Artykuł przeglądowy Review
Mikrosporydiozy, czyli choroby powodowane przez mikrosporydia, zaczęto intensywnie badać w latach 80. ubiegłego wieku, co związane było ze wzmożo-nymi badaniami dotyczącymi rozprzestrzeniania się AIDS, przy prowadzeniu których zaczęto izolować sprawców także innych chorób człowieka. Okazało się, że zarówno gatunki z rodzaju Nosema, jak też inne mikroorganizmy z grupy mikrosporydiów stwa-rzają poważne zagrożenie chorobowe nie tylko dla bezkręgowców, w tym głównie owadów, ale także skorupiaków i zwierząt kręgowych. Większość z nich to organizmy wyspecjalizowane w kierunku pasoży-towania na przedstawicielach określonego gatunku lub na gatunkach spokrewnionych, należących do określonego rodzaju lub rodziny. Część gatunków należy jednak do pasożytów oportunistycznych, in-fekujących także człowieka (58). Jedyna syntetyczna praca przeglądowa dotycząca mikrosporydiów ukazała się w 1999 r. (102). Od tamtego czasu opublikowano szereg artykułów i rozdziałów w większych opraco-waniach dotyczących tej grupy organizmów, jednak na pełną aktualizację wiedzy wciąż czekamy.
Nosemoza jest chorobą pszczół, której nazwa polska pochodzi od łacińskiej nazwy rodzajowej organizmów
ją wywołujących, czyli grzybów z rodzaju Nosema. Jest to groźna, szybko rozprzestrzeniająca się choroba zakaźna o charakterze inwazyjnym. W epidemiologii sytuację tego typu określa się mianem pandemii, co oznacza niekontrolowany rozwój choroby obejmu-jący duże obszary, np. kraje lub nawet kontynenty. W przypadku chorób zwierząt uściśleniem tego ter-minu jest nazwa panzoocja (lub epizoocja). Wyniki badań wskazują, że z nosemozą należy wiązać „zespół masowego ginięcia rodzin pszczelich” (CCD, Colony Collapse Disorder).
Nosemoza, w rozumieniu choroby odnoszącej się do pszczół, wywoływana jest przez dwa gatunki mi-krosporydiów: Nosema apis i N. ceranae. W ostatniej dekadzie nastąpił gwałtowny rozwój oraz rozprzestrze-nienie chorób pszczół, stwarzając poważne problemy związane z utrzymaniem zdrowych populacji tych owadów. Sytuacja powyższa wymaga zdecydowanego zwiększenia intensywności badań, których wynikiem byłaby skuteczna walka z chorobą, przy braku zagro-żenia dla samych organizmów żywicielskich.
W ostatnich latach wykonano wiele szczegółowych badań dostarczających nowej wiedzy na temat omawia-nej choroby, powstały też liczne prace przeglądowe,
Wybrane aspekty budowy, taksonomii oraz biologii
rozwoju mikrosporydiów z rodzaju Nosema
ANETA A. PTASZYŃSKA, WIESŁAW MUŁENKO
Zakład Botaniki i Mykologii, Instytut Biologii i Biochemii, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin
Ptaszyńska A. A., Mułenko W.
Selected aspects of the structure, development, taxonomy and biology of microsporidian parasites belonging to the genus Nosema
Summary
Nosemosis, is caused by two microsporidian species: Nosema apis and N. ceranae. In the last decade there has been rapid development and spread of bee diseases, creating serious problems for bee keeping management. The above situation requires a substantial increase in the intensity of research, which would result in a successful means of combating the disease with no risk to the host organism.
In recent years, a number of studies were conducted providing new knowledge about the disease, dealing with important issues related to the development, epidemiology and treatment of bees. However, despite this it remains unclear as to the real nature of the organisms that cause nosemosis, nor what is their structure and biology.
The issues raised above have obligated the authors to a brief summary of current knowledge both about the disease, as well as its perpetrators. It has been proposed to amend certain terms that should be used when describing the structures and phenomena associated with pathogenic species and the course of the process of pathogenesis. The article draws attention to some important issues that summarize and organize existing knowledge, also indicates problems which should be the subject of future research.
Keywords: Nosema apis, Nosema ceranae, nosemosis, structure, development, taxonomy, development and spread of bee diseases
poruszające ważne zagadnienia związane z rozwojem, epidemiologią i leczeniem zakażonych organizmów. Pomimo to nie do końca wiadomo, czym są organizmy powodujące nosemozę, jaka jest ich budowa i biolo-gia. Poważnych trudności nastręcza m.in. uzyskanie czystych kultur laboratoryjnych, które byłyby punk-tem wyjścia do rozpoczęcia bardziej precyzyjnych badań. Nie do końca opracowane są także względnie proste metody identyfikacji podstawowych gatunków wywołujących tę chorobę. Ogranicza to lub wręcz uniemożliwia prowadzenie skutecznej walki z choro-bami pszczół.
Poruszona powyżej problematyka zobligowała au-torów do krótkiego podsumowania dotychczasowej wiedzy zarówno o samej chorobie, jak też o jej spraw-cach. Przygotowując artykuł zaproponowano zmianę niektórych określeń, które powinny być używane podczas opisywania struktur i zjawisk związanych z budową gatunków patogenicznych oraz przebiegiem procesu patogenezy. W artykule nie poruszono kwestii, które byłyby rozwiązaniem istniejących problemów. Zwrócono raczej uwagę na kilka spraw podsumowują-cych lub porządkująpodsumowują-cych dotychczasową wiedzę oraz wskazano problemy, które powinny stać się przedmio-tem przyszłych badań.
Rozprzestrzenienie nosemoz
Pierwszy organizm należący do rodzaju Nosema (i jednocześnie pierwszy gatunek z grupy mikrospory-diów) opisał Nägeli w 1857 r. jako Nosema bombycis, wywołujący chorobę jedwabników zwaną pebryną (lub chorobą pieprzową). W połowie XVII w. spowo-dowała ona duże straty w hodowlach we Francji oraz Włoszech. Ówcześni badacze nie byli jednak w stanie określić jej przyczyn i dopiero rozwój mikroskopii pozwolił zaobserwować zarodniki oraz opisać nową grupę organizmów. Nägeli uznał odkryty przez siebie organizm za grzyb drożdżopodobny i przyporządkował go do starej jednostki taksonomicznej będącej w ran-dze klasy, zwanej Schizomycetes, w obrębie bakterii. W późniejszym okresie uznano je jednak za najbardziej pierwotne organizmy eukariotyczne w grupie Protozoa (protozoans) (99). Dalsze badania, w tym głównie molekularne, oparte na analizie sekwencji kilkunastu genów wykazały, że zbliżone są raczej do grzybów (25, 49, 98). Odkryto u nich również organelle podobne do mitochondriów (48, 50, 51).
Pierwszy opis nosemozy pszczół pochodzi z 1909 r. (104). Początkowo choroba ta powodowana była wyłącznie przez N. apis, jednakże w 1996 r. opisano kolejny gatunek, N. ceranae (27) porażający pszczoły gatunku Apis cerana, które występują endemiczne w gorącym i wilgotnym klimacie Azji. Pierwsze na-turalne zakażenie Apis mellifera powodowane przez ten gatunek odnotowano wśród pszczół utrzymywa-nych na Tajwanie (46), a następnie w Europie (39). Kolejne doniesienia dotyczyły USA (17, 18) oraz Chin i Wietnamu (59). W Polsce pierwsze informacje
o chorobie opublikowali Topolska i wsp. (91, 92). Do infekcji pszczół powodowanych przez N. ceranae dochodziło w Europie już co najmniej od 10 lat, gdyż po przebadaniu pszczół gromadzonych jako próby do analiz laboratoryjnych okazało się, że patogen był izolowany z osobników przechowywanych od 1995 r. w Polsce (91) i od 1998 r. w Finlandii (75). Uważa się, że N. ceranae w klimacie umiarkowanym atakuje pszczoły miodne późnym latem i przyczynia się do ich masowego ginięcia.
N. ceranae określana jest pasożytem „elastycznym”,
wykazującym dużą zdolność adaptacyjną zarówno do warunków mikroklimatycznych, jakie panują w ciele różnych gatunków żywicielskich, jak też do warunków środowiskowych. Oprócz Apis cerana i A. mellifera poraża on również inne gatunki pszczół – A. dorasta,
A. florea, A. koschevnikovi (11, 14) oraz kilka gatunków
trzmieli (76), u których nie zaobserwowano zakażeń wywołanych Nosema apis.
Podczas badań genetycznych wykazano tylko nie-wielkie zróżnicowanie fragmentu SSUrRNA u N.
cera-nae, wyizolowanego z różnych gatunków zakażonych
pszczół, a także z różnych lokalizacji. Wskazuje to na ważną właściwość, jaką jest brak barier w transmisji tego patogena pomiędzy różnymi gatunkami pszczół (14, 45). Fakt, że N. ceranae wykazuje wyższą kom-petencję po wprowadzeniu do nowego środowiska, może sugerować, że gatunek ten wykształcił lepsze mechanizmy ucieczki przed układem odpornościowym gospodarza oraz że rozwija się i rozmnaża szybciej niż N. apis.
