• Nie Znaleziono Wyników

Badania immunogenetyczne w transplantologii i diagnostyce : praca zbiorowa pod redakcją Katarzyny Boguni-Kubik

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Badania immunogenetyczne w transplantologii i diagnostyce : praca zbiorowa pod redakcją Katarzyny Boguni-Kubik"

Copied!
222
0
0

Pełen tekst

(1)

ISBN 978-83-61512-40-0

BADANIA

IMMUNOGENETYCZNE

W TRANSPLANTOLOGII

I DIAGNOSTYCE

Katarzyny Boguni-Kubik

B

A

D

A

N

IA

IM

M

U

N

O

G

E

N

E

T

Y

C

Z

N

E

W

T

R

A

N

S

P

L

A

N

T

O

L

O

G

II

I D

IA

G

N

O

S

T

Y

C

E

stron 221 - grzbiet 11,28mm

(2)

BADANIA

IMMUNOGENETYCZNE

W TRANSPLANTOLOGII

I DIAGNOSTYCE

Praca zbiorowa pod redakcj ˛

a

(3)

Skład komputerowy, projekt okładki

Tomasz Kubik

Ksi ˛a˙zka udost˛epniana na licencji Creative Commons: Uznanie autorstwa-U˙zycie

niekomercyjne-Na tych samych warunkach 3.0, Wrocław 2012. Pewne prawa

zastrze˙zone na rzecz Autorów i Wydawcy. Zezwala si˛e na niekomercyjne wykorzy-stanie tre´sci pod warunkiem wskazania Autorów i Wydawcy jako wła´scicieli praw do tekstu oraz zachowania niniejszej informacji licencyjnej tak długo, jak tylko na utwory zale˙zne b˛edzie udzielana taka sama licencja. Tekst licencji dost˛epny na stronie: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/pl/

ISBN 978-83-61512-40-0

Wydawca

I-BIS S.C.

Druk i oprawa

I-BiS S.C., ul. Lelewela 4, 53-505 Wrocław

(4)

S

PIS TRE ´

SCI

Słowo wst˛epne 5

1. Wykorzystanie genotypowania HLA w procedurach doboru dawców krwiotwórczych komórek macierzystych

Jacek Nowak 9

2. Banki krwi p˛epowinowej w Polsce i na ´swiecie

Anna Maria Gronkowska, El˙zbieta Urbanowska 21

3. Typowanie nieklasycznych antygenów zgodno´sci tkankowej – znacze-nie w doborze pary dawca biorca alogenicznego przeszczepienia ko-mórek krwiotwórczych

Milena Iwaszko, Katarzyna G˛ebura, Katarzyna Bogunia-Kubik 40

4. Identyfkacja przeciwciał anty-HLA u chorych po przeszczepie hema-topoetycznych komórek macierzystych

Urszula Siekiera 53

5. Udział pracowni typowania tkankowego w procedurze alokacji nerek pobranych od dawców zmarłych

Michał Kolasi ´nski 58

6. Identyfikacja przeciwciał anty-HLA jako badanie zapobiegaj ˛ace od-rzucaniu humoralnemu u biorców nerek podwy˙zszonego ryzyka im-munologicznego

Gra˙zyna Moszkowska 66

7. Cz˛esto´s´c wyst˛epowania HLA DRB1*03 i DRB1*04 u potencjalnych biorców nerek

Barbara Krasnod˛ebska-Szponder, Katarzyna Galant, Izabela Czy˙zewska,

Iwona Wojciechowska-Koszko, Stefania Giedry´s-Kalemba 77

8. Próba krzy˙zowa analizowana metod ˛a cytometrii przepływowej

Barbara Pi ˛atosa 84

9. Oznaczanie wewn ˛atrzkomórkowych cytokin metod ˛a cytometrii prze-pływowej z zastosowaniem immunofluorescencji

(5)

