jest gło´wnie zakaz˙one tym pasoz˙ytem mie˛so

wiep-rzowe, znacznie rzadziej mie˛so innych zwierza˛t (1).

Metoda˛ obrony przed zakaz˙eniem włos´nica˛ jest kontrola weterynaryjna kaz˙0

dego ubitego zwierze˛cia i eliminacja sztuk zakaz˙onych jako niezdatnych do

spoz˙ycia (2).

Włos´nica wywoływana jest pojawieniem sie˛ w organizmie człowieka larw

z˙ywych, zdolnych do rozwoju i rozmnaz˙ania, sta˛d eliminacja tego zagroz˙enia moz˙e

byc´ osia˛gnie˛ta poprzez pozbawienie z˙ywych, inwazyjnych form włos´ni (larw),

obecnych w mie˛sie, ich funkcji z˙yciowych, najlepiej przez zabicie.

Istnieje szereg metod niszczenia larw włos´ni takich, jak działanie wysokich

(

> 70°C) i niskich (– 12°C) temperatur (3, 4), napromieniowanie promieniami

elektromagnetycznymi z zakresu mikrofal, ultrafioletu czy gamma (5, 6, 7),

peklowanie za pomoca˛ mieszanek pekluja˛cych (8), przy czym efekt letalny kaz˙dego

z tych czynniko´w zalez˙y takz˙e od czasu jego działania.

Na przestrzeni ostatnich kilkunastu lat obserwuje sie˛ szybki rozwo´j badan´ nad

moz˙liwos´cia˛ sterylizacji s´rodko´w z˙ywnos´ciowych za pomoca˛ wysokich cis´nien´

hydrostatycznych (Ultra High Pressures – UHP, High Pressure Processing – HPP),

rze˛du 50 – 1000 MPa (9, 10). Skutecznos´c´ tych metod okazała sie˛ na tyle wysoka,

z˙e w chwili obecnej wiele produkto´w utrwalanych za pomoca˛ wysokich cis´nien´

znajduje sie˛ w ofercie rynkowej. Wraz z rozwojem badan´ podstawowych w tej

dziedzinie rozszerza sie˛ kra˛g produkto´w z˙ywnos´ciowych, nadaja˛cych sie˛ do

sterylizacji metodami wysokocis´nieniowymi, a takz˙e baza techniczna metod UHP

(wysokowydajne prasy hydrauliczne).

W badaniach dotycza˛cych skutko´w działania wysokich cis´nien´ na organizmy

z˙ywe wykazano, z˙e ich wpływ polega na denaturacji białek wskutek rozrywania

wia˛zan´ mie˛dzycza˛steczkowych i zmian konformacji samych cza˛steczek. W

rezul-tacie naste˛puje obumieranie tkanek i s´mierc´ organizmu.

Literatura naukowa zawiera co najmniej setki prac, pos´wie˛conych

wyjaławia-niu ro´z˙nych produkto´w z˙ywnos´ciowych, w tym roz˙nych rodzajo´w mie˛sa, metoda˛

UHP. Wykazano, z˙e zastosowanie tej metody nie tylko przedłuz˙a trwałos´c´

przechowalnicza˛ produkto´w, ale w odro´z˙nieniu od innych metod sterylizacji,

pozwala na zachowanie tak poz˙a˛danych cech s´wiez˙os´ci produktu, a nawet

po-prawia niekto´re cenne dla konsumenta cechy sensoryczne (np. kruchos´c´ mie˛sa).

Prace te dotycza˛ gło´wnie eliminacji zanieczyszczen´ mikrobiologicznych (11, 12,

13), przy prawie całkowitym braku zainteresowania moz˙liwos´cia˛ eliminacji

or-ganizmo´w pasoz˙ytniczych (14). To dało podstawe˛ do przeprowadzenia niz˙ej

opisanych badan´.

MATERIAŁ I METODYKA

M a t e r i a ł y d o b a d a n´. Tkanka mie˛s´niowa myszy zaraz˙onej larwami inwazyjnymi Trichinella

spiralis z hodowli Instytutu Parazytologii PAN. Mysz, samica szczepu SWISS, w wieku 12 tyg.

została zaraz˙ona doprzełykowo dawka˛ 500 larw włos´nia celem uzyskania otorbionych larw wewna˛trz jej tkanki mie˛s´niowej. Materiał pasoz˙ytniczy stanowiły larwy inwazyjne izolatu ludzkiego T. spiralis, oznaczonego przez włoski os´rodek referencyjny Instituto Superiore di Sanita w Rzymie jako MHOH/PO/88/ISS67(TI).

