Med. Weter. 2021, 77 (4), 189-192 189
Artykuł przeglądowy Review
DOI: dx.doi.org/10.21521/mw.6482
Pestycydy – współczesne zagrożenie
Pestycydy to związki chemiczne, które można skla-syfikować ze względu na ich właściwości: fizyczne, chemiczne, spektrum działania oraz bezpieczeństwo – klasy toksyczności ostrej (10, 40). Pierwotnie zakła-dano, że stosowanie pestycydów nie będzie wiązało się ze szkodliwością dla człowieka, zwierząt oraz środowi-ska naturalnego. Jednakże ich wieloletnie stosowanie ujawniło negatywne skutki odziaływania tych związ-ków na organizmy żywe (10, 41). Pestycydy łatwo rozprzestrzeniają się w ekosystemie, w wyniku dzia-łania takich czynników, jak wiatr czy deszcz. Podczas rozpylania nad terenami rolniczymi pestycydowych środków chemicznych, ulegają one wraz z prądami powietrza przemieszczeniu na odległe tereny, stano-wiąc jedno z najpoważniejszych zagrożeń dla środo-wiska, zwierząt oraz ludzi (10, 11, 41). W badaniach nad wpływem działania metyksochloru – pestycydu z grupy chlorowanych węglowodorów, na funkcje rozrodcze samców szczurów wykazano, że związek ten może powodować nasilenie stresu oksydacyjnego, peroksydacji lipidów oraz obniżenie aktywności enzy-mów przeciwutleniających (24). W wyniku działania
pestycydów zwiększa się ilość wolnych rodników w organizmie, która wyzwala zmiany w metabolizmie różnych związków w tym DNA, doprowadzając do jego uszkodzeń. Zmiany te mogą prowadzić do róż-nych chorób neurodegeneracyjróż-nych, takich jak choroby Alzheimera czy Parkinsona (13). Ekspozycja organi-zmu na pestycydy może doprowadzić do uszkodzenia narządów, w szczególności tych o budowie miąższo-wej, powodować upośledzenie funkcjonowania układu nerwowego, odpornościowego, jak również przyczynić się do wystąpienia mutacji w materiale genetycznym komórek (13, 41). Organizmy żyjące w środowisku wodnym są stale narażone na zanieczyszczenia do-cierające z terenów uprawnych lub przemysłowych. W wyniku źle zaprojektowanych składowisk odpadów czy systemów melioracyjnych lub nieodpowiednie-go stosowania środków ochrony roślin na terenach uprawnych, pestycydy przedostają się do środowiska wodnego. W tabeli przedstawiono najczęściej wystę-pujące pestycydy w środowisku wodnym. Pestycydy ulegają bioakumulacji nie tylko w organizmie ryb, ale również małży i pozostałych bezkręgowców żyjących w środowisku wodnym (9). Indukowany przez
pesty-Test kometkowy jako metoda wykorzystywana
w badaniach nad uszkodzeniami struktury DNA
spowodowanymi pestycydami u ryb
MARLENA KSIĘŻARCZYK1, PAULINA LEŚNIAK2, MARCIN B. ARCISZEWSKI3, JOSE LUIS VALVERDE PIEDRA21Studenckie Koło Naukowe Toksykologii Weterynaryjnej, 2Zakład Farmakologii, Toksykologii i Ochrony Środowiska, 3Katedra Anatomii i Histologii Zwierząt, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie,
ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin
Otrzymano 12.06.2020 Zaakceptowano 07.08.2020
Księżarczyk M., Leśniak P., Arciszewski M. B., Valverde Piedra J. L.
Comet assay as a method used in research on DNA damage caused by pesticides in fish
Summary
The comet assay method is a research technique for detecting damage to cellular DNA due to active physical or chemical agents. The comet assay is based on electrophoretic migration of genetic material contained in the cell’s nucleus. This research method is commonly used in many different fields, such as toxicology, environmental protection, and pharmacology. In recent years, the comet assay has attracted considerable attention from scientists studying the effects of harmful substances on the genetic material in the cell’s nucleus. The presence of pesticides in the environment is a threat to animals, because of the negative effects of pesticides on cells and their genetic material. Therefore, the aim of this paper, based on the available literature, was to describe the use of the comet assay in assessing the genotoxicity of pesticides to cells of aquatic organisms, as well as to describe the methodology and potential complications of this procedure.