Spis tre´sci

10. Liczba TREC jako marker diagnostyczny limfopoezy

Barbara Wysocza ´nska 100

11. Asocjacje HLA z wybranymi jednostkami chorobowymi Monika Mordak, Marzena Lenart, Rafał Szatanek,

Monika Baj-Krzyworzeka, Kazimierz W˛eglarczyk, Maciej Siedlar 111

12. Cz˛esto´s´c wyst˛epowania HLA klasy I i II u pacjentów z ostr ˛a białaczk ˛a szpikow ˛a, białaczkami limfatycznymi oraz u potencjalnych dawców szpiku

Barbara Krasnod˛ebska-Szponder, Katarzyna Galant, Izabela Czy˙zewska,

Barbara Zdziarska, Stefania Giedrys-Kalemba 126

13. Badania technikami cytogenetyki klasycznej (kariotypowanie) i flu-orescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w hematoonkologii

Barbara Pie ´nkowska-Grela 135

14. Aberracje strukturalne DNA w nowotworowych rozrostach z komórki macierzystej hematopoezy

Marta Libura, Marta Przestrzelska, Marta Wi˛esik, Karolina Karabin,

Patrycja Rybarczyk, Albert Moskowicz 145

15. STR i real-time PCR metody badania chimeryzmu poprzeszczepowego

Anna Młynarczewska 155

16. Współczesne technologie identyfikacji długo´sci telomerów

Barbara Wysocza ´nska 160

17. Genotypowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu

Lidia Karabon 170

18. Diagnostyka laboratoryjna niepo˙z ˛adanych poprzetoczeniowych reak-cji immunologicznych

Jolanta Korsak 182

19. Znaczenie standaryzacji bada ´n genetycznych: Mi˛edzylaboratoryjny Test Kontroli Jako´sci Bada ´n FISH w Hematoonkologii

Barbara Pie ´nkowska-Grela, Beata Grygalewicz 205

20. Znaczenie standaryzacji bada ´n immunogenetycznych: Warsztaty Kontroli Jako´sci Typowania HLA

(6)

S

ŁOWO WST ˛

EPNE

„Badania diagnostyczne w transplantologii i diagnostyce” to zbiór opracowa ´n dotycz ˛acych rutynowej działalno´sci laboratoriów diagnostycznych, współpracu-j ˛acych z o´srodkami medycznymi i transplantacyjnymi. Znalazły si˛e w nim rów-nie˙z doniesienia Autorów posługuj ˛acych si˛e na co dzie ´n technikami biologii mo-lekularnej w trakcie realizacji prac badawczych.

Pierwszym z poruszanych zagadnie ´n jest problem optymalnego doboru

dawcy i biorcy alogenicznego przeszczepienia komórek krwiotwórczych. Dobór ten jest rutynowo prowadzony w oparciu o potwierdzenie genetycznej zgodno-´sci mi˛edzy dawc ˛a i biorc ˛a przeszczepienia w zakresie klasycznych loci HLA klasy I (A, B, C) i klasy II (DRB1 i DQB1). W czterech pierwszych rozdziałach mono-grafii przedstawiono techniki molekularne wykorzystywane do genotypowania HLA, okre´slono zasady doboru dawcy rodzinnego i poszukiwania dawcy niepo-skrewnionego oraz omówiono udział rejestrów honorowych dawców i banków krwi p˛epowinowej. Przedyskutowano równie˙z wyniki, które wskazuj ˛a na poten-cjalne znaczenie typowania nieklasycznych loci HLA (np. HLA-E, HLA-G czy MI-CA/B) dla powodzenia alogenicznego przeszczepienia komórek krwiotwórczych, oraz przedstawiono wst˛epne dane dotycz ˛ace monitorowania przeciwciał anty-HLA u biorcy przeszczepu.

Nast˛epnym poruszanym zagadnieniem jest dobór dawcy narz ˛adu

unaczynio-nego. Opiera si˛e on na wynikach typowania HLA loci A, B, DR oraz wynikach próby krzy˙zowej. W rozdziałach od pi ˛atego do siódmego omówiono rutynow ˛a procedur˛e doboru dawcy i biorcy oraz przedstawiono trudno´sci w znalezieniu odpowiedniego dawcy dla pacjentów z grupy podwy˙zszonego ryzyka immunolo-gicznego.

