Medycyna Wet. 2008, 64 (7) 886
Praca oryginalna Original paper
Eimeria spp. to wewn¹trzkomórkowe paso¿yty ptaków, wykazuj¹ce wysok¹ specyficznoæ wzglêdem ¿ywiciela. Z nielicznymi wyj¹tkami namna¿aj¹ siê w nab³onku przewodu pokarmowego, w zale¿noci od gatunku kolonizuj¹c okrelony jego odcinek, co jest cech¹ wykorzystywan¹ przy identyfikacji kokcydiów. U kur wystêpuje 7 kosmopolitycznych gatunków, sporód których 5 jest wyranie chorobotwórczych: E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. necatrix i E. tenella (5). Kokcydioza wywo³ywana przez te paso¿yty w zale¿noci od patogennoci gatunku mo¿e przebiegaæ bez wyranych objawów postaæ subkliniczna lub jako postaæ ostra z wysok¹ miertel-noci¹ (4).
Klasyczna metoda identyfikacji kokcydiów oparta jest na ustaleniu lokalizacji zmian anatomopatologicz-nych w przewodzie pokarmowym, okreleniu morfo-logii oocyst oraz ich wymiarów, jak te¿ czasu sporula-cji. Najnowsz¹ metod¹ identyfikacji gatunkowej kok-cydiów jest izolacja DNA i przeprowadzenie reakcji PCR. Izolacjê DNA z oocyst Eimeria spp. mo¿na wy-konaæ poprzez pozyskiwanie DNA z oocyst, mecha-nicznie homogenizuj¹c je przy u¿yciu szklanych kulek lub w ciek³ym azocie, ekstrakcjê DNA ze spo-rocyst oraz izolacjê DNA ze schizontów.
Wymienione metody izolacji DNA nie s¹ doskona-³e. Pierwsza z nich wymaga bardzo du¿ej liczby oocyst w badanej próbce, co gwarantuje uzyskanie odpowied-niej iloci DNA do badañ. Druga z metod wymaga przeprowadzenia skomplikowanej metody oczyszcza-nia, powoduj¹cej straty w oczyszczanym materiale, za wymogiem zastosowania ostatniej jest inwazyjnoæ oocyst, co ogranicza jej stosowanie tylko do wie¿o uzyskanego materia³u (8).
W badaniach w³asnych zastosowano pierwsz¹ z metod izolacji DNA w przypadku 3 izolatów, które spe³nia³y kryteria ilociowe koncentracji oocyst w za-wiesinie. W przypadku pozosta³ych izolatów uzyski-wano DNA ze schizontów, izoluj¹c materia³ bezpo-rednio od zara¿onych ptaków, a mianowicie z nab³on-ka b³ony luzowej jelit.
Celem badañ by³o okrelenie czêstoci wystêpowa-nia poszczególnych gatunków Eimeria spp. u kur na terenie województwa dolnol¹skiego oraz porówna-nie metody klasycznej i PCR do identyfikacji gatun-kowej kokcydiów.
Materia³ i metody
Materia³ do badañ pochodzi³ z ferm kurcz¹t rzenych i kur niosek zlokalizowanych na terenie Dolnego l¹ska,
Wystêpowanie gatunków Eimeria
u kur na terenie Dolnego l¹ska
SYLWIA ANTONIK, ANNA OKULEWICZ*, ANDRZEJ GAWE£, MICHA£ MAZURKIEWICZ
Katedra Epizootiologii i Administracji Weterynaryjnej z Klinik¹ Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, pl. Grunwaldzki 45, 30-066 Wroc³aw
*Instytut Genetyki i Mikrobiologii Wydzia³u Nauk Przyrodniczych UWr, ul. S. Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wroc³aw
Antonik S., Okulewicz A., Gawe³ A., Mazurkiewicz M.