Med. Weter. 2021, 77 (4), 189-192 190
cydy stres oksydacyjny, a także obniżenie aktywności enzymów chroniących przed nim przyczyniły się do zwiększenia peroksydacji lipidów błon komórkowych wątroby u ryb (27, 34). W mózgu ryb pod wpływem działania chlorpyrifosu – pestycydu fosforoorganiczne-go – zaobserwowano zmniejszenie aktywności enzymu acetylocholinoesterazy odpowiedzialnego za rozkład neuroprzekaźnika – acetylocholiny na cholinę i resztę kwasu octowego. Przyczynić się to może do zaburzenia kaskady reakcji na poziomie ośrodkowych i obwodo-wych układów neurohormonalnych, co może spowo-dować nieprawidłowe zachowania behawioralne (35). Rybie zarodki, które były narażone na ekspozycję pe-stycydów, później osiągały dojrzałość płciową, a także wykazywały zaburzenia w działaniu szlaków sygna-łowych związanych z reprodukcją (27). Wykazano, że pestycydy działają teratogennie na zarodki ryb, powodując ich deformację, a także przyczyniają się do dużej śmiertelności narybku (27). W doświadczeniu przeprowadzonym przez Mhadhbi i Beiras (28) badano wpływ insektycydów (chlorpyrifos, dieldryna, diazi-non, pirymifos metylowy) oraz herbicydów (alachlor, atrazyna, diuron) na rozwój zarodkowy oraz larwalny ryb z gatunku turbot (Psetta maxima). Wykazano, że badane insektycydy oraz herbicydy powodowały znaczy wzrost śmiertelności zarodków ryb. Ponadto, zaobserwowano wystąpienie wad morfologicznych u zarodków oraz larw ryb, w szczególności były to deformacje szkieletu, obrzęk osierdzia oraz zmiany w budowie woreczka żółtkowego (28).
Zastosowanie testu kometkowego w ocenie stopnia uszkodzenia struktury DNA organizmów wodnych
spowodowanego działaniem pestycydów Test kometkowy to jedna z metod badawczych wy-korzystująca techniki elektroforetyczne, która umoż-liwia badanie uszkodzeń struktury DNA. Metoda ta została wprowadzona w latach 70. ubiegłego wieku i od tego czasu uległa wielu modyfikacjom, dzięki którym ciągle cieszy się sporym zainteresowaniem w środowisku naukowym. Ponadto, względnie niskie koszty związane z tą metodą oraz krótki czas uzyskania
wyników przemawiają za jej dalszym stoso-waniem w badaniach (7). Wykorzystywana jest w badaniach nad mechanizmami powsta-wania uszkodzeń oraz naprawy struktury DNA w komórkach jak: leukocyty (33), limfocyty (40), jądrzaste erytrocyty (2), spermato-cyty (37) oraz inne jądrzaste komórki (7). O stopniu uszkodzenia struktury DNA przez czynniki toksyczne informuje analiza tzw. komety, której „ogon” powstaje w wyniku przemieszczenia się fragmentów nici DNA w żelu agarozowym w wyniku rozdziału elek-troforetycznego, zaś „głowę” komety stanowi unieruchomiona komórka przed lizą (15, 16). Do oceny poziomu uszkodzeń DNA niezbędne jest użycie programu komputerowego służącego do analizy obrazu, dzięki któremu mierzona jest długość „ogona”, jak również ilość zawartego w nim DNA (22). W ostatnich latach metoda ta została wykorzystana w badaniach z zakresu ochrony środowiska w celu monitorowania występowania czynników fizycznych i chemicznych, głównie jako strategia oceny ryzyka ekotoksykologicznego (17, 23, 26, 29). Jednakże test kometkowy nie jest jedyną metodą stosowaną w celu oszacowania względnej toksyczności różnych szkodli-wych związków na faunę i florę środowiska wodnego (2, 6, 21, 29, 36) oraz osadów dennych rzek i jezior (23). Należy do nich również zatwierdzony przez Europejskie Centrum Walidacji