Istnieją też inne różnice pomiędzy tymi dwoma gatunkami. Zakażenia wywoływane przez N. apis wykazują wyraźne zwiększenie stopnia zakażenia pszczół jesienią i wiosną (6, 44). N. ceranae natomiast nie wykazuje podobnych tendencji, porażając pszczo-ły przez capszczo-ły sezon z podobną intensywnością (31, 64, 88).
Niektóre wyniki badań wskazują, że N. ceranae wy- piera N. apis w obrębie populacji pszczół europej-skich (16, 56, 62). W Niemczech natomiast patoge-nem częściej wykrywanym wśród rodzimych rodzin pszczelich jest ciągle N. apis (32). Sprawa jest więc dyskusyjna i wymaga znacznie bardziej dokładnych badań w zakresie konkurencji pomiędzy samymi patogenami, w walce o żywiciela. Z jednej strony, wypieranie jednej populacji patogena przez drugą jest możliwe i być może proces ten obecnie się rozwija. Jest to częsty przypadek w grupie pasożytów roślin, gdzie zarówno gatunki azjatyckie, jak i amerykańskie eliminują rodzime populacje środkowoeuropejskie (68). Z drugiej strony, sprawa wymaga jednak do-kładniejszych badań, gdyż nie jest wykluczone, że istnieją populacje rodzime, które są oporne na obcy gatunek lub też inne czynniki, które wzmagają kon-kurencyjność populacji lokalnych. Wydaje się, że jest to jeden z ważniejszych, przyszłych problemów badawczych.
Budowa, identyfikacja oraz klasyfikacja taksonomiczna rodzaju Nosema
Gatunki należące do rodzaju Nosema to organiz- my eukariotyczne, diploidalne w każdej fazie cyklu życiowego i rozmnażające się w sposób bezpłciowy, występujące w postaci pojedynczych zarodników (spor) o specyficznej budowie (ryc. 1). Zarodnik jest tu jedynym łatwo rozpoznawalnym stadium cyklu życiowego. Z tego powodu nosemozę pszczół, jak również choroby wywoływane przez inne mikrospo-rydia diagnozuje się głównie na podstawie obecności zarodników w rozcierach.
Nie tylko gatunki z rodzaju Nosema, ale także cała grupa mikrosporydiów to organizmy silnie wyspecja-lizowane w kierunku obligatoryjnego, wewnętrznego pasożytowania na innych eukariontach. Genomy mikrosporydiów są najmniejsze spośród wszystkich organizmów eukariotycznych i odpowiadają wielkoś- cią genomom bakterii, również ich rybosomy są typu prokariotycznego (70S). Wielkość genomu mikrospo-rydiów wynosi średnio ok. 3000 kpz, w tym ok. 2000 to potencjalne regiony kodujące białka. W przypadku
N. ceranae wielkość genomu szacuje się na ok. 7800
kpz (21). U innych Eukaryota genomy są większe, np. u Saccharomyces cerevisiae wynosi 12 800 kpz (w tym ok. 6 tys. genów), natomiast u człowieka 3 000 000 kpz (30-35 tys. genów). Wśród Prokaryota organizmy patogeniczne, jakimi są mykoplazmy (Mycoplasma spp.), posiadają genom o wielkości 600 kpz (w tym ok. 500 genów), natomiast genom Escherichia coli to 4700 kpz (4000 genów), a Mesorhizobium loti 8000 kpz (7000 genów).
Cechy te powodują, że Nosema spp. to grupa o nie-pewnym statusie taksonomicznym, a niektóre cechy utrudniają poznanie ich pozycji filogenetycznej. Wyniki najnowszych badań molekularnych wskazują na kla-syfikację mikrosporydiów wśród grzybów (Fungi, Mycota). Wiele starszych prac włączała je jednak do królestwa Protozoa, jako kryptofity (Cryptophyta) czy cercozoa (Cercozoa), do których zaliczane są ameby i wiciowce oraz gatunki pasożytnicze z innych grup.
Budowa zarodników
Morfologia. Podstawową strukturą służącą
identy-fikacji gatunków z rodzaju Nosema, podobnie jak i in-nych organizmów zaliczain-nych do mikrosporydiów, są zarodniki. Pod względem budowy zarodników obydwa gatunki (N. apis i N. ceranae) różnią się jednak w nie-wielkim stopniu, zwłaszcza podczas standardowych obserwacji pod mikroskopem optycznym. Zarodniki
N. apis mają wymiary 4-6 µm długości oraz 2-4 µm
szerokości, podczas gdy N. ceranae, odpowiednio, 3,3-5,5 µm i 2,3-3,0 µm (27, 41). Największe zarod-niki N. ceranae mieszczą się w zakresie rozmiarów mniejszych zarodników N. apis, tylko ich kształt jest mniej symetryczny i bardziej zróżnicowany (38). To w znacznym stopniu utrudnia identyfikację obydwu gatunków tylko w oparciu o tę cechę. Ostatnio
wy-kazano jednak, że obraz morfologicznej struktury zewnętrznej zarodników, tj. skulptura (urzeźbienie) ich ściany komórkowej widoczna podczas analizy obrazu w elektronowym mikroskopie skaningowym może być przydatna do identyfikacji (79).
Ściana komórkowa. Zarodniki chronione są przez
sztywną dwuwarstwową ścianę komórkową, która jest przyczyną wysokiej odporności zarodników na wiele czynników środowiskowych, pozwalając przetrwać tym organizmom w środowisku zewnętrznym nawet kilka lat. Zewnętrzna warstwa nazywana jest „egzo-sporą” (exospore), wykazuje dużą gęstość elektronową, natomiast warstwa wewnętrzna „endospora”
(endo-spore) jest elektronowo rzadka. Ściana komórkowa
jest jednolita i proporcjonalnie dość gruba na całym obwodzie zarodnika, z wyjątkiem części szczytowej, gdzie mieści się aparat ekstruzyjny służący do wyrzu-cania nici biegunowej.
Ryc. 1. Schemat budowy zarodnika Nosema sp. wykonany na podstawie ilustracji zawartych w książce „The Microsporidia and Microsporidiosis” pod red. M. Wittner i L. M. Weiss (102) (rys. E. Kozak):
Objaśnienia: 1 – dysk kotwiczący (anchoring disc; czasem, przed wystrzeleniem nici biegunowej, nazywany jest workiem biegunowym, polar sac); 2 – egzospora lub egzosporium (exo-spore, exosporium); 3 – endospora lub endosporium (endo(exo-spore, endosporium); 4 – błona cytoplazmatyczna (plasma membrane); 5 – polaroplast lameralny (lameral polaroplast); 6 – polaroplst tubularny (tubular polaroplast); 7 – włókno biegunowe (polar filament, po wystrzeleniu nazywane nicią biegunową, polar tube); 8 – aparat jądrowy, złożony z dwu blisko siebie położo-nych jąder (diplokarya, binucleate); 9 – wakuola tylna (posterior vacuole)
Omawiając budowę ściany komórkowej należałoby zwrócić uwagę na pewne nieścisłości związane z in-formacjami podawanymi na temat ogólnej budowy zarodników. Po pierwsze, ściana komórkowa zarod-ników składa się z dwóch warstw zwanych egzosporą i endosporą. Nie są to nazwy błędne i często wystę-pują w literaturze, ale w chwili obecnej powinny być raczej zmieniane na endosporium i egzosporium (55), obydwa terminy (egzospora, endospora) odnoszą się bowiem do sposobu powstawania zarodników, a nie do budowy ścian komórkowych. Po drugie, opisy budo-wy ścian komórkobudo-wych gatunków z rodzaju Nosema są w dalszym ciągu dość pobieżne, chociaż budowa ścian innych przedstawicieli mikrosporydiów jest względnie dobrze poznana. Biorąc pod uwagę dane, które charakteryzują inne rodzaje organizmów z tej grupy, można przyjąć, że grubość warstwy zewnętrznej (egzosporium) wynosi ok. 200 nm i składa się głównie z białek, natomiast grubości warstwy wewnętrznej (endosporium) ok. 100 nm i jest ona zbudowana z białek i α-chityny. Warstwa wewnętrzna tworzona jest sukcesywnie podczas wzrostu zarodnika, aż do jego dojrzałości (97).
Budowa ściany komórkowej powinna być pod-dana szczegółowym badaniom, gdyż nasuwają się pewne wątpliwości i pytania dotyczące jej struktury. Jeśli organizmy te zaliczamy do grzybów, to należy pamiętać, że budowa ściany komórkowej grzybów jest już bardzo dobrze poznana. Jest to ściana dość cienka, ale wielowarstwowa, a każda warstwa składa się ze ściśle określonych związków chemicznych (np. chityny, chitozanu, glukanów itp.). Niektóre grupy, np. obligatoryjnie symbiotyczne Glomeromycota mają wyjątkowo skomplikowaną budowę ściany zarodni-ka, ale przy tym także doskonale zbadaną, dlatego podobne badania powinny być wykonane także dla tej grupy organizmów. Ważne jest przy tym, czy ściana komórkowa jest rzeczywiście wielowarstwowa (czyli podobna do komórki grzybowej, do której to grupy zalicza się te organizmy), czy może jednak tworzy osłonę protoplastu na kształt grubego, białkowo-chi-tynowego pancerza, co sugerowałoby przynależność do jakiejś innej grupy organizmów, chociaż obecnie nieokreślonej. Doświadczenia laboratoryjne związane z miażdżeniem zarodników (w tym ścian komórko-wych) w niskich temperaturach wskazują na jej war-stwowy rozpad (97).