Mie˛so wieprzowe uz˙ywane do badan´ pochodziło z zakupo´w rynkowych.

P r z y g o t o w a n i e p r o´ b e k. Z us´pionej eterem myszy usunie˛to narza˛dy wewne˛trzne i sko´re˛. Z otrzymanej tuszki wypreparowano przepone˛, kto´ra˛ podzielono na 6 cze˛s´ci. Sama˛ tuszke˛ ro´wniez˙ podzielono na 6 cze˛s´ci (2 kon´czyny przednie, 2 kon´czyny tylne, tuło´w oraz głowa z szyja˛). Kaz˙da˛ cze˛s´c´ tuszki oraz 1 cze˛s´c´ przepony umieszczano wewna˛trz 150 – 200 g porcjach mie˛sa wieprzowego celem sprawdzenia, czy zastosowane cis´nienie działa skutecznie w głe˛bi tkanki mie˛s´niowej. Tak przygotowane pro´bki zamykano pro´z˙niowo w dwuwarstwowych opakowaniach z folii poliamidowo-polietylenowej (PAPE).

C i s´ n i e n i o w a n i e p r o´ b e k i p r z y g o t o w a n i e p r e p a r a t o´ w d o b a d a n´. Cis´nieniowa-nie pro´bek przeprowadzono w Centrum Badan´ Wysokocis´Cis´nieniowa-nieniowych PAN korzystaja˛c z prasy izostatycznej PI-400-100/300 (Radomski 1996 r.) w temperaturze pokojowej (20°C). Stosowano cis´nienia 50, 100, 150, 200 i 300 MPa. Pro´bke˛ kontrolna˛ stanowiła przygotowana w identyczny sposo´b pro´bka nie poddana cis´nieniowaniu.

Po rozpakowaniu pro´bek z cze˛s´ci zaraz˙onej tkanki mie˛s´niowej uwalniano larwy metoda˛ wytrawienia. Pozostała˛ cze˛s´c´ przepony umieszczano w buforowanej formalinie. Cze˛s´c´ przepony kaz˙dej z pro´bek podzielono na dwie cze˛s´ci, z kto´rych jedna˛ uz˙yto do obserwacji mikroskopowych larw in situ, z drugiej sporza˛dzono preparaty histologiczne.

W y t r a w i a n i e l a r w T . s p i r a l i s. Z pro´bek poddanych działaniu UHP i z pro´bki kontrolnej wyizolowano larwy włos´ni metoda˛ wytrawienia. Tkanke˛ mie˛s´niowa˛ pro´bki rozpuszczano w wodnym roztworze trawia˛cym, zawieraja˛cym 10 g pepsyny i 7 cm3_{ste˛z˙. (36%) kwasu solnego w 1000 cm}3_. Trawienie prowadzono przez 2 h w temp. 37°C przy cia˛głym mieszaniu mieszadłem magnetycznym. Larwy wydzielano przez sedymentacje˛ w cylindrach z woda˛ destylowana˛ i płukano kilkakrotnie w roztworze soli fizjologicznej.

W y k o n a n i e p r e p a r a t o´ w h i s t o l o g i c z n y c h. Wycinki przepony utrwalone w buforowa-nej formalinie płukano w wodzie biez˙a˛cej, odwadniano przez 2-krotne 30 min. moczenie w 96% etanolu, jednokrotne 30 min. moczenie w bezwodnym etanolu oraz 2-krotne 10 min. przetrzymanie w acetonie. Naste˛pnie poddano wycinki dwukrotnemu moczeniu (15 i 30 min.) w ksylenie i zatapiano, w 3-stopniowym procesie, w parafinie. Bloczki parafinowe krojono za pomoca˛ mikrotomu, otrzymane skrawki odparafinowano przez kilkakrotne spłukiwanie kolejno, ksylenem, 96% etanolem i woda˛ destylowana˛. Naste˛pnie barwiono preparaty hematoksylina˛ i eozyna˛, płukano woda˛ destylowana˛ i odwadniano przez kilkakrotne przemycie alkoholem i acetonem, po czym gotowe preparaty zamykano w balsamie kanadyjskim. W wyniku takiego procesu uzyskiwano fioletowo-niebieskie zabarwienie ja˛der komo´rkowych oraz ro´z˙owe zabarwienie komo´rek cytoplazmy i wło´kien mie˛s´niowych.