Prevalence of Eimeria species in hens in the Lower Silesia region Summary
The purpose of the research was to determine the prevalence of particular Eimeria species in hens in the Lower Silesia region and to compare the methods of coccidia species identification. The material for the research came from farms of slaughter chickens and laying hens. The species identification was carried out by the classical method (location of anatomicopathologic changes in the alimentary tract, the morphology and size of oocytes, time of sporulation) and through the isolation of DNA and the amplification chain reaction (PCR). The most frequent species were: E. acervulina, E. tenella, E. maxima and E. necatrix. Over half (69%) of the cases of coccidiosis were caused by at least two species of coccidia, and only 31% of the cases by one species of coccidia. The results of the PCR analysis confirmed the species composition of Eimeria spp. determined by the classical method. For 15 out of 29 isolates, the results of the identification obtained after performing the PCR reaction concur with the results obtained by the classical method. Other tests failed to demonstrate the presence of DNA of the expected coccidian species.
Medycyna Wet. 2008, 64 (7) 887
w których zachodzi³o podejrzenie lub zdiagnozowano kok-cydiozê. Z próbek ka³u pobranego na fermach izolowano oocyty kokcydiów metod¹ flotacji w nasyconym roztwo-rze NaCl, a nastêpnie po sporulacji zawieszano je w 3% roztworze dwuchromianu potasu. Przez ca³y okres badañ uzyskano 29 izolatów o ró¿nej koncentracji oocyst w mili-litrze roztworu.
Do oznaczenia indeksu wielkoci oocyst u¿yto okularu z podzia³k¹ mikrometryczn¹. W nastêpnym etapie dowiad-czenia przeprowadzono eksperymentalne zara¿enie ptaków zawiesin¹ 5 × 104 oocyst z ka¿dego izolatu podan¹ sond¹
do wola. W trzy dni po zara¿eniu ptaków przeprowadzono sekcjê parazytologiczn¹ celem pobrania do badañ materia-³u wycinków nab³onka jelitowego w kierunku Eimeria acervulina, za materia³ do oznaczenia pozosta³ych gatun-ków pobierano w 5 dniu po zara¿eniu. W trakcie sekcji parazytologicznej przeprowadzano ocenê lokalizacji i nasi-lenia zmian anatomopatologicznych w obrêbie jelit wed³ug czterostopniowej skali Johnsona i Reida (1).
Izolacjê DNA przeprowadzono przy u¿yciu zestawu do izolacji genomowego DNA Genomic Mini, przeznaczo-nego do izolacji genomowego DNA z bakterii, hodowli komórkowych i tkanek sta³ych. Komórki nab³onka podda-no lizie w buforze lizuj¹cym zawieraj¹cym detergenty nie-jonowe (bufor LT) w obecnoci soli chaotropowych (bufor Tris, 10 mM TRIC.HCL) i proteinazy K. Nastêpnie mie-szaninê nanoszono na minikolumnê ze z³o¿em krzemion-kowym, które wi¹¿e przechodz¹ce przez nie DNA. Po wy-p³ukaniu niskojonowym buforem otrzymano DNA do dal-szych analiz. Reakcjê ³añcuchowej polimeryzacji przepro-wadzono w obecnoci polimerazy Taq, mieszaniny nukleo-tydów oraz gatunkowo specyficznych primerów (6, 7) (tab. 1). Wyniki reakcji amplifikacji obserwowano po prze-prowadzeniu elektroforezy w ¿elu agarozowym w obec-noci markera masy.
Wyniki i omówienie
Kokcydioza nale¿y do najczêciej diagnozowanych parazytoz drobiu. Mimo szeroko stosowanej chemio-i chemio-immunoprofchemio-ilaktykchemio-i wcchemio-i¹¿ stanowchemio-i chemio-istotne ród³o strat w produkcji drobiarskiej. Zachorowania dotycz¹
g³ów-nie ptaków m³odych, które g³ów-nie mia³y dot¹d kontaktu z paso¿ytem i nie wykszta³ci³a siê u nich odpornoæ. Najczêciej diagnozuje siê kokcydiozê wielogatunko-w¹, inwazje pojedynczym gatunkiem spotykane s¹ rzadko. W badaniach krajowych (3) a¿ 67,1% przy-padków kokcydiozy by³o wywo³ane przez co najmniej dwa gatunki kokcydiów. Lata³a (2) w ówczesnym województwie opolskim izolowa³ E. tenella w 61,4% przypadków, E. maxima i E. necatrix w 30,1% oraz E. acervulina w 3,4%. Na terenie Dolnego l¹ska Mazurkiewicz i wsp. (3) stwierdzili, ¿e kokcydioza kur spowodowana by³a g³ównie przez E. maxima 48% przypadków, a tak¿e E. tenella 29,5% i E. acervuli-na 24,9%. Natomiast udzia³ E. brunetti i E. necatrix nie przekracza³ 7%.