Dokładne badania biochemiczne ścian komórko-wych są ważne nie tylko ze względów poznawczych, ale także praktycznych. Mogą być punktem wyjścia do stworzenia prostych, ale czułych testów identyfikacyj-nych (diagnostyczidentyfikacyj-nych), mających na celu rozpozna-wanie poszczególnych gatunków patogenów, a tym samym lepsze zgłębienie samego procesu patogenezy, walki z chorobami, a być może także zrozumienie zróżnicowanego zachowania się pszczół porażonych różnymi gatunkami pasożytów.
Ściana komórkowa sama w sobie nie jest materią martwą, lecz miejscem lokalizacji wielu różnych
związków organicznych (białek, enzymów) oraz nieorganicznych. Pierwsze reakcje rozpoznawcze, jakie zachodzą pomiędzy patogenem i żywicielem, dotyczą związków zlokalizowanych w zewnętrznych warstwach komórki, m.in. właśnie w ścianach ko-mórkowych. W tym względzie dobrze rozpoznane są tzw. elicytory roślinne (elicitors), które wzbudzają reakcje odpornościowe roślin podczas infekcji pato-genem grzybowym (89). Obligatoryjność związku patogenicznego czy specjalizacja względem żywiciela związana jest m.in. z wybiórczością, czyli reakcjami eliminującymi diaspory innych gatunków powszechnie występujących w środowisku. Jak się wydaje, powo-dzenie procesu zakażenia organizmów żywicielskich także zależy od „rozpoznania” środowiska, w którym w danym momencie znajdują się zarodniki gotowe do infekcji.
Protoplast. Pod endosporium znajduje się jednolita
błona komórkowa (plazmalemma), która otacza wnę-trze zarodnika, czyli protoplast. Można go podzielić na dwie funkcjonalne części:
1. Pierwsza część protoplastu to tzw. sporoplazma (sporoplasm), której głównym elementem jest aparat jądrowy, składający się z dwóch ściśle do siebie przy-legających jąder. W niektórych artykułach publikowa-nych w języku polskim określa się je mianem jąder sprzężonych, czyli dikariotycznych. Budowa jądra komórkowego to kolejna, nie do końca poznana cecha omawianej grupy mikrosporydiów, ale określenie „di-kariotyczny” nie jest tutaj odpowiednie. Jądra dikario-tyczne są charakterysdikario-tyczne dla grzybów właściwych (wyższych), czyli dla podstawczaków (Basidiomycota) oraz workowców (Ascomycota). Dikariofaza tworzy się w wyniku procesu płciowego, u podstawczaków w procesie somatogamii, a u workowców w proce-sie gametangiogamii. Po plazmogamii nie następuje jednak kariogamia, lecz dwa jądra ustawiają się obok i po kolejnych podziałach mitotycznych przekazywa-ne są do powstających komórek. Oba jądra (do czasu kariogamii) są haploidalne. Jest to stadium, którego dotychczas nie stwierdzono u żadnej innej grupy organizmów. Z powyższych powodów wymienione grupy grzybów zalicza się w obecnej systematyce do podkrólestwa Dikarya w królestwie Fungi (37).
U gatunków z rodzaju Nosema komórki są diploidal-ne, ale procesu płciowego dotychczas nie stwierdzono, więc nie jest to „prawdziwe” stadium dikariotyczne (dikarya), właściwe grzybom. Skąd się biorą dwa ze-spolone ze sobą jądra i jak się tworzą, dokładnie nie wyjaśniono. Gisder i wsp. (32) podają, że w czasie procesu merogonii i sporogonii Nosema apis i Nosema
ceranae posiadają fazę zwaną „diplokaryotic stage”,
a jądra określają mianem „diplokarya”. Oba pojęcia określają więc to stadium jako dwujądrowe, ale nie dikariotyczne. Odpowiednim określeniem jest tu również użycie słowa „binucleate”, czyli dosłownie „dwujądrowy”. Obecność dwóch jąder sugeruje ważną właściwość komórki, jaką jest utrzymanie podwójnych
zasobów genowych. Jądra te szybko się namnażają, a duplikacja chromatyny zachodzi kilkanaście razy przed kariokinezą. To pozwala tym organizmom na szybką reprodukcję w organizmie żywiciela.
2. Drugą część protoplastu stanowi tzw. aparat eks-truzyjny (extrusion apparatus), czasami nazywany aparatem inwazyjnym (invasive apparatus). Wysoko wyspecjalizowany aparat ekstruzyjny służy do wy-strzelenia nici biegunowej (polar tube) w kierunku komórki gospodarza. Składa się on z bardzo długiej cy-lindrycznej struktury określanej jako włókno bieguno-we (polar filament), które w przednim końcu zarodnika (anterior) jest przyczepione do dysku kotwiczącego (anchoring disk lub rzadziej polar sac), a w jego części tylnej (posterior) jest okręcone dokoła wakuoli oraz polaroplastu. Podczas zakażenia sporoplazma wraz z zawartością jest wstrzykiwana przez nić biegunową do komórki gospodarza (52, 101, 103).
W komórce zarodnika występują ponadto rybosomy i błony retikulum endoplazmatycznego, natomiast brak jest diktiosomów i aparatów Golgiego.
Pozycja taksonomiczna
Opisane powyżej cechy, pomimo pewnych wąt-pliwości, wskazują na dość dobre poznanie budowy zarodników Nosema spp. pod względem strukturalnym oraz funkcjonalnym, natomiast braki dotyczą wiedzy na temat ich właściwości biochemicznych oraz gene-tycznych. Kolejna trudność, to ogromna jednorodność budowy struktur wegetatywnych organizmów mikro-skopijnych. Dokładniejsze poznanie cech w zakresie morfologii może być użytecznym elementem uzupeł-niającym diagnostykę gatunków oraz ustalenie ich pozycji taksonomicznej.
W znanej światowej bazie danych (Index Fungorum) wyszczególniono dotychczas 83 gatunki należące do rodzaju Nosema (http://www.indexfungorum.org/ Names 2013), nie jest więc to grupa liczna, ważne jest jednak, że zaledwie 49 gatunków zostało poprawnie opisanych pod względem taksonomicznym. Pozostałe 34 gatunki nie mają formalnie uznanych opisów (diag- noz) gatunkowych, a przy nazwach brak nazwisk osób, które je opisały. Co ciekawsze, do gatunków takich należy m.in. Nosema ceranae, gatunek często opisywany w aktualnej literaturze. Wyniki otrzymane z analizy molekularnych wskazują, że Nosema to ro-dzaj polifiletyczny. Część gatunków zaliczana wcześ- niej do rodzaju Nosema obecnie klasyfikowana jest pod innymi nazwami rodzajowymi. Dotyczy to m.in. takich gatunków, jak: Antonospora locustae, Brachiola
algerae, Paranosema grylli czy Vittaforma corneae.
Klasyfikacja podana w pracy Sprague i Becnel (86, 87) dotycząca większości gatunków z rodzaju Nosema przedstawia się następująco:
Królestwo: Fungi – Protozoa
Typ: Microsporidia (Balbiani 1882) Podrząd: Apansporoblastina Rodzina – Nosemidae
Rodzaj – Nosema
Według Index Fungorum przynależność poszcze-gólnych gatunków do określonych jednostek tak-sonomicznych nie jest jednak jasno zdefiniowana i pewna. W omawianym systemie przy jednostkach niepewnych spotykamy często nazwę Incertae sedis, czyli takson niepewny. Poniżej podano przykłady kla-syfikacji dwóch różnych gatunków oraz zaznaczone wątpliwości.
Vittaforma corneae (= Nosema corneum)
Incertae sedis, Microsporida, Incertae sedis, Micro-
sporea, Incertae sedis, Microsporidia, Protozoa
Nosema apis
Nosematidae, Microsporida, Incertae sedis, Micro-
sporea, Incertae sedis, Microsporidia, Protozoa W klasyfikacji stosowanej w Index Fungorum zwra-ca uwagę przynależność Nosema spp. do królestwa Protozoa. W jednostce tej zgrupowane są organizmy zaliczane do grzybów (w szerokim rozumieniu tego słowa), ale bez przynależności do grzybów właści-wych (true fungi). Grupa grzybów klasyfikowana w obrębie Protozoa określana jest mianem organizmów grzybopodobnych (lub pseudogrzybów; fungus-like organisms).
