Medycyna Wet. 2010, 66 (1) 13
Artyku³ przegl¹dowy Review
Rozwój technik biologii molekularnej pozwoli³ na poznanie wielu aspektów filogenezy, patogenezy i usprawni³ diagnostykê chorób zwierz¹t i ludzi (8, 17, 25), jednak¿e przeledzenie z³o¿onych i zale¿nych od siebie procesów oraz szlaków metabolicznych zacho-dz¹cych w tej samej ¿ywej komórce sta³o siê mo¿liwe dopiero od 1994 r., kiedy to wprowadzono pierwsze mi-kromacierze DNA (19, 20). Nazwa mikromacierz (mi-croarray) pochodzi od dwóch s³ów: mikro w znacze-niu: bardzo ma³y oraz array macierz charaktery-zuj¹ca uporz¹dkowany sposób u³o¿enia poszczególnych punktów na p³ytce. Mikromacierze znane s¹ równie¿ jako mikroczipy (microchips, DNA chips czy biochips). Metoda pomiaru ekspresji jednoczenie wielu genów zosta³a nazwana w przypadku mikromacierzy SAGE Serial Analysis of Gene Expression (22). Pierwsze mi-kromacierze pozwala³y na analizê ekspresji jedynie kil-kunastu do kilkudziesiêciu genów (20). Obecnie me-tod¹ mikromacierzy DNA przeanalizowano genomy: cz³owieka, myszy, szczura, ma³p, muszki owocowej, kukurydzy, ry¿u, niektórych paso¿ytów oraz bakterii i wirusów.
Stwierdzono, ¿e zmiany w poziomie ekspresji genów w komórce maj¹ zwi¹zek z chorobami zakanymi oraz genetycznymi bêd¹cymi problemem XXI wieku. Cho-roba Parkinsona, bêd¹ca neurodegeneracyjn¹ chorob¹ ludzi, mo¿e byæ diagnozowana na podstawie zmian w ekspresji jednego z genów koduj¹cych kinazê 2
bo-gat¹ w leucynê LRRK2. W tym przypadku stwierdzono obni¿enie aktywnoci tego enzymu metod¹ mikroma-cierzy DNA przy u¿yciu siRNA in vitro w komórkach ludzkiej linii SH-SH5Y (9). Z kolei na podstawie badañ nad bia³aczk¹ ch³oniakow¹ typu B wydaje siê, ¿e wkrótce mo¿liwe bêdzie ustalenie przebiegu choroby oraz tem-pa jej rozwoju na podstawie modeli matematycznych, takich jak liniowy model regresji prze¿ywalnoci ko-mórek nowotworowych czy metoda najmniejszych kwa-dratów wa¿onych (21). Zastosowanie mikromacierzy w diagnostyce laboratoryjnej pozwala na bardzo szyb-kie diagnozowanie przyczyny zaka¿eñ, a w przypadku zaka¿eñ bakteryjnych na podjêcie odpowiedniej terapii antybiotykowej (1, 24). Jednak¿e najczêciej mikroma-cierze DNA s¹ stosowane do badañ nad okreleniem i poznaniem funkcji genów odpowiedzialnych za pro-cesy nowotworowe u ludzi i zwierz¹t oraz nad identyfi-kacj¹ czynników, bêd¹cych zwiastunem choroby nowo-tworowej i umo¿liwiaj¹cych wczesn¹ diagnostykê (8, 17, 21). Badania te dotycz¹ przede wszystkim genów zwi¹zanych z nowotworami piersi, szyjki macicy, pro-staty i przewodu pokarmowego (7, 13, 25). Ka¿dy no-wotwór posiada specyficzny tkankowo wzór ekspresji genów i dlatego w celu jego okrelenia konstruowane s¹ macierze tkankowe. Polega to na przygotowaniu wy-cinków tkanki i naniesieniu ich na b³onê parafinow¹, a nastêpnie przeniesieniu tak przygotowanych skrawków parafinowych na szkie³ko mikromacierzy. Ustalenie
pro-Mikromacierze DNA
nowe narzêdzie biologii molekularnej
GRZEGORZ WONIAKOWSKI, EL¯BIETA SAMOREK-SALAMONOWICZZak³ad Chorób Wirusowych Drobiu Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Woniakowski G., Samorek-Salamonowicz E.