Poruszone zostały aspekty zwi ˛azane ze znaczeniem obecno´sci przeciwciał anty-HLA u biorcy, z konieczno´sci ˛a okre´slania ich swoisto´sci oraz monitorowa-nia obecno´sci przeciwciał anty-HLA swoistych dla dawcy po transplantacji. W tej cz˛e´sci przedstawiono równie˙z analiz˛e porównawcz ˛a wyników typowania HLA w grupie potencjalnych biorców nerek i w populacji osób zdrowych.

Dwa nast˛epne rozdziały niniejszego zbioru dotycz ˛a wykorzystania cytometrii przepływowej do wykonania próby krzy˙zowej oraz analizy wewn ˛atrzkomórkowej produkcji cytokin.

Kolejne trzy rozdziały, od dziesi ˛atego do dwunastego, po´swi˛econo analizie zwi ˛azków liczby episomalnych cz ˛asteczek DNA powstaj ˛acych podczas rearan-˙zacji receptorów antygenowych limfocytów T (ang. T cell receptor excision cyc-les, TREC) oraz specyficzno´sci prezentuj ˛acych antygen cz ˛asteczek HLA z choro-bami. Pomiar liczby TREC stanowi pomocne narz˛edzie diagnostyczne w ocenie

(7)

Słowo wst˛epne

zaburzonego procesu limfopoezy w wielu sytuacjach klinicznych, jak np. u pa-cjentów z wrodzonymi lub nabytymi niedoborami odporno´sci podczas terapii, pacjentów po alogenicznym przeszczepieniu komórek krwiotwórczych oraz pa-cjentów z chorobami autoimmunologicznymi. Z kolei typowanie HLA mo˙ze by´c

pomocne w prognozowaniu predyspozycji genetycznej do wyst ˛apienia pewnych

chorób, dynamiki post˛epu choroby, jak równie˙z w zdefiniowaniu klinicznych ty-pów choroby. W pracy asocjacje HLA z chorobami przedstawiono na przykładzie

zwi ˛azków z wybranymi chorobami o podło˙zu autoimmunizacyjnym, zapalnym

i infekcyjnym oraz chorobami rozrostowymi układu krwiotwórczego.

Z rozdziałem dwunastym ko ´nczy si˛e cz˛e´sci monografii podkre´slaj ˛aca rol˛e ty-powania tkankowego oraz istotne znaczenie metod słu˙z ˛acych do typowania HLA w klinice człowieka. W pi˛eciu kolejnych rozdziałach, od trzynastego do siedem-nastego, przedstawiono techniki biologii molekularnej wykorzystane w bada-niach zmian budowy materiału genetycznego - pocz ˛awszy od liczby i struktury chromosomów oraz długo´sci telomerów, a sko ´nczywszy na mutacjach wewn ˛ atrz-genowych i zmianach pojedynczych nukleotydach w sekwencji DNA. Techniki te znajduj ˛a szerokie zastosowanie w diagnostyce hematologicznej. Opisano bada-nia aberracji zwi ˛azanych z przemieszczaniem du˙zych fragmentów DNA i muta-cji wewn ˛atrzgenowych, prowadz ˛acych do transformacji nowotworowych. Dzi˛eki nim mo˙zna równie˙z analizowa´c zmienn ˛a długo´s´c telomerów i aktywno´s´c telo-merazy w kontek´scie obserwowanych mutacji i wpływu na rozwój chorób rozro-stowych. Wyniki tego typu bada ´n pozwalaj ˛a zrozumie´c mechanizmy

przedwcze-snego starzenia komórkowego, osi ˛agania stanu spoczynkowego komórki,

apop-tozy oraz procesu nowotworzenia. Metody biologii molekularnej wykorzysty-wane s ˛a równie˙z do monitorowania przebiegu potransplantacyjnego i post˛epów leczenia, w tym do oceny wła´sciwej odnowy hematologicznej i ´sledzenia cho-roby resztkowej (markery molekularne, poprzeszczepowy chimeryzm). Dostar-czaj ˛a te˙z narz˛edzi badawczych, ukierunkowanych na diagnostyk˛e potransplan-tacyjnych czynników prognostycznych.