Na uwagę zasługuje natomiast najnowszy system zaprezentowany w pracy Hibbetta i wsp. (37). W sys-temie tym zdecydowano się wydzielić Microsporidia jako takson wysokiej rangi (typ = gromada) w obrę-bie grzybów właściwych (królestwo Fungi). Autorzy mają jednak co do tego poważne wątpliwości. Nie przedstawiają więc szerszego uzasadnienia tej decyzji, sugerując, że pozycja taksonomiczna może ulec zmia-nie. Nie podają też żadnych danych, co do wewnętrz-nego podziału tej jednostki na taksony niższe rangą. Główną przyczyną jest brak dokładnych wyników badań.
Ważna i obowiązująca jest też klasyfikacja podawa-na w kolejnych wydaniach słownika mykologicznego „Dictionary of fungi”. W dziewiątym wydaniu stwier-dza się dość enigmatycznie, że mikrosporydia należą „albo do Protozoa, albo do Fungi” (54). W ostatnim, obowiązującym do chwili obecnej dziesiątym wy-daniu (55) stwierdza się natomiast, że organizmy te „wcześniej klasyfikowane były jako Protozoa, obecnie zazwyczaj jako Fungi”.
Problemy taksonomii tych organizmów są jednym z ważniejszych aktualnych tematów badawczych. Cała grupa mikrosporydiów liczy obecnie ok. 1300 gatunków (55), ale zapewne jest znacznie większa. Ze względu na fakt, że są to organizmy obligatoryjnie biotroficzne, potencjalnie każde zwierzę może być żywicielem odrębnego, „własnego” gatunku pato-gena. Przypuszcza się więc, że liczba gatunków mi-krosporydiów przekracza liczbę wszystkich zwierząt (ok. 1 miliona) i może osiągnąć nawet 1,5 miliona. Obecnie liczba ta przypisywana jest liczbie wszyst-kich gatunków grzybów możliwych do odkrycia na świecie (35).
Zarys biologii rozwoju
Sposób zakażenia. Zakażenie żywiciela oraz roz-
wój biologiczny gatunków z rodzaju Nosema jest dość skomplikowany. W warunkach naturalnych (poza labo-ratorium) po dojrzeniu zarodników proces zakażenia zaczyna się od wystrzelenia nici biegunowej, a na-stępnie transferu materiału genetycznego do wnętrza komórek gospodarza. Proces ten możemy podzielić na 4 etapy:
a) aktywacja wystrzelenia nici biegunowej przez odpowiednie stymulanty,
b) wzrost ciśnienia wewnątrz zarodnika,
c) wystrzelenie nici biegunowej przez wywinięcie jej na zewnątrz,
d) przepływ sporoplazmy przez nić infekcyjną do komórki gospodarza.
Aktywacja dojrzewania zarodników in vitro może być reakcją na zmianę pH, dodanie różnych kationów i anionów, H2O2 czy małe dawki UV. Pierwszą oznaką aktywacji zarodników (przed wystrzeleniem nici bie-gunowej) jest pojawienie się uwypuklenia (protrusion) ściany zarodnika na jego przednim, cieńszym biegunie. Następnie nić biegunowa gwałtownie wyrzucana jest na zewnątrz na zasadzie wywinięcia (porównywalnego do „wywinięcia palców w rękawiczce”) (97).
Wystrzelona nić biegunowa ma różną długość (od 50 do 500 µm), a tym samym może być nawet 100 razy dłuższa od samego zarodnika. Kiełkowanie za-rodnika trwa krócej niż 2 s, a koniec nici biegunowej może poruszać się z szybkością osiągającą 100 µm/s. Kiedy nić biegunowa jest całkowicie rozwinięta, ciś- nienie wewnątrz zarodnika przepycha sporoplazmę przez całą długość nici. Ciśnienie to wywoływane jest przez rozprężającą się gwałtownie strukturę wa-kuolarną (posterior vacuole) znajdującą się na tylnym biegunie zarodnika, która początkowo niewielka, w efekcie końcowym wypełnia niemal całe wnętrze zarodnika (ryc. 1) (102). Chociaż nić biegunowa jest dosyć wąska (0,1-0,25 µm średnicy), to sporoplazma przechodzi przez nią bardzo szybko i można ją zaob-serwować na końcu nici już po 15-200 ms. Po przebiciu komórki gospodarza przez nić biegunową sporoplazma kierowana jest wprost do
cytoplazmy. Błona plaz- matyczna natomiast zo-staje w pustym zarodniku (ryc. 2) (29, 95, 96, 101).
Cykl życiowy. Po
wstrzyknięciu do komór-ki gospodarza infekcyjnej sporoplazmy, przekształ-ca się ona w meronta, a Nosema wchodzi w fazę merogonii (proliferacji komórek). Kształt meron-tów jest najczęściej wrze-cionowaty, przy czym
u Nosema apis spotkane są również komórki o kształ-tach okrągłych lub owalnych. W trakcie namnażania wewnątrz komórek gospodarza meronty nie tworzą żadnej błony (ani parazytoforusa, ani sporoforusa) i lokalizują się bezpośrednio w cytoplazmie komórek żywiciela (47). Następny etap rozwoju to faza sporo-gonii, w której meronty przekształcają się w sporonty otoczone gęstą błoną komórkową. Po podziałach spo-ronty przekształcają się w tzw. sporoblasty, w których następuje formowanie grubej ściany komórkowej, co jest jednocześnie połączone ze stopniowym tworze-niem się aparatu ekstruzyjnego. Końcowy etap rozwoju to przekształcenie sporoblastów w dojrzałe zarodniki, które są uwalniane do światła jelita. Zarodniki kiełkują i mogą infekować nowe komórki jelita, kontynuując cykl wewnątrz ciała tego samego osobnika żywiciel-skiego lub są wydalane z kałem (24, 28). Cykl życiowy
Nosema ceranae jest dosyć krótki i trwa ok. 3-4 dni,
podczas gdy u N. apis jest prawdopodobnie nieznacz-nie dłuższy (32, 41).
Zakażenie chorobą następuje po zjedzeniu zarod-ników Nosema, które znajdują się w dużych ilościach w odchodach wydalanych przez chore pszczoły. Kał chorych pszczół zawiera wiele niestrawionych cukrów, dlatego jest chętnie zlizywany przez pszczoły zdrowe. Zakażenie może również przenosić się w wyniku kar-mienia zdrowych larw przez osobniki chore. Możliwe jest, że ta właśnie droga transmisji patogena przyspie-sza rozprzestrzenianie się nosemozy (85), zwłaszcza w przypadku N. ceranae, która nie wywołuje biegunki u pszczół. Pszczoły silnie porażone umierają bardzo szybko, w zależności od rasy w ciągu 8-10 dni (73).
Wpływ zakażenia na funkcje życiowe Apis mellifera
Rozprzestrzenianie się choroby. Nosema apis i N. ceranae rozwijają się u trzech kast pszczół, tj.
u robotnic, matek i trutni. Wiele badań wskazuje na to, że w obrębie rodziny pszczelej zbieraczki są bardziej narażone na zakażenie niż pszczoły ulowe (10, 40, 57, 62, 67, 84), chociaż wyniki badań prowadzonych przez Traver i wsp. (94) nie wykazały żadnych znaczących różnic w zakresie zakażenia między poszczególnymi pszczołami.
Nosema apis i N. ceranae rozwijają się głównie
wewnątrz komórek nabłonka jelita środkowego do-rosłych pszczół, ale mogą też mieć inną lokalizację, rozprzestrzeniając się w ciele żywiciela. Zakażenie wywoływane przez N. apis ogranicza się w zasadzie do nabłonka jelita środkowego pszczół dorosłych (26, 33), natomiast obecność N. ceranae stwierdzano także w innych tkankach lub gruczołach, np. w cewkach Malpighiego, w gruczołach gardzielowych, śliniankach czy ciele tłuszczowym (16, 32, 78).
Podczas namnażania patogen uszkadza komórki nabłonka jelita, co ogranicza wchłanianie składników pokarmowych, zwiększa zapotrzebowanie energe-tyczne oraz może powodować biegunkę i spadek produkcji czerwiu (27, 65). Choroba powoduje także
Ryc. 2. Zarodniki Nosema sp. obserwowane w kontraście interferencyjnym (DIC)
Objaśnienie: * – wygląd za-rodnika po wystrzeleniu nici biegunowej
spadek poziomu białka w organizmie pszczół, co prowadzi do atropii gruczołów gardzielowych (100), a jednocześnie zmienia skład kwasów tłuszczowych w hemolimfie (80).
Choroba wywoływana przez N. ceranae nazywana jest nosemozą typu „C” (tzw. suchą) i jest bardziej wyniszczająca zarówno dla pojedynczych pszczół, jak i dla całych rodzin pszczelich, podczas gdy nosemoza typu „A” powodowana przez N. apis ma przebieg łagodniejszy (38, 40, 64, 75). Mimo to pszczoły za-każone N. apis mają zmniejszoną efektywność meta-boliczną ze względu na degenerację nabłonka jelita, co wiąże się z mniejszym wydzielaniem enzymów trawiennych oraz słabszym wchłanianiem substancji odżywczych. Wykazano również, że wole i jelito środ-kowe zakażonych pszczół są mniejsze w porównaniu z pszczołami zdrowymi (65).