DNA microarrays a new tool of molecular biology
Summary
DNA microarrays is a method used for the determination of gene expression level, detection of single nucleotide polymorphism (SNP) and quantification of the exact number of viral gene copies per one cell. The technique has a broad application in studies on tumorous diseases of humans and animals. Microarrays are also applied in studies of drug influence on the cell metabolism and the molecular silencing of genes. The main advantage of DNA and protein microarrays is the possibility to analyse a number of complex cellular processes in progress of a tumoral disease during a single run of analysis. In the case of a tumorous disease the microarray technique makes it possible to quickly identify the main genes responsible for the oncogenesis and to determine the type of the disease. In spite of a high costs of microarray production as well as the need to synthesize probes and substrates for specific analyses, microarrays become increasingly popular in numerous research laboratories.
Medycyna Wet. 2010, 66 (1) 14
filu ekspresji genów charakterystycznych dla nowotwo-rów pozwoli na wczesne odró¿nienie tkanek zdrowych od nowotworowych (8), a tak¿e na znalezienie skutecz-nych preparatów hamuj¹cych przebieg choroby (7). Poznanie dok³adnego wzoru ekspresji genów zwi¹za-nych z typem nowotworu u danego pacjenta byæ mo¿e pozwoli w przysz³oci na zastosowanie indywidualne-go toku leczenia (7). Jiang i wsp. (12) przeprowadzili analizê 2534 mikrowycinków z nowotworów jelita gru-bego, p³uc, piersi oraz ciany jelita cienkiego. Ta sama metoda zosta³a zastosowana do badania nadekspresji bia³ka p21 w mikrowycinkach ciany jelit pobranych od pacjentów z nowotworami przewodu pokarmowego (13). Metodê mikromacierzy DNA zastosowano rów-nie¿ do okrelenia mutacji punktowych w bia³ku p53, bior¹cym g³ówny udzia³ w kontroli nad prawid³owym podzia³em komórek oraz apoptoz¹ (17).
Choroby nowotworowe stanowi¹ tak¿e problem w ho-dowli zwierz¹t. Przyk³adem takim jest choroba Mareka (MD) wystêpuj¹ca u drobiu grzebi¹cego. Jest to choro-ba nowotworowa o etiologii wirusowej, zwalczana przez szczepienia ochronne (14, 15). Po zaka¿eniu fibrobla-stów zarodków kurzych (CEF) zjadliwym szczepem RB1B wirusa MD obserwowano indukcjê ekspresji 14 genów (16). Do genów wykazuj¹cych ponad 5-krotnie wy¿sz¹ ekspresjê w stosunku do genów z niezaka¿o-nych komórek hodowli zaliczono geny zwi¹zane z uru-chamianiem odpowiedzi komórkowej po zaka¿eniu wi-rusem MD. S¹ to geny kompleksu zgodnoci tkankowej MHC typu I i II, receptor dla ³añcucha á interleukiny 13, gen koduj¹cy bia³ko zapalne makrofagów MIP-1á oraz kinazê serynowo-treoninow¹. Natomiast w hodow-lach CEF zaka¿onych szczepem HVT, s³u¿¹cym do pro-dukcji szczepionki przeciwko chorobie Mareka, wyka-zano zwiêkszony poziom ekspresji genu koduj¹cego interferon ã i genów zwi¹zanych z odpowiedzi¹ komór-kow¹ (14). Trwaj¹ prace nad uzyskaniem niewra¿liwych na zaka¿enie wirusem choroby Mareka ras kurcz¹t. Me-tod¹ mikromacierzy DNA wykazano ró¿nice w ekspre-sji dwóch genów pomiêdzy kurami rasy 72 wra¿liwymi
na zaka¿enie MDV a opornymi kurami rasy 63 (15). Na podstawie sekwencjonowania i profilowania genomu kurzego ustalono geny bior¹ce udzia³ w procesach we-getatywnych tkanek somatycznych i w reprodukcji ko-mórek rozrodczych (3, 4, 10). Poznano równie¿ ekspre-sjê genów zwi¹zanych z kompleksem klasy MHC I pod-czas dojrzewania limfocytów T w grasicy (5).