Tab. 1. Primery zastosowane w reakcji PCR (6, 7)
a w z a N a r e m ir p Sekwencja(5® )'3 Gatunek F A E R A E CGGGACATCTGGGCAAATGTAAATCGATCTTAGCCGTCGT Eimeiraacervuilna F B E R B E GTGAGTCTCAGTTTCTCTGGATGACCGATAACGCGCTATTCG Eimeirabrunetit F N E R N E GTAGCCAATTCACCCTAAAGTCCTTTTCTGGAAGTCCAGAC Eimeiranecatirx F T E R T E CAGAATGTTCAGGCTTCCCTAGTCCAGTCAACAGCACCCAT Eimeiratenella F a M E R a M E GACTGCGAGGCAACTTGGCTGGGCTTCGAACTAGAGCGCGC Eimeiramaxima F i M E R i M E GTATATTTTGCCCATAGGTACGGATGCAGTTCCGTGCGGCA Eimeiramiits F P E R P E CAAATTCAAATACTAGGGCAAGTCGAGACATATTTTTATAGGACA Eimeirapraecox
Tab. 2. Porównanie wyników uzyskanych przy wykorzysta-niu do identyfikacji gatunkowej Eimeria spp. metod¹ klasycz-n¹ i PCR a j c a k if y t n e d I a n z c y s a l k a d o t e m PCR a n il u v r e c a . E a n il u v r e c a . E E.acervuilna x ir t a c e n . E x ir t a c e n . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna;E.necatirx a m i x a m . E ; a ll e n e t . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna;E.maxima x ir t a c e n . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna;E.necatirx a ll e n e t . E ; a n il u v r e c a . E E.tenella a ll e n e t . E ; a m i x a m . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna;E.maxima;E.tenella a ll e n e t . E ; a m i x a m . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna a ll e n e t . E ; a m i x a m . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna;E.maxima;E.tenella a n il u v r e c a . E E.acervuilna a n il u v r e c a . E E.acervuilna a ll e n e t . E E.tenella a ll e n e t . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna;E.tenella a ll e n e t . E ; a m i x a m . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna;E.tenella a ll e n e t . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna;E.tenella a ll e n e t . E E.tenella a m i x a m . E ; a n il u v r e c a . E E.maxima a ll e n e t . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna;E.tenella a ll e n e t . E E.tenella a ll e n e t E ; x ir t a c e n . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna;E.necatirx a ll e n e t . E ; a m i x a m . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna;E.maxima a ll e n e t . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna a ll e n e t . E ; a m i x a m . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna a ll e n e t . E ; a m i x a m . E ; a n il u v r e c a . E E.maxima a ll e n e t . E E.tenella a ll e n e t . E ; a m i x a m . E ; a n il u v r e c a . E E.maxima;E.tenella a ll e n e t . E ; a n il u v r e c a . E a m i x a m . E ; a n il u v r e c a . E E.acervuilna;E.maxima
Medycyna Wet. 2008, 64 (7) 888
W badaniach w³asnych, opieraj¹c siê na klasycznej metodzie identyfikacji gatunkowej stwierdzono wy-stêpowanie na terenie Dolnego l¹ska czterech gatun-ków Eimeria. Najczêciej diagnozowanymi gatunka-mi by³y E. acervulina 83% i E. tenella 65% przy-padków. Pozosta³e dwa gatunki: E. maxima i E. neca-trix wystêpowa³y z mniejsz¹ czêstotliwoci¹, odpo-wiednio, w 38% i 13% przypadków. Ponad po³owa (69%) przypadków kokcydiozy wywo³ywana by³a przez co najmniej dwa gatunki, za tylko w 31% przy-padków przez jeden gatunek Eimeria. Rozk³ad gatun-kowy kokcydiów w inwazjach pojedynczych i koin-wazjach okrelony metod¹ klasyczn¹ przedstawia ryc. 1.