Część zarodników nie jest wydalana z ciała pszczół w sposób bezpośredni, lecz pozostaje w gruczołach. Wówczas są one potencjalnym rezerwuarem kolejnych zakażeń (20, 78). W tym przypadku choroba przeno-szona jest w sposób horyzontalny w rodzinie pszczelej i może prowadzić do infekcji matki i trutni. Taki sposób przenoszenia został potwierdzony dla chorób wiru-sowych (np. 5, 6, 15, 83), więc najprawdopodobniej zachodzi również w przypadku nosemozy.
Rodzina pszczela może prawidłowo funkcjonować tylko wtedy, gdy matka jest zdrowa i zdolna do skła-dania dużej liczby zapłodnionych jaj (9). Porażenie
N. ceranae prowadzi do zmian w produkcji
fero-monów, których skutkiem jest najprawdopodobniej wymiana matki (2). U matki, oprócz zmian w jelicie, porażenie powoduje też zmiany anatomiczne jajników, które tracą swoje funkcje, a matka staje się bezpłodna. Obniżeniu ulega m.in. zdolność do przeprowadzania plemników do zbiorniczka nasiennego. Jaja składane przez matkę także mogą ulec zakażeniu, tracąc zdol-ność do rozwoju. Wówczas dochodzi do ich zamierania i zjadania przez inne pszczoły. W rodzinie pszczelej obserwujemy wówczas tzw. czerw rozstrzelony.
Matka może być zarażona także przez kontakt z chorymi robotnicami, stając się nosicielką choroby (23). Istotny jest przy tym tzw. próg infekcyjny, który określa minimalną liczbę zarodników, które są w stanie przełamać barierę odporności żywiciela. Minimalna liczba zarodników powodująca nosemozę u matek wy-nosi ok. 1000, nie jest to więc liczba zbyt wysoka, bio-rąc pod uwagę bardzo małe rozmiary patogena i jego szybki rozwój. Przy zwiększeniu liczby zarodników do 2000 matki wykazują kliniczne objawy choroby (22, 30, 60, 105). Robotnice są znacznie bardziej podatne na infekcję i ulegają zakażeniu po spożyciu znacznie mniejszej liczby, bo od 20 do 90 zarodników (7, 26).
Zarodniki N. ceranae odnajdowano w stanie na-turalnym zarówno u niedojrzałych, jak i dojrzałych trutni (93). Po eksperymentalnym zakażeniu trutni przez N. apis nie stwierdzono jednak, by przebieg choroby wpływał na wcześniejsze dojrzewanie i
szyb-sze podejmowanie lotów godowych przez te osobniki (90). Zakażone trutnie, które często przemieszczają się pomiędzy rodzinami, sprawiają, że nosemoza roz-przestrzenia się pomiędzy różnymi rodzinami w jednej pasiece, a nawet pomiędzy pasiekami (93).
Wzajemne oddziaływania między patogenem a żywicielem
Mikrosporydia, w tym gatunki z rodzaju Nosema, podobnie jak inne obligatoryjne pasożyty, konkurują ze swoim gospodarzem o pożywienie, wywierając na niego silny stres energetyczny. Wyróżnia się dwa mechanizmy wywołujące taki stres. Pierwszy polega na tym, że patogen w sposób bezpośredni pobiera energię zgromadzoną w ATP gospodarza. W drugim przypadku ogromną stratą energii (czyli procesem wysokoenergetycznym) jest sam proces obrony przed pasożytem, polegający na wytworzeniu odpowiedzi immunologicznej na zakażenie (81). Niektórzy ba-dacze uważają, że gatunki z rodzaju Nosema mogą również przyswajać cukry bezpośrednio z komórek nabłonka jelita gospodarza (38).
Mikrosporydia są całkowicie uzależnione od energii wytwarzanej przez gospodarza ze względu na brak własnych funkcjonalnych mitochondriów, a jedynie obecność struktur do nich podobnych (1). W zakaża-nych komórkach są więc otaczane przez mitochondria gospodarza, co ułatwia pobór energii z ATP wytwo-rzonej podczas metabolizmu komórkowego żywiciela. Pobór przez pasożyta energii gospodarza wyraża się zwiększeniem pobierania pokarmu przez zakażone owady przy niższym zużyciu przez nie tlenu (63).
Większa wirulencja N. ceranae, której skutkiem jest wzmożona śmiertelność pszczół, jest wywoła-na stresem energetycznym, spowodowanym przez zmniejszone lub też zahamowane wchłanianie sub-stancji odżywczych z powodu silniejszej degradacji komórek jelita (38, 63). Wyższy stres energetyczny powodowany przez Nosema ceranae wykazano też podczas badań prowadzonych w testach klatkowych na zbieraczkach (65). Bardziej agresywne niszczenie komórek jelita przez ten gatunek zostało również stwierdzone w procesie zakażeń robotnic i matek występujących w warunkach naturalnych. Przy braku leczenia skutkowało to czasami wymieraniem całych rodzin (40).
Silniejszy stres energetyczny powodowany przez
N. ceranae w porównaniu do N. apis może być
zwią-zany z obniżeniem odporności zakażonych pszczół. Krótkoterminowe okresy niedożywienia powodują osłabienie systemu immunologicznego, czego rezul-tatem jest zmniejszona odporność widoczna podczas walki z chorobą. Interesujące jest to, że gdy N. apis powoduje aktywację systemu odpornościowego, N.
ce-ranae jest przyczyną immunosupresji (4). Podobne
właściwości immunosupresyjne obserwuje się także podczas porażenia pszczół przez pajęczaki z rodzaju
Zwiększony poziom stresu energetycznego może wyjaśniać zmiany w sposobie zachowania porażonych pszczół spowodowane niedożywieniem, brakiem zdol-ności termoregulacyjnych oraz wyższym stopieniem trofalaksji, czyli wymiany pokarmu pomiędzy osobni-kami. Obserwacje dotyczące trofalaksji nie są jednak jednoznaczne, gdyż – z jednej strony – głodne pszczoły częściej proszą o jedzenie, z drugiej strony – ten sam głód powoduje, że niechętnie dzielą się jedzeniem z innymi osobnikami (70). Mechanizm ten może być jednak jednym ze sposobów transmisji patogenów, a tym samym wzmożonej śmiertelności pszczół.
Warto podkreślić, że stres energetyczny obserwo-wano u chorych pszczół utrzymanych w idealnych warunkach temperaturowych i wilgotnościowych. W warunkach naturalnych kombinacja różnych czynni-ków środowiskowych bardziej negatywnie wpływa na pszczoły. W dni chłodne i wietrzne zbieraczki potrze-bują więcej energii, by utrzymać loty po pyłek i nek-tar. Również subletalne dawki pestycydów powodują dalsze podwyższenie stresu energetycznego u pszczół porażonych N. ceranae (2). Szczególne znaczenie ma to dla zbieraczek, które mają zwiększone zapotrzebo-wanie energetyczne ze względu na wydatki energii podczas latania. Stres energetyczny ponadto jest przyczyną słabej termoregulacji u zakażonych pszczół, które szybciej się wyziębiają i częściej szukają ciepłej lokalizacji wewnątrz rodziny pszczelej. To osłabienie zdolności termoregulacyjnych zwiększa prawdopodo-bieństwo hipotermii u zbieraczek i może prowadzić do ich śmierci poza ulem (13). Badania zmian w poziomie cukrów u pszczół zdrowych i chorych, wykazały, że zakażone zbieraczki mogą latać tylko ⅔ tego dystansu, co pszczoły zdrowe (66). Środowisko życia powoduje dodatkowy stres energetyczny u zbieraczek, wpływając na dalsze zmniejszanie odległości ich lotów (70).
Zakażenie nosemozą ma wpływ nie tylko na po-szczególne zbieraczki, ale na całą rodzinę. U pszczół, podobnie jak u innych owadów społecznych, zbieranie pokarmu jest regulowane nie tylko przez wymagania rodziny, ale również przez poziom głodu poszczegól-nych osobników. Silniejszy głód osobniczy powoduje wzmożone zbieranie pyłku i nektaru, przez co pośred-nio przyczynia się do horyzontalnej transmisji choroby, poprzez pozostawianie zarodników Nosema spp. na kwiatach w obrębie większego areału, co wykazano w badaniach dotyczących trzmieli (19). Stres pokar-mowy najprawdopodobniej reguluje również poziom witelogeniny, powodując, że zakażone pszczoły wcze-śniej rozpoczynają loty po pożytek (3). Możliwe jest też umieranie zbieraczek z głodu poza ulem w sytuacji, gdy nie są zdolne do powrotu (65, 70). Potwierdzają to badania Higes i wsp. (40), podczas których silnie zakażone zbieraczki były odnajdowane martwe daleko od rodziny pszczelej.