W metodzie mikromacierzy stosowana jest reakcja hybrydyzacji pomiêdzy pojedynczymi cz¹steczkami nici kwasów nukleinowych o komplementarnej sekwencji. Poszczególne geny uporz¹dkowane s¹ w rzêdy i kolum-ny, u³o¿one w idealnie prostej linii, a ka¿dy z badanych punktów (spots) powinien byæ jednakowej wielkoci. Jako pod³o¿e dla mikromacierzy wykorzystywane s¹ p³ytki szklane podobne do stosowanych w mikrosko-pach wietlnych, na których nadrukowane s¹ dziesi¹tki tysiêcy sekwencji specyficznych dla analizowanych ge-nów. Do analizy wykorzystywany jest znakowany fluo-roscencyjnie cDNA, otrzymany na drodze odwrotnej transkrypcji z informacyjnego RNA (mRNA), który
hybrydyzuje z wysok¹ specyficznoci¹ do komplemen-tarnych nici sekwencji genów umieszczonych na p³ytce w poszczególnych punktach mikromacierzy. Po dok³ad-nym odp³ukaniu cz¹steczek mRNA niezwi¹zanych z sondami w specjalnych czytnikach rejestruje siê syg-na³ fluoroscencyjny emitowany z ró¿n¹ czêstotliwoci¹ przez poszczególne punkty mikromacierzy. Skonfigu-rowane raz urz¹dzenia do nadruku, hybrydyzacji i od-czytu danych pozwalaj¹ na powtarzaln¹ analizê nawet ca³ych genomów w pojedynczym badaniu (20). Wyko-rzystywane jest oprogramowanie komputerowe. Inten-sywnoæ emisji sygna³u fluoroscencyjnego jest propor-cjonalna do poziomu ekspresji okrelonego genu. Po-ziom ekspresji genów jest cile zwi¹zany z ich funk-cj¹, przez co mo¿e dostarczyæ informacji o procesach zachodz¹cych w komórce oraz o ich anomaliach. Na podobnej zasadzie jest badany wp³yw leków na tkanki i poziom ekspresji ich genów, wp³yw zaka¿eñ wiruso-wych na komórkê oraz zmiany w profilu ekspresji pod-czas nowotworzenia i procesów starzenia siê prowadz¹-cych do mierci komórek. Mikromacierze funkcjonu-j¹ tak¿e jako biologiczne mikroprocesory stosowane w elektronice. Pozwalaj¹ one na bardzo szybk¹, skutecz-n¹ i dok³adskutecz-n¹ analizê ekspresji, ustalanie genotypu ba-danego pacjenta, badanie mechanizmów rozwoju cho-rób i nowotworów. Precyzja i szybkoæ analizy metod¹ mikromacierzy znacznie przewy¿sza dotychczas stoso-wane metody w genomice i proteomice.