Wyniki analizy PCR potwierdzi³y sk³ad gatunkowy Eimeria spp. okrelony metod¹ klasyczn¹ na terenie Dolnego l¹ska (ryc. 2). W badaniach tych nie stwier-dzono obecnoci E. praecox, E. mitis i E. brunetti. Jednak czêstoæ wystêpowania poszczególnych gatun-ków i koinwazji ró¿ni³a siê od okrelonej metod¹ kla-syczn¹.
Dla 15 z 29 izolatów wyniki identyfikacji uzyskane po przeprowadzeniu reakcji PCR pokrywaj¹ siê z wy-nikami uzyskanymi metod¹ klasyczn¹. W pozosta³ych próbach nie wykazano obecnoci DNA spodziewanych gatunków kokcydiów. Wród przyczyn takich wyni-ków mo¿e byæ zbyt ma³a koncentracja oocyst u¿ytych do kontrolnego zara¿enia, a co za tym idzie du¿e prawdopodobieñstwo pobrania nieodpowiedniego fragmentu b³ony luzowej jelit do badañ (nie zawiera-j¹cego w komórkach II pokolenia schizontów). Inn¹ przyczyn¹ mog¹ byæ primery u¿yte w trakcie reakcji amplifikacji. By³y to startery zaprojektowane do wcze-niejszych badañ (6, 7). Jest mo¿liwe, ¿e na terenie Dol-nego l¹ska wystêpuj¹ szczepy, które nie maj¹ frag-mentów DNA komplementarnych do primerów zapro-jektowanych przez Schnitzlera.
Reasumuj¹c, przeprowadzone badania wykaza³y, ¿e na terenie Dolnego l¹ska u kurcz¹t i kur najczêciej Ryc. 1. Udzia³ poszczególnych gatunków Eimeria spp. w in-wazjach pojedynczych i koinin-wazjach okrelony metod¹ kla-syczn¹
Ryc. 2. Udzia³ poszczególnych gatunków w inwazjach poje-dynczych i koinwazjach okrelony na podstawie analizy PCR wystêpuj¹ cztery gatunki kokcydiów: E. acervulina, E. tenella, E. maxima i E. necatrix. Przy czym najczê-ciej diagnozowane s¹ E. acervulina 83% i E. tenella 65% przypadków. Z fauny paso¿ytniczej Dolnego l¹ska zosta³a wyparta Eimeria brunetti, która w la-tach siedemdziesi¹tych by³a izolowana od kur na tym terenie (3).
Pimiennictwo
1.Johnson J., Reid W. M.: Anticoccidial drugs. Lesion scoring techniques in battery and floor-pen experiments with chickens. Exp. Parasit. 1970, 28, 30-36.
2.Lata³a A.: Badania nad rodzajem Eimeria u drobiu z terenu woj. opolskiego. Medycyna Wet. 1972, 28, 146-151.
3.Mazurkiewicz M., Staszewski S., Zieliñski A.: Obserwacje nad wystêpowa-niem kokcydioz u kur na terenie Dolnego l¹ska. Biul. VI Zjazdu PTNW, Wroc³aw 1978, s. 633.
4.McDougald L. R.: Protozoal infection, [w:] Saif Y. M., Barnes H. J., Glis-son J. R., Fadly A. M., McDougald L. R., Swayne D. E. (Eds.): Diseases of Poultry. Iowa State Press, Ames 2003, 974-985.
5.Pellerdy L. P.: Coccidia and Coccidiosis. Akademiai Kiado, Budapest 1974, s. 166.
6.Schnitzler B. E., Thebo R. L., Mattsson J. G., Tomley F. M., Shirley M. W.: Development of a diagnostic PCR assay the detection discrimination of four pathogenic Eimeria species of the chickens. Avian Pathol. 1998, 27, 490--497.
7.Schnitzler B. E., Thebo R. L., Tomley F. M., Uggla A., Shirley M. W.: PCR identification of Eimeria: simplified read-out. Avian Pathol. 1999, 28, 89-93.
8.Zhao Xiamin, Duszyñski W. D., Loker E. S.: A Simple metod of DNA extrac-tion for Eimeria species. J. Microbiol. Meth. 2001, 44, 131-137.
Adres autora: mgr Sylwia Antonik, pl. Grunwaldzki 45, 50-366 Wroc³aw; e-mail: sylwia.antonik@wp.pl