Metod Alternatywnych (ECVAM) test mikrojądrowy stanowiący alternatyw-ną metodę testu aberracji chromosomowej (5, 21) oraz zgodny z wytycznymi Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD) test toksyczności ostrej dla ryb (39). Przykładem badania nad oceną ge-notoksyczności pestycydów u organizmów środowiska wodnego, w którym wykorzystano test kometkowy, jest doświadczenie przeprowadzone przez Cavasa i współautorów (3). Badali oni wpływ cytogenetyczny i genotoksyczny glifosatu będącego głównym składni-kiem preparatu Roundup® względem erytrocytów ryb
z gatunku karaś chiński (Carassius auratus L.). Glifosat jest nieselektywnym herbicydem wykorzystywanym w rolnictwie do hamowania wzrostu niepożądanych chwastów oraz roślin. Związek ten jest wysoce roz-puszczalny w wodzie, przez co łatwo może przemiesz-czać się wraz z wodami opadowymi z pól uprawnych do środowiska wodnego, stanowiąc duże zagrożenie dla zamieszkujących je organizmów. Ryby z grupy kontrolnej negatywnej były utrzymywane w odchlo-rowanej wodzie z kranu, zaś ryby z grupy kontrolnej pozytywnej traktowano cyklofosfamidem – związkiem chemicznym o działaniu cytostatycznym, w dawce 5 mg/l. Ryby z grup doświadczalnych były narażone na glifosat w dawkach 5, 10 i 15 mg/l. Pobrano od ryb krew z żyły ogonowej do badań drugiego, czwartego oraz szóstego dnia po ekspozycji na glifosat. Rezultaty testu kometkowego wykazały wzrost częstotliwości Tab. 1. Wykaz najczęściej występujących pestycydów w wodach
po-wierzchniowych rzek i jezior
Nazwa Wzór chemiczny Rodzaj Źródło
Atrazyna C8H14ClN5 herbicyd (12, 19)
Bifentryna C23H22CIF3O2 insekcyd (35)
Cyproconazol C15H18CIN3O fungicyd (35)
Dichlorodifenylotrichloroetan – DDT C14H9Cl5 insekcyd (8, 18) Endosulfan C9H6Cl6O3S insekcyd (18) Fluometuron C10H11F3N2O herbicyd (30, 32) Prometryna C10H19N5S herbicyd (30, 32) Propiconazol C15H17Cl2N3O2 fungicyd (1, 30) Tebuconazol C16H22ClN3O fungicyd (30, 4)
Med. Weter. 2021, 77 (4), 189-192 191
pęknięć mikrojąder i nici DNA u ryb z grup doświad-czalnych w porównaniu z rybami grupy kontrolnej (3). Cavas (2) w swoich kolejnych badaniach z wy-korzystaniem testu kometkowego skupił się na ocenie toksycznego wpływu 98% atrazyny oraz komercyjnego herbicydu Gesaprim® zawierającego w swoim składzie
atrazynę o stężeniu 500 mg/ml na obwodowe erytrocy-ty ryb z gatunku karaś chiński (Carassius auratus L.). Zastosował trzy stężenia badanych substancji, kolejno 5, 10 i 15 µg/l. Wykazał on, że wraz ze wzrostem stężenia w wodzie herbicydu zawierającego atrazynę oraz wydłużeniem czasu ekspozycji następuje wzrost częstotliwości pęknięć mikrojądra oraz nici DNA erytrocytów obwodowych, w porównaniu do zastoso-wania czystej atrazyny (2). W zaproponowanym przez Sharma (36) doświadczeniu wykonanym na rybach z gatunku bagr kobaltowy (Mystus vittatus) wykazano negatywny wpływ endosulfanu należącego do grupy insektycydów chloroorganicznych na organizmy ryb oraz potwierdzono przydatność testu kometkowego do badań laboratoryjnych in vivo. W tym doświadczeniu wykorzystano różne stężenia endosulfanu (0,20 µg/l, 0,25 µg/l i 0,50 µg/l), którymi traktowano pobrane od ryb komórki skrzeli, nerek oraz erytrocytów. Wyniki badań wykazały, że wszystkie użyte stężenia endosul-fanu wpływają negatywnie na strukturę DNA komórek ryb, jednak największy stopień uszkodzenia struktury DNA występuje pierwszego dnia ekspozycji (36).