Stosowane s¹ ró¿ne metody przygotowania i nadru-ku mikromacierzy. Idealne pod³o¿e do drukowania mi-kromacierzy powinno mieæ odpowiednie wymiary, byæ równe, trwa³e, wydajne oraz dostêpne dla grup funkcyj-nych immobilizowafunkcyj-nych cz¹steczek DNA. Najczêciej stosowane s¹ szkie³ka mikroskopowe, oprócz nich jest u¿ywana nitroceluloza i b³ony hydrofobowe. Do op³asz-czania p³ytek macierzy stosuje siê: z³oto, awidynê i strep-tawidynê oraz zwi¹zki posiadaj¹ce grupy aminowe, aldehydowe, epoksydowe lub w mikromacierzach bia³-kowych hydro¿el. Stosowanie pod³o¿y tego samego ro-dzaju jest wa¿ne ze wzglêdu na przygotowanie i stan-daryzacjê sprzêtu do nadruku, hybrydyzacji oraz odczy-tu. Wybór odpowiedniej metody nadrukowywania za-le¿y w du¿ym stopniu od gêstoci i liczby badanych genów w pojedynczej mikromacierzy. Najczêciej u¿y-wane s¹ metody drukowania kontaktowego, drukowa-nia bezkontaktowego typu nakrapianie (ink-jet) czy wreszcie bardzo precyzyjna fotolitografia. W metodzie drukowania kontaktowego punkty mikromacierzy wy-konywane s¹ przez zespó³ precyzyjnie ustawionych sta-lówek lub kapilar. Jednak¿e coraz czêciej stosuje siê metody nakrapiania oraz fotolitografii. Najwiêksz¹ roz-dzielczoci¹ charakteryzuj¹ siê mikromacierze druko-wane in situ metod¹ fotolitografii. Reszty aminowe pod-³o¿a takich mikromacierzy s¹ chemicznie modyfikowa-ne przez przy³¹czenie grup fotoprotekcyjnych, które s¹ odporne na zwi¹zki chemiczne, ale wra¿liwe na nawiet-lanie wiat³em UV. Wymagaj¹ one u¿ycia specyficznych fotomasek wykonanych z chromu i dok³adnego ich do-pasowania do mikromacierzy. Wielostopniowe przygo-towanie oraz koniecznoæ zachowania bardzo wysokiej
Medycyna Wet. 2010, 66 (1) 15
precyzji podczas produkcji jest przyczyn¹ wysokich kosztów reakcji. Inn¹ nowatorsk¹ metod¹ produkcji mi-kromacierzy jest stosowanie zespo³u mikrozwierciade³ aluminiowych, które przez ustawienie pod ró¿nymi k¹-tami pozwalaj¹ na aktywacjê wietln¹ okrelonych punk-tów mikromacierzy. T¹ metod¹ mo¿liwe jest drukowa-nie ok. 390 000 punktów na cm2. Technika ta pozwala
na bezporednie drukowanie mikromacierzy z dysku komputera na podstawie sekwencji DNA, pobranych z bazy danych GeneBank. W celu uzyskania jak najlep-szej wydajnoci odczytu sygna³u fluoroscencyjnego z nadrukowanych punktów macierzy stosuje siê odpo-wiednio dobrane stê¿enia substratu. Zbyt niskie stê¿e-nie ustê¿e-niemo¿liwia przy³¹czestê¿e-nie siê wystarczaj¹cej iloci badanego cDNA, podczas gdy zbyt wysokie stê¿enie prowadzi do rozmycia sygna³u fluoroscencyjnego. Jako substraty stosowane s¹ ró¿ne zwi¹zki w zale¿noci od tego, jakiego rodzaju s¹ wi¹zania pomiêdzy substratem a badanymi cz¹steczkami cDNA. S¹ to wi¹zania Van der Waalsa, jonowe i kowalencyjne. Najczêciej w im-mobilizacji cz¹steczek bior¹ udzia³ ujemnie na³adowa-ne grupy fosforanowe, które tworz¹ wi¹zania jonowe z dodatnio na³adowanym pod³o¿em macierzy. W podob-ny sposób grupy aminowe zasad azotowych ³¹cz¹ siê z grupami aldehydowymi lub epoksydowymi ekspono-wanymi na powierzchni macierzy. Immobilizacja bia-³ek zachodzi najczêciej na drodze interakcji pomiêdzy histydyn¹ lub biotyn¹ a przy³¹czon¹ kowalencyjnie strep-tawidyn¹ lub chelatowanym atomem niklu. Cz¹steczki DNA lub bia³ek mog¹ byæ wi¹zane wi¹zaniami kowa-lencyjnymi pomiêdzy grupami aldehydowymi lub epok-sydowymi pod³o¿a a grupami aminowymi, zasadami Shiffa (produkty PCR). Najczêciej wykorzystywany-mi substratawykorzystywany-mi do op³aszczania s¹ produkty PCR lub oligonukleotydy.