Gdy młode pszczoły zaczynają wcześniej zbieranie pożytku w celu zrekompensowania utraty dostęp-nych zbieraczek, modyfikowany jest cały polietyzm
wiekowy pszczół w rodzinie (100). Rekompensata tego typu skraca ogólny czas życia dorosłych pszczół (82), ich skuteczność jako zbieraczek, a także powo-duje skrócenie czasu, jaki pszczoły poświęcają na wzrost rodziny pszczelej. Poprzez takie przesunięcia pogorszeniu ulega opieka nad czerwiem ze względu na zmniejszenie dostępności pszczół pielęgnujących czerw, co z kolei zwiększa ryzyko jego chorób (36). Gdy rodzina pszczela osiąga punkt, w którym nie da się utrzymać wymiany pszczół starych (zakażonych nose-mozą) młodymi, czyli gdy powstają braki w kolejnych pokoleniach pszczół, dochodzi do depopulacji rodziny pszczelej i jej zamierania (10, 12, 40, 42, 43, 53).
Leczenie pszczół porażonych nosemozą
Zwalczanie zarodników Nosema spp. jest wyjątkowo utrudnione. Po zanurzeniu w miodzie zarodniki zacho-wują swoją żywotność do 4 miesięcy, w pszczelim kale do ok. 1 roku, natomiast w martwych pszczołach ponad 4 lata (72). Zanieczyszczony kałem wosk, zwłaszcza w plastrach wykorzystywanych do wychowu czerwiu oraz inne zanieczyszczone powierzchnie wnętrza ula zapewniają wystarczające warunki dla zachowania długiej żywotności zarodników Nosema spp.
W chwili obecnej jedynym skutecznym lekarstwem w zwalczaniu nosemozy jest fumagilin wytwarzany przez Aspergillus fumigatus, gatunek należący do grzybów (Fungi). Powoduje on nieodwracalną inak-tywację aktywności enzymatycznej MetAP2 (amino-peptydaza metioninowa-2) i jest silnym inhibitorem proliferacji. Podczas podawania leku jesienią i zimą nie obserwowano przechodzenia jego metabolitów do miodu zebranego wiosną i latem (71). Nie jest to jed-nak proces jednoznacznie potwierdzony, dlatego Unia Europejska zabroniła używania tego leku. Od tego czasu prowadzone są intensywne badania nad alterna-tywnymi sposobami zwalczania nosemozy. Badaniom poddaje się m.in. suplementy diety (np. resveratrol), olejki eteryczne (np. tymol) oraz ekstrakty roślinne, których dodatek do syropu cukrowego łagodzi przebieg nosemozy (np. 61, 69, 77). Nie jest jednak wykluczo-ne, że badania powinny pójść ponownie w kierunku analizy związków wytwarzanych przez inne grzyby, ze względu na wysoki stopień relacji antagonistycznych pomiędzy tymi organizmami.
Na uwagę zasługuje fakt, że stopień zakażeń nose-mozą jest dużo niższy wśród pszczół dziko żyjących w porównaniu z pszczołami utrzymywanymi w pa-siekach. Nie jest wykluczone, że błędy w gospodarce pasiecznej i handel pszczołami w znaczącym stopniu wpływają na rozprzestrzenienie nosemozy (62), dla-tego w ograniczaniu choroby niezmiernie ważne jest higieniczne utrzymywanie rodzin pszczelich, ale także znajomość całego procesu chorobowego i czynników ją wywołujących. Skutkiem bezpośrednim choroby jest oczywiście masowe ginięcie pszczół. Skutki pośred-nie to – z jednej strony – ogromne straty materialne w gospodarce, jak spadek wytwarzania miodu i innych
produktów pszczelich, a także żywności, środków medycznych, kosmetyków itp. Straty tego typu da się jednak ocenić w sposób wymierny, przynajmniej sza-cunkowy. Z drugiej strony natomiast – są to niedające się ocenić straty w przyrodzie ożywionej związane z brakiem zapylaczy. Tu wystarczy przytoczyć znane i wciąż aktualne powiedzenie Alberta Einsteina: „jeśli pszczoły znikną, wkrótce to samo stanie się z ludźmi”.
Piśmiennictwo
1. Agnew P., Koella J. C.: Virulence, parasite mode of transmission, and host fluctuating asymmetry. Proceed. Royal Soc. London B: Biological Sciences 1997, 264, 9-15.
2. Alaux C., Brunet J. L., Dussaubat C., Mondet F., Tchamitchan S., Cousin M.,
et al.: Interactions between Nosema microspores and a neonicotinoid weaken
honeybees (Apis mellifera). Environ. Microbiol. 2010, 12, 774-782. 3. Amdam G. V., Omholt W.: The hive bee to forager transition in honeybee
colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 2003, 223, 451-464. 4. Antúnez K., Martín-Hernández R., Prieto L., Meana A., Zunino P., Higes M.:
Immune-suppression in the honey bee (Apis mellifera) following infection by Nosema ceranae (Microsporidia). Environ. Microbiol. 2009, 11, 2284-2290. 5. Bailey L.: Honey bee pathology. Annu. Rev. Entomol. 1968, 13, 191-212. 6. Bailey L.: The epidemiology and control of Nosema disease of the honeybee.
Ann. Appl. Biol. 1955, 43, 379-389.
7. Bailey L.: The preservation of infective microsporidian spores. J. Invert. Pathol. 1972, 20, 252-254.
8. Borsuk G., Olszewski K., Strachecka A., Paleolog J., Kasperek K.: Genetic and morphometric variation of the Varroa destructor developing in standard and small comb cells. Vet. Med. – Science and Practice. 2012, 68, 599-602. 9. Borsuk G.: Przegląd wybranych zagadnień z badań etologicznych
w pszczelarstwie. Kosmos 2011, 60, 401-413.
10. Botías C., Martín-Hernández R., Días J., García-Palencia P., Matabuena M.,
Juarranz A., et al.: The effect of induced queen replacement on Nosema spp.
infection in honey bee (Apis mellifera iberiensis) colonies. Environ. Microbiol. 2012, 14, 845-859.
11. Botías C., Martín-Hernández R., Garrido-Bailón E., Higes M., Anderson D. L.: Nosema ceranae is able to infect different Apis species, Proc. 41st Congress
Apimondia, Montepellier 2009, s. 161.
12. Botías C., Martín-Hernández R., Meana A., Higes M.: Negative effects of Nosema infection in honey production and vitality of honey bee (Apis mel-lifera) colonies in Spain. EURBEE, 4th European Conference of Apidilogy. (Edited by Meral Kence), 7-9 September 2010, Ankara, Turkey.
13. Campbell J., Kessler B., Mayack C., Naug D.: Behavioural fever in infected honeybees: parasitic manipulation or coincidental benefit? Parasitology 2010, 137, 1487-1491.
14. Chaimanee V., Waritt N., Chantawannakul P.: Infection of Nosema ceranae in four different honeybee species. J. Invert. Pathol. 2010, 105, 207-210. 15. Chen Y., Evans J., Feldlaufer M.: Horizontal and vertical transmission of
viruses in the honey bee, Apis mellifera. J. Invert. Pathol. 2006, 92, 152-159. 16. Chen Y. P., Evans J. D., Murphy C., Gutell R., Zuker M., Gundensen-Rindal D.,
Pettis J. S.: Morphological, molecular, and phylogenetic characterization of
Nosema ceranae, a microsporidian parasite isolated from the European honey bee, Apis mellifera. J. Eukaryot. Microbiol. 2009, 56, 142-147.
17. Chen Y. P., Hen Y., Evans J. D, Smith I. B., Pettis J. S.: Nosema ceranae is a long-present and wide-spread microsporidian infection of the European honey bee (Apis mellifera) in the United States. J. Invert. Pathol. 2008, 97, 186-188. DOI: 10.1016/j.jip.2007.07.010.
18. Chen Y. P., Huang Z. Y.: Nosema ceranae, a newly identified pathogen of Apis mellifera in the USA and Asia. Apidologie 2010, 41, 364-374.
19. Colla S. R., Otterstatter M. C., Gegear R. J., Thomson J. D.: Plight of the bum-blebee: Pathogen spillover from commercial to wild populations. Biological Conservation. 2006, 129, 461-467.
20. Copley T. R., Jabaji S. H.: Honeybee glands as possible infection reservoirs of Nosema ceranae and Nosema apis in naturally infected forager bees. J. Appl. Microbiol. 2012, 112, 15-24.
21. Cornman R. S., Chen Y. P., Schatz M. C., Street C., Zhao Y., et al.: Genomic analyses of the microsporidian Nosema ceranae, an emergent pathogen of honey bees. PLoS Pathog. 2009, 5, e1000466.
22. Czekońska K.: Ocena ryzyka inwazji pasożyta Nosema apis u matek pszczoły miodnej (Apis mellifera L.) izolowanych w klateczkach. Rozprawa habilita-cyjna. Zeszyty Naukowe Akademii Rolniczej w Krakowie 2003, 291, 1-52. 23. Czekońska K.: The influence of Nosema apis on young honeybee queens and
transmission of the disease from queens to workers. Apidologie 2000, 31, 701-706.