Procedury testu – możliwości i ograniczenia Prawidłowe otrzymanie wyników badań z wykorzy-staniem testu kometkowego uzależnione jest od prze-prowadzenia poszczególnych etapów, przygotowania próbki badanej, sprzętu oraz odczynników. Zazwyczaj test kometkowy przeprowadza się zgodnie z procedu-rą zaproponowaną przez Hartmann oraz Speit (14), Klaude i wsp. (20) oraz Singha i współautorów (38), jednak procedura ta może podlegać modyfikacjom. Początkowy etap testu jest bardzo istotny, ponieważ nieprawidłowe przygotowanie szkiełek mikroskopo-wych może powodować brak trwałego przylegania warstwy nałożonej na nie agarozy o normalnej tempe-raturze topnienia. Szkiełka powinny być prawidłowo oczyszczone za pomocą 98% roztworu metanolu lub etanolu, a następnie opalone nad płomieniem palnika. Powszechnie wykorzystuje się dwie metody nakła-dania agarozy. Pierwsza polega na nałożeniu kropli agarozy na szkiełko mikroskopowe i roztarciu jej za pomocą szybkiego ruchu wykonanego drugim szkieł-kiem mikroskopowym. Druga metoda jest łatwiejsza do wykonania, polega ona na zanurzeniu szkiełka w zlewce wypełnionej ciekłą agarozą o temperaturze 37°C, która umieszczona jest w łaźni wodnej o tej samej temperaturze. Po zanurzeniu szkiełka mikrosko-powego jego dolną stronę przeciera się ligniną w celu oczyszczenia. Tak przygotowane szkiełka odkłada się do cieplarki o temperaturze 30°C na około 6
go-dzin, lub pozostawia na 24 godziny w temperaturze pokojowej w celu wysuszenia. Następnie wcześniej pobrany materiał badawczy mieszany jest z agaro-zą o niskiej temperaturze topnienia i nakładany na szkiełka mikroskopowe pokryte zastygniętą agarozą. Tak przygotowane próbki są umieszczane w zlewce zawierającej roztwór lizujący (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100) o pH = 10. Liza przeprowadzana jest w temperaturze 4°C, przez minimum 2 godziny do maksymalnie 24 godzin, w za-leżności od wielkości badanego materiału. Kolejno przeprowadza się elektroforezę (300 mA; 0,8 V/cm) w temperaturze 4°C, przez 30 minut. Zalecane jest przed rozpoczęciem elektroforezy pozostawienie szkiełek wraz z badanym materiałem w roztworze do elektrolizy (300 mM NaOH; 1 mM EDTA) o pH = 10, przez 30 minut. Po elektroforezie prób-ki płukane są w roztworze neutralizującym (0,4 M Tris, stężony HCl, podwójnie destylowana woda) o pH = 7,5. Test kometkowy powinien być wykonywa-ny w warunkach z ograniczowykonywa-nym dostępem do światła, ponieważ światło słoneczne powoduje uszkodzenie materiału genetycznego. Do wizualizacji materiału genetycznego wykorzystuje się takie barwniki jak DAPI, SYBR Green, bromek etydyny oraz azotan srebra, które nakłada się na szkiełka z materiałem badawczym i ogląda pod mikroskopem epifluorescen-cyjnym lub mikroskopem świetlnym w zależności od użytego barwnika (14, 15, 20, 22, 38). Do analizy za-wartości procentowej DNA w kometach wykorzystuje się szeroko dostępne programy komputerowe takie jak darmowy program do analizy zdjęć CASPlab (http:// casplab.com/) (15, 22).