Do zalet stosowania produktów PCR nale¿y zaliczyæ ich stosunkowo prosty sposób syntezy oraz mo¿liwoæ otrzymania bardzo d³ugich amplikonów o wielkoci 500--5000 bp. Z drugiej strony jednak, koszt syntezy starte-rów koniecznych do przeprowadzenia PCR mo¿e sta-nowiæ ograniczenie w przypadku jednoczesnej analizy ponad 10 000 ró¿nych genów. Ponadto w analizie eks-presji lub pojedynczych mutacji genów o wysokim stop-niu konserwatywnoci np: genów interleukin, chapero-nów, bia³ek bior¹cych udzia³ w procesach replikacji trud-noci mo¿e sprawiaæ zjawisko krzy¿owej hybrydyzacji (cross-hybrydysation) pomiêdzy produktami PCR a ba-danymi próbkami. Komplementarnoæ obu nici rzêdu nawet kilkudziesiêciu nukleotydów, co mo¿e wyst¹piæ w przypadku genów o konserwatywnej sekwencji, po-woduje hybrydyzacjê i uzyskiwanie fa³szywego syg-na³u fluoroscencyjnego. Drug¹, alternatywn¹ metod¹ jest synteza krótkich odcinków DNA (oligonukleoty-dów) wielkoci od 5 do 40 nukleotydów in situ na p³yt-ce mikromacierzy przy u¿yciu fotolitografii. G³ówn¹ zalet¹ drukowania oligonukleotydów jest wy¿sza czu-³oæ w stosunku do macierzy z nadrukowanymi produk-tami PCR. Krótkie odcinki nadrukowanych oligonukle-otydów pozwalaj¹ na badanie ró¿nic w sekwencji i eks-presji nawet bardzo konserwatywnych genów. Jednym
z ograniczeñ tej metody jest jej wysoki koszt, co do mo¿-liwoci stosowania niektórych fluorochromów oraz ko-niecznoæ dok³adnego poznania badanej sekwencji przed nadrukowaniem macierzy. Mikromacierze bia³kowe mog¹ byæ przygotowane z ekstraktów komórkowych za-wieraj¹cych mieszaninê bia³ek, z oczyszczonych bia³ek w ich natywnym stanie oraz bia³ek rekombinowanych, których nadekspresjê mo¿na uzyskaæ w transformnych komórkach E. coli, dro¿d¿ach, komórkach owa-dów i ssaków. Ekspresja in vitro badanych bia³ek zwala na uzyskanie kilku lub kilkunastu µg bia³ka po-trzebnego do immobilizacji na powierzchni macierzy. rednia gêstoæ mikromacierzy bia³kowych wynosi od 5000 do 30 000 ró¿nych protein. Oczyszczanie rekom-binowanych bia³ek mo¿liwe jest przy u¿yciu znaczni-ków zawieraj¹cych ujemnie na³adowane reszty histy-dyny i zastosowaniu oczyszczania na kolumnach z nik-lem. Podobnie uzyskuje siê ekspresjê bia³ek zawieraj¹-cych epitopy GST (transferazy S-glutationowej), hema-glutyniny wirusa grypy (HA), bia³ka c-Myc i bia³ka fluo-roscencyjnego (GFP). Dodatnio na³adowane reszty his-tydyny, lizyny i argininy pozwalaj¹ na analizê bia³ek o ³adunku ujemnym, natomiast ujemnie na³adowane reszty glutaminianu i asparaginianu pozwalaj¹ na ozna-czanie bia³ek o ³adunku dodatnim (20, 22). W przypad-ku mikromacierzy bia³kowych nale¿y jednak zwróciæ szczególn¹ uwagê na mo¿liwoæ denaturacji i oksyda-cji bia³ek, co mo¿e mieæ ujemny wp³yw na ich konfor-macjê przestrzenn¹ oraz utratê pewnych w³aciwoci. Dlatego te¿ istotne jest dobranie odpowiedniego stê¿e-nia bia³ka oraz buforu do nadrukowastê¿e-nia macierzy bia³-kowych. W celu zachowania odpowiedniej lepkoci sto-suje siê glicerol oraz DMSO. Glicerol stabilizuje struk-turê przestrzenn¹ bia³ek i utrzymuje ich konformacjê w natywnej formie, natomiast DMSO powoduje dena-turacjê DNA, co pozwala na nadrukowanie ich poje-dynczych nici.