O b s e r w a c j e m i k r o s k o p o w e. Obserwacje mikroskopowe dla oceny procentu larw z˙ywych w badanych pro´bkach prowadzono przy powie˛kszeniu × 40. Procent larw z˙ywych w wytrawionych pro´bkach okres´lano przez zliczenie 100 larw w kilkunastu polach widzenia i obliczenie wartos´ci s´redniej dla kaz˙dej pro´bki.

WYNIKI I ICH OMO

´

Wyniki badan´ przedstawione w tab. I oraz przykładowo na fotografiach ryc. 1 – 8 wskazuja˛, z˙e działanie cis´nien´ hydrostatycznych do 150 MPa w temperaturze pokojowej w minimalnym stopniu wpływa na przez˙ywalnos´c´ larw włos´ni znajduja˛cych sie˛ w tkance mie˛snej (tab. I). Cze˛s´ciowy efekt letalny UHP zaobserwowali Ohnishi i wspo´łpr. (14) przy cis´nieniu 175 MPa. W naszych badaniach nie stwierdzono z˙adnych oznak z˙ycia ws´ro´d larw w pro´bkach poddanych działaniu cis´nien´ 200 i 300 MPa.

T a b e l a I

Wyniki badan´ przez˙ywalnos´ci larw Trichinella spiralis przy 15 min. działaniu ro´z˙nych cis´nien´ w temp. 20°C T a b l e I

Survival of Trichinella spiralis larvae exposed to various pressures for 15 minutes at 20°C

Cis´nienie (MPa) Larwy z˙ywe (%) Larwy martwe (%)

kontrola 97 3 50 93 7 100 90 10 150 91 9 200 0 100 300 0 100

Ryc. 1. Larwy Trichinella spiralis uzyskane metoda˛ wytrawiania z tkanki mie˛s´niowej nie poddanej działaniu cis´nienia (pow.× 125).

Fig. 1. Trichinella spiralis larvae isolated from non-pressurised (control) meat tissue (× 125 magnificvation).

Ryc. 2. Larwy Trichinella spiralis uzyskane metoda˛ wytrawiania z tkanki mie˛s´niowej poddanej działaniu cis´nienia 50 MPa (pow.× 125).

Fig. 2. Trichinella spiralis larvae isolated from meat tissue pressurised at 50 MPa (× 125 magnification).

Larwy wyizolowane z tkanki mie˛s´niowej pro´bki kontrolnej posiadały normalny wygla˛d, były aktywne i silnie zwinie˛te (ryc. 1). Larwy z pro´bki poddanej cis´nieniu 50 MPa były wcia˛z˙ aktywne, ale mniej zwinie˛te, niz˙ larwy z pro´bki kontrolnej (ryc. 2). Larwy z pro´bki cis´nieniowanej przy 100 MPa (ryc. 3) miały wygla˛d zbliz˙ony do wygla˛du larw z pro´bki traktowanej cis´nieniem 50 MPa. Były moc-niej zwinie˛te, niz˙ te ostatnie, ale mmoc-niej zwinie˛te, niz˙ larwy z pro´bki kontrolnej. Larwy poddane działaniu cis´nienia 150 MPa wykazywały nienaturalna˛ nadskre˛tnos´c´. Ciało wie˛kszos´ci larw miało

Ryc. 3. Larwy Trichinella spiralis uzyskane metoda˛ wytrawiania z tkanki mie˛s´niowej poddanej działaniu cis´nienia 100 MPa (pow.× 125).

Fig. 3. Trichinella spiralis larvae isolated from meat tissue pressurised at 100 MPa (× 125 magnification).

Ryc. 4. Larwy Trichinella spiralis uzyskane metoda˛ wytrawiania z tkanki mie˛s´niowej poddanej działaniu cis´nienia 150 MPa (pow.× 125).

Fig. 4. Trichinella spiralis larvae isolated from meat tissue pressurised at 150 MPa (× 125 magnification).

kształt spirali złoz˙onej z 4 zwojo´w (ryc. 4). Zwie˛kszenie cis´nienia do 200 MPa (ryc. 5) spowodowało wyraz´na˛ zmiane˛ kształtu ciała larw. Cze˛s´c´ larw uległa wyprostowaniu do kształtu przypominaja˛cego cyfre˛ „6”, pozostałe były zwinie˛te, podobnie jak w pro´bce kontrolnej. Podobne kształty zachowały larwy z pro´bki poddanej działaniu cis´nienia 300 MPa (ryc. 6).