Podsumowanie
Mimo wielu ograniczeń prawnych oraz wprowadze-nia programów dotyczących zmniejszewprowadze-nia stosowawprowadze-nia pestycydów w rolnictwie na terenach państw człon-kowskich Unii Europejskiej, problem związany z po-zostałości pestycydów stosowanych w XXI w. jest na-dal obecny. Niesie on duże zagrożenie dla wszystkich gatunków zwierząt, powodując uszkodzenia narządów miąższowych, układu nerwowego, odpornościowego oraz hormonalnego. Pestycydy mają dużą zdolność do bioakumulacji w tkankach zwierząt, w szczególności w tkance tłuszczowej, dlatego obecnie prowadzonych jest wiele badań z wykorzystaniem różnych metod ana-lizy chemicznej w celu określenia ilości pozostałości pestycydów w tkankach oraz wpływu tych związków na organizmy żywe (25). W ocenie toksyczności spo-wodowanej pozostałościami pestycydów w łańcuchu troficznym skuteczne okazało się wykorzystanie testu kometkowego. Test ten okazał się szybką oraz czułą metodą służącą do identyfikacji uszkodzeń struktury DNA. Dodatkowo test kometkowy cieszy się dużym zainteresowaniem nie tylko w badaniach nad oceną genotoksyczności pestycydów, ale również wpływem
Med. Weter. 2021, 77 (4), 189-192 192
obecności innych zanieczyszczeń zawartych w osa-dach dennych rzek i jezior na organizmy wodne (6, 23), dlatego wykorzystanie testu kometkowego w bada-niach z zakresu ekotoksykologii oraz biomonitoringu środowiska wodnego jako metoda badawcza wydaje się niezbędna (21, 31).
Piśmiennictwo
1. Battaglin W. A., Sandstrom M. W., Kuivila K. M., Kolpin D. W., Meyer M. T.: Occurrence of azoxystrobin, propiconazole, and selected other fungicides in US streams, 2005-2006. Water Air Soil. Pollut. 2011, 218, 307-322, doi: 10.1007/s11270-010-0643-2.
2. Cavas T.: In vivo genotoxicity evaluation of atrazine and atrazine-based herbi-cide on fish Carassius auratus using the micronucleus test and the comet assay. Food Chem. Toxicol. 2011, 49, 1431-1435, doi: 10.1016/j.fct.2011.03.038. 3. Cavas T., Könen S.: Detection of cytogenetic and DNA damage in peripheral
erythrocytes of goldfish (Carassius auratus) exposed to a glyphosate formu-lation using the micronucleus test and the comet assay. Mutagenesis 2007, 22, 263-268, doi: 10.1093/mutage/gem012.
4. Ccanccapa A., Masiá A., Navarro-Ortega A., Picó Y., Barceló D.: Pesticides in the Ebro River basin: Occurrence and risk assessment. Environ. Pollut. 2016, 211, 414-424, doi: 10.1016/j.envpol.2015.12.059.
5. Corvi R., Albertini S., Hartung T., Hoffmann S., Maurici D., Pfuhler S.,
Vanparys P.: ECVAM retrospective validation of in vitro micronucleus test
(MNT). Mutagenesis 2008, 23, 271-283, doi: 10.1093/mutage/gen010. 6. Coughlan B. M., Hartl M. G. J., O’Reilly S. J., Sheehan D., Morthersill C.,
van Pelt F. N. A. M., O’Halloran J., O’Brien N. M.: Detecting genotoxicity
using the Comet assay following chronic exposure of Manila clam Tapes semidecussatus to polluted estuarine sediments. Mar. Pollut. Bull. 2002, 44, 1359-1365, doi: 10.1016/s0025-326x(02)00254-0.
7. Czubaszek M., Szostek M., Wójcik E., Andraszek K.: Test kometowy jako metoda identyfikacji niestabilności chromosomów. Postępy Hig. 2014, 68, 695-700.
8. Dahshan H., Megahed A. M., Abd-Elall A. M. M., Abd-El-Kader M. A. G.,
Nabawy E., Elbana M. H.: Monitoring of pesticides water pollution-The
Egyptian River Nile. J. Environ. Health Sci. Eng. 2016, 14, 15, doi: 10.1186/ s40201-016-0259-6.
9. El-Nahhal Y., Hams S.: Effects of Some Pesticides on Tilapia nilotica and Daphnia magna Life. J. Nat. Studies 2020, 28, 28-37.
10. Ghorab M. A., Khalil M. S.: The Effect of Pesticides Pollution on Our Life and Environment. J. Pollut. Eff. Cont. 2016, 4, 1-2, doi: 10.4172/2375-4397.1000159.
11. Głodowska M., Gałązka A.: Intensyfikacja rolnictwa a środowisko naturalne. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 2018, 592, 3-13.