Podobnie istotne jest odpowiednie wyznakowanie docelowego mRNA. Odpowiednia iloæ fluorochromu do znakowania mRNA mo¿e byæ wyliczona matema-tycznie na podstawie kinetyki reakcji hybrydyzacji dwóch cz¹steczek kwasu nukleinowego. Wyznakowa-ne cz¹steczki cDNA zwaWyznakowa-ne s¹ sondami ze wzglêdu na fakt emitowania sygna³u fluoroscencyjnego. Aktualnie stosuje siê metody bezporedniego i poredniego zna-kowania sond. W pierwszym przypadku do badanego mRNA przy³¹czane s¹ komplementarne 20-nukleotydo-we startery oligo-dT, a nastêpnie w reakcji odwrotnej transkrypcji do powstaj¹cego cDNA inkorporowane s¹ fluoroscencyjne nukleotydy. Nastêpnie matrycowy mRNA jest degradowany przez dodatek wodorotlenku sodu, a otrzymane jednoniciowe sondy cDNA s¹ oczysz-czane z pozosta³oci starterów, enzymu i innych niepo-¿¹danych zanieczyszczeñ. Metoda bezporedniego zna-kowania pozwala na bardzo dogodne uzyskiwanie sond znakowanych ró¿nymi barwnikami m.in.: fluoroscein¹, lyzamin¹, cyjanin¹, barwnikami ALEXA i BODIPY. Wad¹ tej metody jest zmniejszona czu³oæ detekcji syg-na³u w porównaniu do znakowania poredniego, które powoduje powielenie uzyskiwanego sygna³u.
Najczê-Medycyna Wet. 2010, 66 (1) 16
ciej stosowan¹ metod¹ znakowania sond jest sprzêga-nie cDNA z barwnikami fluoroscencyjnymi najczê-ciej cyjaninami Cy3 i Cy5 oraz barwnikami ALEXA. Po wyznakowaniu cDNA i oczyszczeniu mierzy siê absorbancjê przy odpowiedniej dla danego barwnika d³ugoci fali.
Po wyznakowaniu sond przeprowadza siê hybrydy-zacjê próbek z cz¹steczkami kwasów nukleinowych op³aszczonych na mikromacierzy. Tak przygotowane mi-kromacierze mo¿na przechowywaæ przez d³ugi okres w pojemniku pró¿niowym. Hybrydyzacjê badanego cDNA z mikromacierz¹ przeprowadza siê po zabloko-waniu etanoloamin¹ i sarkozylem wolnych miejsc, na których nie nadrukowano cz¹steczek kwasów nukleino-wych. Reakcjê hybrydyzacji mo¿na prowadziæ w auto-matycznych systemach do hybrydyzacji mikromacierzy, które pozwalaj¹ na inkubacjê ciepln¹ p³ytki oraz na ci¹g-³e mieszanie naniesionego roztworu cDNA i efektywn¹ hybrydyzacjê we wszystkich punktach mikromacierzy. Do przeprowadzenia tego etapu analizy wystarcza na-wet najprostsza komora wykonana z plastikowego pu-de³ka wy³o¿onego nawil¿on¹ lignin¹ i umieszczonego w inkubatorze w temperaturze 42°C. Etap hybrydyzacji trwa ok. 18 godzin. Bezporednio po jego ukoñczeniu nale¿y odczytaæ mikromacierz przy u¿yciu odpowied-niego skanera. Sygna³ fluoroscencyjny emitowany jest po wzbudzeniu o okrelonej d³ugoci fali wiat³em la-sera przez sondy cDNA po hybrydyzacji z danymi punk-tami na powierzchni mikromacierzy. W zale¿noci od liczby zamontowanych laserów mo¿liwe jest jednoczes-ne wzbudzanie i detekcja sygna³u z 2-5 próbek cDNA