Badania mikroskopowe larw in situ w mie˛s´niach przepony wykazały, z˙e ich wygla˛d nie zalez˙ał od wysokos´ci zastosowanego cis´nienia. Otorbione larwy zachowały charakterystyczny, spiralny kształt, podobny do kształtu larw pro´bki kontrolnej. Dobrze zachowane narza˛dy wewne˛trzne larw stwierdzono ro´wniez˙ w pro´bce tkanki mie˛s´niowej poddanej działaniu cis´nienia 50, 100 i 150 Mpa. W tym ostatnim przypadku woko´ł larw poddanych cis´nieniowaniu widoczne były nacieki komo´rek limfocytopodobnych.

Ryc. 5. Larwy Trichinella spiralis uzyskane metoda˛ wytrawiania z tkanki mie˛s´niowej poddanej działaniu cis´nienia 200 MPa (pow.× 125).

Fig. 5. Trichinella spiralis larvae isolated from meat tissue pressurised at 200 MPa (× 125 magnification).

Ryc. 6. Larwy Trichinella spiralis uzyskane metoda˛ wytrawiania z tkanki mie˛s´niowej poddanej działaniu cis´nienia 300 MPa (pow.× 125).

Fig. 6. Trichinella spiralis larvae isolated from meat tissue pressurised at 300 MPa (× 125 magnification).

Zaobserwowano, z˙e stichosom larw poddanych działaniu cis´nienia 150 MPa był mniej wyraz´ny, niz˙ w przypadku podobnych obrazo´w larw poddanych działaniu niz˙szych cis´nien´ (np. 100 MPa, ryc. 7).

Słabo zachowane, cze˛s´ciowo zatarte narza˛dy wewne˛trzne larw włos´ni obserwowano w pro´bce tkanki mie˛s´niowej poddanej działaniu cis´nienia 200 i 300 MPa. Wykazano, z˙e w 300 MPa wyste˛puje zatarcie granic mie˛dzy komo´rkami mie˛s´ni somatycznych oraz niefizjologiczne rozde˛cie larwy (ryc. 8). Wszystkie preparaty otorbionych larw, niezalez˙nie od zastosowanego cis´nienia, wykazywały nacieki komo´rek limfocytopodobnych woko´ł larw w tkance mie˛s´niowej.

Ryc. 7. Otorbiona lawa Trichinella spiralis w tkance mie˛s´niowej

poddanej działaniu cis´nienia 100 MPa. Barwienie H-E, pow.× 500. (S – stichosom). Fig. 7. Trichinella spiralis larva in a meat tissue

pressurised at 100 MPa. Staining with hematoxylin-eosin,× 500 magnification (S – stichosome).

Ryc. 8. Otorbiona larwa Trichinella spiralis w tkance mie˛s´niowej poddanej działaniu cis´nienia 300 MPa. Barwienie H-E, pow.× 250. (R – niefizjologiczne rozde˛cie larwy).

Fig. 8. Trichinella spiralis larva in a meat tissue pressurised at 300 MPa. Staining with hematoxylin-eosin,× 250 magnification (R – unnatural blowing of the larva).

WNIOSKI

1. Działanie cis´nienia hydrostatycznego 50 do 150 MPa przez 15 min. w

tem-peraturze pokojowej (20

°C) nie wpływa na przez˙ywalnos´c´ larw Trichinella spiralis

znajduja˛cych sie˛ w mie˛sie.

2. Cis´nienia rze˛du 200 MPa i wyz˙sze stosowane przez 15 min. w temperaturze

pokojowej powoduja˛ 100% s´miertelnos´c´ larw T. spiralis.

3. Larwy T. spiralis poddane działaniu cis´nienia 150 MPa, wyizolowane z tkanki

mie˛s´niowej, wykazuja˛ objawy patologicznej nadskre˛tnos´ci. Zjawiska tego nie

obserwuje sie˛ w przypadku larw otorbionych pozostaja˛cych wewna˛trz tkanki

mie˛s´niowej.

4. Cis´nienia rze˛du 200 – 300 MPa wywołuja˛ zmiany w narza˛dach wewne˛trznych

larw T. spiralis objawiaja˛ce sie˛ mniej wyraz´nie dostrzegalnym stichosomem oraz

cze˛s´ciowym zatarciem granic mie˛dzy komo´rkami mie˛s´ni somatycznych larw.