12. Gonzalez-Rey M., Tapie N., Le Menach K., Dévier M.-H., Budzinski H.,
Bebianno M. J.: Occurrence of pharmaceutical compounds and pesticides
in aquatic systems. Marine Pollut. Bulletin 2015, 96, 384-400, doi: 10.1016/ j.marpolbul.2015.04.029.
13. Grosicka-Maciąg E.: Biologiczne skutki stresu oksydacyjnego wywołanego działaniem pestycydów. Postepy Hig. 2011, 65, 357-366.
14. Hartmann A., Speit G.: Genotoxic effects of chemicals in the single cell gel (SCG) test with human blood cells in relation to the induction of sister-chro-matid exchanges (SCE). Mut. Res. 1995, 346, 49-56, doi: 10.1016/0165-7992(95)90068-3.
15. Jałoszyński P., Szyfter G.: Comet assay – nowoczesna technika w bada-niach genotoksykologicznych. (red.) Na pograniczu chemii i biologii, t. 3, Wydawnictwo Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza, Poznań 1999, s. 452-459, 466-469.
16. Jha A. N.: Ecotoxicological applications and significance of the comet assay. Mutagenesis 2008, 23, 207-222, doi: 10.1093/mutage/gen014.
17. Jurczyk L., Lewandowska R., Brzuzan P., Woźnicki P.: Zastosowanie metody kometowej w wykrywaniu genotoksyczności substancji chemicznych u ryb. Kom. Ryb. 2003, 5, 20-22.
18. Kafilzadeh F.: Assessment of organochlorine pesticide residues in water, sediments and fish from lake tashk, Iran. Achievements in the Life Sci. 2015, 9, 107-111, doi: 10.1016/j.als.2015.12.003.
19. Kapsi M., Tsoutsi C., Paschalidou A., Albanis T.: Environmental monitoring and risk assessment of pesticide residues in surface waters of the Louros River (N. W. Greece). Sci. Total Environ. 2019, 650, 2188-2198, doi: 10.1016/ j.scitotenv.2018.09.185.
20. Klaude M., Eriksson S., Nygren J., Ahnström G.: The comet assay: mecha-nisms and technical considerations. Mut. Res. 1996, 363, 89-96, doi: 10.1016/ 0921-8777(95)00063-1.
21. Klobučar G. I., Pavlica M., Erben R., Papeš D.: Application of the micro-nucleus and comet assays to mussel Dreissena polymorpha haemocytes for genotoxicity monitoring of freshwater environments. Aquat. Toxicol. 2003, 64, 15-23, doi: 10.1016/s0166-445x(03)00009-2.
22. Końca K., Lankoff A., Banasik A., Lisowska H., Kuszewski T., Góźdź S., Koza Z.,
Wojcik A.: A cross-platform public domain PC image-analysis program for the
comet assay. Mutat. Res. 2003, 534, 15-20.
23. Kosmehl T., Krebs F., Manz W., Erdinger L., Braunbeck T., Hollert H.: Comparative genotoxicity testing of rhine river sediment extracts using the comet assay with permanent fish cell lines (rtg-2 and rtl-w1) and the ames test. J. Soils Sedi. 2004, 4, 84-94, doi: 10.1007/bf02991050.
24. Latchoumycandane C., Mathur P. P.: Induction of oxidative stress in the rat testis after short-term exposure to the organochlorine pesticide methoxychlor. Arch. Toxicol. 2002, 76, 692-698, doi: 10.1007/s00204-002-0388-9. 25. Makles Z., Domański W.: Ślady pestycydów – niebezpieczne dla człowieka
i środowiska. Bezp. Pracy. 2008, 1, 1-5.
26. Mañas F., Peralta L., Raviolo J., García Ovando H., Weyers A., Ugnia L.,
Gonzalez Cid M., Larripa I., Gorla N.: Genotoxicity of AMPA, the
environ-mental metabolite of glyphosate, assessed by the Comet assay and cytogenetic tests. Ecotox. Environ. Safe. 2009, 72, 3, 834-837, doi: 10.1016/j.ecoenv. 2008.09.019.
27. Martyniuk C. J., Mehinto A. C., Denslow N. D.: Organochlorine pesti-cides: Agrochemicals with potent endocrine-disrupting properties in fish. Molecular and Cellular Endocrinology 2020, 505, 110764, doi: 10.1016/ j.mce.2020.110764.