wyznakowanych ró¿nymi barwnikami. W urz¹dzeniach do odczytu typu skaner fluorescencja mikromacierzy w poszczególnych jej punktach jest odczytywana po przejciu przez fotopowielacz, a sygna³ zamieniany jest na impulsy elektryczne i dane liczbowe, natomiast urz¹-dzenia typu obrazuj¹cego (imagers) rejestruj¹ obraz za pomoc¹ wiat³oczu³ej kamery CCD jako zdjêcie o wy-sokiej rozdzielczoci. Po odpowiednim ustaleniu po³o-¿enia matrycy program komputerowy odczytuje natê-¿enie zarejestrowanego sygna³u fluoroscencyjnego ze wszystkich zaznaczonych punktów mikromacierzy, a na-stêpnie przelicza uzyskane dane na podstawie standar-dów o znanej liczbie kopii cDNA lub znanym poziomie ekspresji badanych genów. Istotn¹ rolê w interpretacji wyników odgrywa normalizacja danych. Dlatego te¿ odpowiednio znormalizowane wyniki analizy ekspresji lub liczby kopii cz¹steczek badanych genów mog¹ byæ u¿yte do sformu³owania ostatecznych wniosków.
Reasumuj¹c, zastosowanie mikromacierzy DNA po-zwoli³o na uzyskanie istotnych i szczegó³owych infor-macji dotycz¹cych procesów przebiegaj¹cych w komór-kach organizmu gospodarza zaka¿onego przez wirusy i bakterie lub zmienionych nowotworowo. Procesy mo-lekularne transportu komórkowego, podzia³ów komór-kowych czy odpowiedzi komórek immunologicznie kompetentnych mog¹ zostaæ zrozumiane na podstawie analizy wielu grup genów czy bia³ek bior¹cych w nich udzia³. Mikromacierze DNA pozwoli³y na skrócenie czasu analiz i ustalenie wiêkszoci genów bior¹cych
udzia³ w onkogenezie. Podkreliæ nale¿y równie¿ mo¿-liwoæ stosowania tej metody w poszukiwaniu nowych, bardziej wydajnych i odpornych na infekcje zwierz¹t i rolin. Pomimo wysokich kosztów przygotowania oraz koniecznoci posiadania specjalistycznego sprzêtu tech-niki oparte na hybrydyzacji kwasów nukleinowych lub bia³ek oraz pomiarze fluorescencji uzyskiwanego sygna-³u stanowi¹ przysz³oæ nowoczesnej nauki.
Pimiennictwo
1.Bodrossy L., Sessitsch A.: Oligonucleotide microarrays in microbial diagnostics: Ecology and industrial Microbiology. Curr. Biol. 2004, 7, 245-254.
2.Brown P. O., Botstein D.: Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nat. Genet. 1999, 21, 33-37.
3.Burt D. W.: The chicken genome and the developmental biologist. Mech. Dev. 2004, 121, 1129-1135.
4.Cogburn L. A., Wang X., Carre W., Rejto L., Porter T. E., Aggrey S. E., Simon J.: Systems-wide chicken DNA microarrays, gene expression profiling, and disco-very of functional genes. Poult. Sci. 2003, 82, 939-951.
5.Cui J., Sofer L., Cloud S. S., Burnside J.: Patterns of gene expression in the developing chicken thymus. Dev. Dyn. 2004, 229, 480-488.
6.Cussenot O.: DNA microarrays in clinical practice: present or future? Eur. J. Intern. Med. 2002, 13, 225-226.