5. Cis´nienie hydrostatyczne rze˛du 200 MPa lub wyz˙sze moz˙e byc´ wykorzystane

do dekontaminacji mie˛sa zakaz˙onego larwami Trichinella spiralis.

I. K ł o c z k o, T. C h u d o b a

ULTRAHIGH HYDROSTATIC PRESSURES (UHP) USED TO DECONTAMINATE MEAT INFECTED WITH TRICHINELLA SPIRALIS LARVAE

S u m m a r y

Samples of meat infected with Trichinella spiralis larvae were subjected to hydrostatic pressures of 50, 100, 150, 200 and 300 MPa for 15 min at room temperature. The pressurised samples, control samples, larvae isolated from the samples by enzymatic etching, and the histological specimens obtained from the infected meat samples were observed under microscope. The survival rate was determined as the percentage of larvae capable of moving in the course of microscopic observation of the larvae isolated from the meat samples. It has been found that pressures 200 MPa or higher are lethal to 100% of the larvae. At lower pressures, some of the larvae survive, but their bodies undergo some deformations (partial straightening or excessive twisting).

PIS

´

1. Gerwel C., Pawłowski Z.: Studies on the epidemiology and biology of Trichinellosis in Poland. Wiadomos´ci Parazytologiczne, 1975; 4-5: 513-540. – 2. Prost E.: Polskie przepisy sanitarno-weteryna-ryjne. I. Obro´t, ubo´j i badanie sanitarno-weterynaryjne zwierza˛t rzez´nych i mie˛sa. Wydawnictwo AR, Lublin 1992. – 3. Kotula A.W., Murelli K.D., Acosta-Stein L., Tennent I.: Influence of rapid cooking methods on the survival of Trichinella spiralis in pork chops from experimentally infected pigs. J. Food Sci., 1982; 47(3): 1006-1007. – 4. Zimmermann W.J., Olson D.G., Sandoval R., Rust R.E.: Efficacy of freezing in eliminating infectivity of Trichinella spiralis in boxed pork products. J. Food Protection, 1985; 48(3): 196-199. – 5. Carlin A.F., Mott C., Cash D., Zimmermann W.J.: Destruction of Trichinella

spiralis larvae in beef-pork loaves cooked in microwave ovens. L. Food Sci., 1982; 47(4): 1096-1099,

1118. – 6. Kasprzak W., Pozio E., Rauhut W., Nowosad P.: Effect of low irradiation on Trichinella irradiates. Acta Parasitologica, 1994; 39(4): 201-207. – 7. Nakayama H., Inaba T., Ozaki T., Kamiya H.: Effect of ultraviolet irradiation on the development of Trichinella spiralis. Japan. J. of Parasitology, 1996; 45(3): 181-184. – 8. Zimmermann W.J.: Salt cure and drying – time and temperature effect on viability of Trichinella spiralis in dry-cured hams. J. Food Sci., 1971; 36(1): 58-62. – 9. Carlez A., Rosec

Lebensm. Wiss. Technol., 1994; 27(1): 48-54. – 10. MacFarlane J.J.: High pressure technology and meat quality. (w) Development in Meat Science-3., Ralston L.: Elsevier Applied Publishers. London, New York, 1985.

11. Hugas M., Garriga M., Monfort J.M.: New mild technologies in meat processing: high pressure as a model technology. Meat Sci., 2002; 62: 359-371. – 12. Szczawin´ski J., Szczawin´ska M.E.: Moz˙liwos´ci inaktywacji drobnoustrojo´w w produktach spoz˙ywczych przy wykorzystaniu metody HPP. Materiały seminarium: „Dotychczasowe wyniki oraz perspektywy zastosowania wysokich cis´nien´ w przetwo´rstwie z˙ywnos´ci w Polsce i w Europie”, 18 – 19 maja 2004. UNIPRESS, Centrum Badan´ Wysokocis´nieniowych PAN, Warszawa. – 13. Grochalska D., Gajos K., Windyga B., Fonberg-Broczek M., S

´

i we˛dliny, 2001; (6): 24-26. – 14. Ohnishi Y., Ono T., Shigehisa T., Ohmori T.: Effect of high hydrostatic pressure on muscle larvae of Trichinella spiralis. Jap. J. of Parasit., 1992; 41(5): 373-377.