28. Mhadhbi L., Beiras R.: Acute Toxicity of Seven Selected Pesticides (Alachlor, Atrazine, Dieldrin, Diuron, Pirimiphos-Methyl, Chlorpyrifos, Diazinon) to the Marine Fish (Turbot, Psetta maxima). Water Air Soil. Pollut. 2012, 223, 5917-5930, doi: 10.1007/s11270-012-1328-9.
29. Mitchelmore C. J., Chipman J. K.: DNA strand breakage in aquatic organisms and the potential value of the comet assay in environmental monitoring, Mutat. Res-Fund. Mol. M. 1998, 399, 135-147, doi: 10.1016/s0027-5107(97)00252-2. 30. Mojiri A., Zhou J. L., Robinson B., Ohashi A., Ozaki N., Kindaichi T., Vakili M.:
Pesticides in aquatic environments and their removal by adsorption methods. Chemosphere 2020, 253, 126646, doi: 10.1016/j.chemosphere.2020.126646. 31. Møller P., Knudsen L. E., Loft S., Wallin H.: The Comet Assay as a Rapid
Test in Biomonitoring Occupational Exposure to DNA-damaging Agents and Effect of Confounding Factors. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2000, 9, 1005-1015.
32. Papadakis E. N., Tsaboula A., Vryzas Z., Kotopoulou A., Kintzikoglou K.,
Papadopoulou-Mourkidou E.: Pesticides in the rivers and streams of two
river basins in northern Greece. Sci. Total. Environ. 2018, 624, 732-743, doi: 10.1016/j.scitotenv.2017.12.074.
33. Rahman M. F., Mahboob M., Danadevi K., Saleha Banu B., Paramjit G.: Assessment of genotoxic effects of chloropyriphos and acephate by the comet assay in mice leucocytes. Mutat. Res-Fund. Mol. M. 2002, 516, 139-147, doi: 10.1016/s1383-5718(02)00033-5.
34. Rao J. V., Begum G., Pallela G., Usman P., Rao R. N.: Changes in behavior and brain acetylcholinesterase activity in mosquito fish, Gambusia affinis in response to the sub-lethal exposure to chlorpyrifos. Int. J. Environ. Res. Public Health. 2005, 2, 478-483, doi:10.3390/ijerph2005030013.
35. Rossi A. S., Fantón N., Michlig M. P., Repetti M. R., Cazenave J.: Fish inhab-iting rice fields: Bioaccumulation, oxidative stress and neurotoxic effects after pesticides application. Ecological Indicators 2020, 113, 106186, doi: 10.1016/ j.ecolind.2020.106186.
36. Sharma S., Nagpure N. S., Kuma R., Pandey S., Srivastava S. K., Singh P. J.,
Mathur P. K.: Studies on the Genotoxicity of Endosulfan in Different Tissues of
Fresh Water Fish Mystus vittatus Using the Comet Assay. Environ. Contamin. Tox. 2007, 53, 617-623, doi: 10.1007/s00244-006-0228-7.
37. Simon L., Carrell D. T.: Sperm DNA Damage Measured by Comet Assay. Sperm. 2013, 137-146, doi: 10.1007/978-1-62703-038-0-13.
38. Singh N. P., McCoy M. T., Tice R. R., Schneider E. L.: A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell. Res. 1988, 175, 184-191, doi: 10.1016/0014-4827(88)90265-0.
39. Wedekind C., Siebenthal B., Gingold R.: Tje weaker points of fish acute toxicity tests and how tests on embryos can solve some issues. Environ. Pollut. 2007, 148, 385-389.
40. Wojewódzka M., Gràdzka I., Buraczewska I.: Modified neutral comet assay for human lymphocytes. Nukleonika 2002, 47, 1-5.
41. Wrzosek J., Gworek B., Maciszek D.: Środki ochrony roślin w aspekcie ochrony środowiska. Ochr. Śr. Zasobów Nat. 2009, 39, 75-88.
Autor korespondencyjny: prof. dr hab. Jose Luis Valverde Piedra, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin; e-mail: jose.valverde@up.lublin.pl