7.Gillet J. P., Efferth T., Steinbach D., Hamels J., Longueville F., Bertholet V., Remacle J.: Microarray-based detection of multidrug resistance in human tumor cells by expression profiling of ATP-binding cassette transporter genes. Cancer Res. 2004, 64, 8987-8993.
8.Habeck M.: DNA microarray technology to revolutionise cancer treatment. Lancet Oncol. 2001, 2, 5.
9.Häbig K., Walter M., Poths S., Riess O., Bonin M.: RNA interference of LRRK2--microarray expression analysis of a Parkinsons disease key player. Neuro-genetics 2008, 9, 83-94.
10.Hillier L. W., Miller W., Birney E., Warren W., Hardison R. C.: Sequence and comparative analysis of the chicken genome provide unique perspectives on vertebrate evolution. Nature 2004, 432, 695-716.
11.Jalving R., vant Slot R., van Oost B. A.: Chicken single nucleotide polymor-phism identification and selection for genetic mapping. Poult. Sci. 2004, 83, 1925-1931.
12.Jiang H. Y., Zhang X. F., Liu L., Li H. L., Zhao T.: A novel tissue array technique for high-throughput tissue microarray analysis microarray groups. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 2007, 43, 109-112.
13.Kanai Y.: Overexpression of HDACs: a prognostic marker for gastriccancer identified by tissue microarray. Lancet 2009, 9, 91-93.
14.Karaca G., Anobile J., Downs D., Burnside J., Schmidt C. J.: Herpes virus of turkeys: microarray analysis of host gene responses to infection. Virology 2004, 318, 102-111.
15.Liu C. H., Cheng H. H., Tirunagaru V., Sofer L., Burnside J.: A strategy to identify positional candidate genes conferring Mareks disease resistance by integrating DNA microarrays and genetic mapping. Anim. Genet. 2001, 32, 351-359.
16.Morgan R. W., Sofer L., Anderson A. S., Bernberg E. L., Cui J., Burnside J.: Induction of host gene expression following infection of chicken embryo fibro-blasts with oncogenic Mareks disease virus. J. Virol. 2001, 75, 533-539. 17.Ørntoft T. F.: Using microarrays and functional genomics to understand
target cancer. NanoBiotechnol. 2005, 1, 255-266.
18.Sánchez-Carbayo M.: Use of high-throughput DNA microarrays to identify bio-markers for bladder cancer. Clin. Chem. 2003, 49, 23-31.
19.Schena M., Shalon D., Davis R. W., Brown P. O.: Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995, 270, 467-470.
20.Shena M.: Microarray Analysis. John Wiley&Sons Publication Inc, New Jersey, USA 2003, s. 1-23, 121-154, 159-194, 198-249.
21.Shi M., Ma S.: Identifying subset of genes that have influential impactson cancer progression: a new approach to analyze cancer microarray data. Funct. Integr. Genomics 2008, 8, 361-373.
22.Velculescu V. E., Zhang L., Vogelstein B., Kinzler K. W.: Serial analysis of gene expression. Science 1995, 270, 484-487.
23.Venkatasubbarao S.: Microarrays status and prospects. Trends Biotechnol. 2004, 22, 630-637.
24.Wang D., Coscoy L., Zylberberg M., Avila P. C., Homer A., Boushey H. A., Ganem D., DeRisi J. L.: Microarray-based detection and genotyping of viral pathogen. PNAS 2002, 99, 15687-15692.
25.Winegarden N.: Microarrays in cancer: moving from hype to clinical reality. Lancet 2003, 362, 1428-1428.
26.Welford S. M., Gregg J., Chen E., Garrison D., Sorensen P. H., Denny C. T., Nelson S. F.: Detection of differentially expressed genes in primary tumor tissues using representational differences analysis coupled to microarray hybri-dization. Nucl. Acids Res. 1998, 26, 3059-3065.
Adres autora: mgr Grzegorz Woniakowski, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: grzegorz.wozniakowski@piwet.pulawy.pl