24. Delbac F., Polonais V.: The Microsporidian Polar Tube and Its Role in Invasion, [w:] Burleigh B. A., Soldati-Favre D. (eds.): Molecular Mechanisms of Parasite Invasion. 2008, 208-220.
25. Edlind T. D., Li J., Visversvara G. S., Vodkin M. H., McLaughlin G. L., et
al.: Phylogenetic analysis of the b-tubulin sequences from amitochondriate
protozoa. Molecular Phylogenetics and Evolution. 1996, 5, 359-367. 26. Fries I.: Infectivity and multiplication of Nosema apis Z. in the ventriculus
of the honey bee. Apidologie 1988, 19, 319-328.
27. Fries I., Feng F., da Silva A., Slemenda S. B., Pieniazek N. J.: Nosema ceranae n sp (Microspora, Nosematidae), morphological and molecular characterization of a microsporidian parasite of the Asian honey bee Apis cerana (Hymenoptera, Apidae). Eur. J. Protistol. 1996, 32, 356-365.
28. Fries I., Granados R. R., Morse R. A.: Intracellular germination of spores of Nosema apis Z. Apidologie 1992, 23, 61-71.
29. Frixione E., Ruiz L., Santillan M., de Vargas L. V., Tejero J. M., Undeen
A. H.: Dynamics of polar filament discharge and sporoplasm expulsion by
microsporidian spores. Cell Motil. Cytoskelet. 1992, 22, 38-50.
30. Fyg W.: Anomalies and diseases of the queen honey bee. Annu. Rev. Entomol. 1964, 9, 207-224.
31. Giersch T., Berg T., Galea F., Hornitzky M.: Nosema ceranae infects honey bees (Apis mellifera) and contaminates honey in Australia, Apidologie 2009, 40, 117-123.
32. Gisder S., Hedtke K., Möckel N., Frielitz M. C., Linde A., Genersch E.: Five- -year cohort study of Nosema spp. in Germany: does climate shape virulence and assertiveness of Nosema ceranae? Appl. Environ. Microbiol. 2010, 76, 3032-3038.
33. Graaf D. de, Jacobs F. J.: Tissue specificity of Nosema apis. J. Invert. Pathol. 1991, 58, 277-278.
34. Gregory P. G., Evans J. D., Rinderer T., de Guzman L.: Conditional im-mune-gene suppression of honey bees parasitized by Varroa mites. J. Insect. Sci. 2005, 5-7.
35. Hawksworth D. L.: The fungal dimension of biodiversity: magnitude, signifi- cans, and conservation. Mycological Research. 1991, 95, 641-655. 36. Hedtke K., Jensen P. M., Jensen A. B., Genersch E.: Evidence for emerging
parasites and pathogens influencing outbreaks of stress-related diseases like chalkbrood. J. Invert. Pathol. 2011, 108, 167-173.
37. Hibbett D. S., Binder M., Bischoff J. F., Blackwell M., Cannon P. F., Eriksson
O. E., Huhndorf S., James T., Kirk P. M., et al: A higher-level phylogenetic
classification of the Fungi. Mycolog. Research. 2007, 111, 509-547. 38. Higes M., Garcia-Palencia P., Martin-Hernandez R., Meana A.: Experimental
infection of Apis mellifera honeybees with Nosema ceranae (Microsporidia). J. Invert. Pathol. 2007, 94, 211-217.
39. Higes M., Martín R., Meana A.: Nosema ceranae, a new microsporidian parasite in honey bees in Europe. J. Invert. Pathol. 2006, 92, 93-95.
40. Higes M., Martín-Hernández R., Botías C., Garrido Bailón E., González-Port
A. V., Barrios L., et al.: How natural infection by Nosema ceranae causes
honeybee colony collapse. Environ. Microbiol. 2008, 10, 2659-2669. 41. Higes M., Martín-Hernández R., Meana A.: Nosema ceranae in Europe: an
emergent type C nosemosis. Apidologie 2010, 41, 375-392.
42. Higes M., Meana A., Bartolomé C., Botías C., Martín-Hernánde R.: Nosema ceranae (Microsporidia), a controversial 21st century honey bee pathogen.
Environ. Microb. Rep. 2013, 5, 17-29.
43. Higes M., Nozal M. J., Álvaro A., Barrios L., Meana A., Martín-Hernández R.,
et al.: The stability and effectiveness of fumagillin in controlling Nosema cera-
nae (Microsporidia) infection in honey bees (Apis mellifera) under laboratory and field conditions. Apidologie 2011, 42, 364-377.
44. Hornitzky M.: A report for the Rural Industries Research and Development Corporations, Kingston, Australia, 2005, 1-16. http:/www.rirdc.gov.au/reports/ HBE/05-055.pdf
45. Huang W. F., Bocquet M., Lee K. C., Sung I. H., Jiang J. H., Chen Y. W., Wang
C. H.: The comparison of rDNA spacer regions of Nosema ceranae isolates
from different hosts and locations. J. Invert. Pathol. 2008, 97, 9-13. 46. Huang W. F., Jiang J. H., Wang C. H.: Nosema ceranae infection in Apis
mellifera. 38th Ann. Meeting Soc. Invert. Pathol. Anchorage, Alaska 2005.
47. Ironside J. E.: Multiple losses of sex within a single genus of Microsporidia. BMC Evol. Biol. 2007, 7, 48.
48. Keeling P.: Five Questions about Microsporidia. PLoS Pathog. 2009, 5, e1000489. doi:10.1371/journal.ppat.1000489
49. Keeling P. J., Doolittle W. F.: Alpha-tubulin from early-diverging eukaryotic lineages and the evolution of the tubulin family. Mol. Biol. Evol. 1996, 13, 1297-1305.
50. Keeling P. J., Fast N. M.: Microsporidia: Biology and evolution of highly reduced intracellular parasites. Ann. Rev. Microbiol. 2002, 56, 93-116. 51. Keeling P. J., McFadden G. I.: Origins of microsporidia. Trends Microbiol.
1998, 6, 19-23.
52. Keohane E. M., Weiss L. M.: The structure, function, and composition of the microsporidian polar tube, [w:] Wittnerv M., Weiss L. M. (eds.): The Microsporidia and Microsporidiosis. ASM Press, Washington, D.C. 1999, 196-224.
53. Khoury D. S., Myerscough M. R., Barron A. B.: A quantitative model of honey bee colony population dynamics. PLoS ONE 2011, 6, e18491.
54. Kirk P. M., Cannon P. F., David J. C., Stalpers J. A. (eds.): Ainsworth&Bisby’s Dictionary of the Fungi, 9th Edition. CABI Publishing 2001.
55. Kirk P. M., Cannon P. F., Minter D. W., Stalpers J. A. (eds.): Ainsworth&Bisby’s Dictionary of the Fungi. 10th Edition. CAB International, Wallingford, UK
2008.
56. Klee J., Besana A. M., Genersch E., Gisder S., Nanetti A., Tam D. Q., Chinh
T. X., Puerta F., Ruz J. M., Kryger P., Message D., Hatjina F., Korpela S., Fries I., Paxton R.: Widespread dispersal of the microsporidian Nosema
ceranae, an emergent pathogen of the western honey bee, Apis mellifera, J. Invert. Pathol. 2007, 96, 1-10.
57. L’Arrivée J. C. M.: The effect of sampling sites on Nosema determination. J. Insect. Pathol. 1963, 5, 349-355.
58. Lindsay D. S., Weiss L. M.: Opportunistic infections: Toxoplasma, Sarcocystis, and Microsporydia. Kluwer Academ. Publish. Boston 2004, s. 245. 59. Liu F., Wang Q., Dai P. L., Wu Y. Y., Song H. K., Zhou T.: Natural stripe of
Microsporidia of honeybee in China. Chinese Bull. Entomol. 2008, 45, 963- -966.
60. Liu T. P.: Oocytes degeneration in the queen honey bee after infection by Nosema apis. Tissue and Cell 1992, 24, 131-138.
61. Maistrello L., Lodesani M., Costa C., Leonardi F., Marani G., Caldon M.,
Mutinelli F., Granato A.: Screening of natural compounds for the control of
Nosema disease in honeybees (Apis mellifera). Apidologie 2008, 39, 436-445. 62. Martín-Hernández R., Botías C., Bailón E. G., Martínez-Salvador A., Prieto L.,
Meana A., Higes M.: Microsporidia infecting Apis mellifera: coexistence or
competition. Is Nosema ceranae replacing Nosema apis? Environ. Microbiol. 2012, 14, 2127-2138.
63. Martín-Hernández R., Botías C., Barrios L., Martínez-Salvador A., Meana A.,
Mayack C., Higes M.: Comparison of the energetic stress associated with
experimental Nosema ceranae and Nosema apis infection of honeybees (Apis mellifera). Parasitol. Res. 2011, 3, 605-612.
64. Martin-Hernandez R., Meana A., Prieto L., Salvador A. M., Garrido-Bailon E.,
Higes M.: Outcome of colonization of Apis mellifera by Nosema ceranae.
Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73, 6331-6338.
65. Mayack C., Naug D.: Energetic stress in the honeybee Apis mellifera from Nosema ceranae infection. J. Invert. Pathol. 2009, 100, 185-188.
66. Mayack C., Naug D.: Parasitic infection leads to decline in hemolymph sugar levels in honeybee foragers. J. Insect. Physiol. 2010, 56, 1572-1575. 67. Meana A., Martín-Hernández R., Higes M.: The reliability of spore counts to
diagnose Nosema ceranae infections in honey bees. J. Apic. Res. Bee World. 2010, 49, 212-214.
68. Mułenko W., Piątek M., Wołczańska A., Kozłowska M., Ruszkiewicz-Michal-
ska M.: Plant parasitic fungi introduced to Poland in modern times. Alien and
invasive species. Biological Invasions in Poland 2010, 1, 49-71.
69. Nanetti A.: ApiHerb as an alternative product to treat Nosema infection. Proc. Workshop “Nosema disease: lack of knowledge and work standardization” (COST Action FA0803) Guadalajara, 2009, http://www.coloss.org/news/ nosema-workshop-proceedings-online
70. Naug D., Gibbs A.: Behavioral changes mediated by hunger in honeybees infected with Nosema ceranae. Apidologie 2009, 40, 595-599.
71. Nozal M. J., Berna J. L., Martín M. T., Bernal J., Alvaro A., Martín-Hernán-
dez R., Higes M.: Trace analysis of fumagillin in honey by liquid
chromatog-raphy-DAD-electrospray ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 2008, 1190, 224-231.
72. OIE: Manual For Terrestrial Animals, Chapter 2. 2. 4.: Nosemosis of honeybees 2008.
73. Olszewski K.: Winter-hardiness of Buckfast bees under specific weather conditions of areas with alternating influences of maritime and continental climate. J. Apic. Sci. 2007, 1, 27-36.
74. Paleolog J., Strachecka A., Burzyński S., Olszewski K., Borsuk G.: The larval diet supplemented with the low-molecular epigenetic switch sodium pheny-lacetylglutaminate influences the worker cuticle proteolytic system in Apis mellifera L. J. Apicul. Scien. 2011, 55, 73-83.
75. Paxton R. J., Klee J., Korpela S., Fries I.: Nosema ceranae has infected Apis mellifera in Europe since at least 1998 and may be more virulent than Nosema apis. Apidologie 2007, 38, 558-565.
76. Plischuk S., Martín-Hernández R., Lucía M., Prieto L., Botías C., Meana A.,
Abrahamovich A. H., Lange C., Higes M.: South American native bumblebees
(Hymenoptera: Apidae) infected by Nosema ceranae (Microsporidia), an emerging pathogen of honeybees (Apis mellifera). Environ. Microbiol. Rep. 2009, 1, 131-135.
77. Porrini M. P., Audisio M. C., Sabaté D. S., Ibarguren C., Medici S. K., Sarlo
E. G., Garrido P. M., Eguaras M. J.: Effect of bacterial metabolites on
microsporidian Nosema ceranae and on its host Apis mellifera. Parasitology Research 2010, 107, 381-388.
78. Ptaszyńska A. A., Borsuk G., Anusiewicz M., Mułenko W.: Location of Nosema spp. spores within body of honey bee. Vet. Med. – Science and Practice 2012, 68, 618-621.
79. Ptaszyńska A. A., Borsuk G., Mułenko W.: Identyfikacja grzybów z rodzaju Nosema za pomocą technik biologii molekularnej i przy użyciu SEM. 47. Ogólnopolska Konferencja Naukowa, „Mikroorganizmy – roślina – środowi-sko w warunkach zmieniającego się klimatu”, Puławy – Lublin, 12-15 maja, 2013, s. 51.
80. Roberts M. D.: Fatty acids in honey bees (Apis mellifera) infected with the protozoan Nosema apis. J. Invert. Pathol. 1968, 11, 234-236.
81. Schmid-Hempel P.: Evolutionary ecology of insect immune defenses. Ann. Rev. Entomol. 2005, 50, 529-551.
82. Schmid-Hempel P., Wolf R. J.: Foraging effort and life span in workers of social insects. J. Anim. Ecol. 1988, 57, 509-522.
83. Shen M., Cui L., Ostiguy N., Cox-Foster D.: Intricate transmission routes and interactions between picornalike viruses (Kashmir bee virus and sacbrood virus) with the honeybee host and the parasitic varroa mite. J. Gen. Virol. 2005, 86, 2281-2289.
84. Smart M. D., Sheppard W. S.: Nosema ceranae in age cohorts of the western honey bee (Apis mellifera). J. Invert. Pathol. 2012, 109, 148-151.
85. Smith M. L.: The honey bee parasite Nosema ceranae: Transmissible via food exchange? PLoS ONE 2012, 7, e43319.
86. Sprague V., Becnel J. J.: Note on the name-author-date combination for the taxon “Microsporidies” Balbiani, 1882, when ranked as a phylum. J. Invert. Pathol. 1998, 71, 91-94.
87. Sprague V., Becnel J. J.: Appendix: checklist of available generic names for Microsporidia with type species and type hosts, [w:]: Wittner M., Weiss L. M. (eds.): Microsporidia and Microsporidiosis. ASM Press, Washington, D.C. 1999, 517-530.
88. Tapaszti Z., Forgách P., Kövágó C., Békési L., Bakonyi T., Rusvai M.: First detection and dominance of Nosema ceranae in Hungarian honeybee colonies. Acta Vet. Hung. 2009, 57, 383-388.
89. Thakur M., Sohal B. S.: Role of Elicitors in Inducing Resistance in Plants against Pathogen Infection: A Review. ISRN Biochemistry, vol. 2013, Article ID 762412, 10 pages, 2013. doi:10.1155/2013/762412
90. Tofilski A., Kopel J.: The influence of Nosema apis on maturation and flight activity of honey bee drones. Pszczel. Zesz. Nauk. 1996, 40, 55-60. 91. Topolska G., Gajda A.: Presence of Nosema apis in honeybee colonies in
Poland. Proc. COLOSS Workshop: New Molecular Tools, Bern, May 2009. 92. Topolska G., Gajda A., Hartwing A.: Polish honey bee colony. loss during the
winter 2007/2008. J. Apic. Sci. 2008, 52, 2, 95-104.
93. Traver B. E., Fell R. D.: Nosema ceranae in drone honey bees (Apis mellifera). J. Invert. Pathol. 2011, 107, 234-236.
94. Traver B. E., Williams M. R., Fell R. D.: Comparison of within hive sampling and seasonal activity of Nosema ceranae in honey bee colonies. J. Invert. Pathol. 2012, 109, 187-193.
95. Undeen A. H., Frixione E.: Structural alteration of the plasma membrane in spores of the microsporidium Nosema algerae on germination. J. Protozool. 1991, 38, 511-518.
96. Undeen A. H., Frixione E.: The role of osmotic pressure in the germination of Nosema algerae spores. J. Protozool. 1990, 37, 561-567.
97. Vávra J., Larsson J. I. R.: Structure of the microsporidia, [w]: Wittner M., Weiss L. M. (eds.): The Microsporidia and Microsporidiosis, ASM Press, Washington, D.C. 1999, 7-84.
98. Vossbrinck C. R., Andreadis T. G., Weiss L. M.: Phylogenetics: taxonomy and the microsporidia as derived fungi. p. 189-213, [w:] Lindsay D. S., Weiss L. M. (eds.): Opportunistic infections: Toxoplasma, Sarcocystis, and microsporidia. Kluwer Academic Publishers, Boston, Mass 2004.
99. Vossbrinck C. R., Maddox J. V., Friedman S., Debrunner-Vossbrinck B. A.,
Woese C. R.: Ribosomal RNA sequence suggests microsporidia are extremely
ancient eukaryotes. Nature 1987, 326, 411-414.
100. Wang D. I., Moeller F. E.: The division of labor and queen attendance behaviour of Nosema infected worker honeybees. J. Econ. Entomol. 1970, 63, 1539-1541.
101. Weidner E., Byrd W., Scarbourough A., Pleshinger J., Sibley D.: Microspo- ridian spore discharge and the transfer of polaroplast organelle into plasma membrane. J. Protozool. 1984, 31, 195-198.
102. Wittner M., Weiss L. M.: The Microsporidia and Microsporidiosis. ASM Press, Washington, D.C. 1999.
103. Xu Y., Weiss L. M.: The microsporidian polar tube: a highly specialised invasion organelle. Int. J. Parasitol. 2005, 35, 941-953.
104. Zander E.: Tierische Parasiten als Krankheitserreger bei der Biene. Münch. Bienenzeitung. 1909, 31, 196-204.
105. Zawilski A., Skonieczna-Zawilska L.: Negatywny wpływ Nosema apis Z. na efektywność przenikania plemników do zbiorniczków sztucznie unasiennia-nych matek pszczelich. Pszczel. Zesz. Nauk. 1995, 39, 71-77.
Adres autora: dr Aneta A. Ptaszyńska, Akademicka 19, 20-033 Lublin, e-mail: aneta.ptaszynska@poczta.umcs.lublin.pl