Istotnym zagadnieniem poruszonym w opracowaniu jest diagnostyka labora-toryjna niepo˙z ˛adanych immunologicznych reakcji zwi ˛azanych z przetoczeniem krwi lub jej składników. Po´swi˛econo mu rozdział osiemnasty.

Ostatnie dwa rozdziały niniejszego zbioru podkre´slaj ˛a znaczenie udziału pra-cowni diagnostycznych i immunogenetycznych w warsztatach kontroli jako´sci stosowanych technik laboratoryjnych.

Przedstawione prace podkre´slaj ˛a udział pracowni diagnostycznych, typowa-nia tkankowego i laboratoriów immunogenetycznych w prawidłowym zdiagno-zowaniu, przygotowaniu pacjenta do transplantacji, doborze odpowiedniego dawcy, monitorowaniu post˛epów leczenia i przebiegu potransplantacyjnego. Wspólny wysiłek pracowników tych instytucji, jak równie˙z placówek klinicz-nych i o´srodków przeszczepowych, przyczynia si˛e do rozwoju transplantologii i diagnostyki oraz ma znacz ˛acy wpływ na wdra˙zanie innowacyjnych technolo-gii w tych dziedzinach. Wprowadzanie za´s nowego panelu diagnostycznego we wskazanych sytuacjach klinicznych pozwala rozszerzy´c badania o nowe czynniki rokownicze i lepiej zadba´c o dobro pacjenta.

(8)

Słowo wst˛epne Niniejszy zbiór opracowa ´n nie powstałby bez zaanga˙zowania i ˙zyczliwo´sci wszystkich Autorów. Dlatego chciałabym serdecznie za to podzi˛ekowa´c, ˙zycz ˛ac wszystkim Autorom dalszych sukcesów i satysfakcji z wykonywanej pracy.

dr hab. Katarzyna Bogunia-Kubik, prof. nadzw. Wrocław, listopad 2012

(9)
(10)

R O Z D Z I A Ł

1

W

YKORZYSTANIE GENOTYPOWANIA

HLA

W PROCEDURACH DOBORU DAWCÓW

KRWIOTWÓRCZYCH KOMÓREK

MACIERZYSTYCH

Jacek Nowak

Zakład Immunogenetyki Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa

Streszczenie

Niezgodno´s´c aminokwasów w cz ˛asteczkach HLA pomi˛edzy dawc ˛a i biorc ˛a przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (KKM) sprzyja wyst˛epowaniu gro´znych powikła ´n immunologicznych i infekcyjnych oraz pogarsza prze˙zycie bior-ców. W pracy przestawiono zasady zastosowania odpowiednich metod badania HLA w procesie doboru dawcy KKM. Podczas wst˛epnych i potwierdzaj ˛acych bada ´n chorych posiadaj ˛acych wskazania do transplantacji KKM i członków ich rodzin oraz wst˛epnych bada ´n rekrutowanych niespokrewnionych dawców wymagane s ˛a przy-najmniej badania HLA-A, B i DRB1 o niskiej rozdzielczo´sci. Podczas selekcji niespo-krewnionych dawców KKM zachodzi cz˛esto konieczno´s´c wykonania bada ´n dodat-kowych loci lub bada ´n A, B, DRB1 o wysokiej rozdzielczo´sci, co jest czasochłonne. W procesie doboru preferowani s ˛a zatem niespokrewnieni dawcy o poziomie wyty-powania wy˙zszym od wymaga ´n minimalnych. Ostateczne genotypowanie potwier-dzaj ˛ace pary dawca-biorca musi by´c wykonane na odpowiednio wysokim poziomie rozdzielczo´sci, pozwalaj ˛acym na wykluczenie lub identyfikacj˛e niezgodno´sci alle-licznych w zakresie HLA-A, B, C, DRB1 i DQB1. Pomimo stosowania nowoczesnych technik biologii molekularnej otrzymanie niejednoznacznych wyników bada ´n HLA jest cz˛esto nie do unikni˛ecia. W pracy przedstawiono równie˙z przesłanki interpreta-cji oraz zasady walidainterpreta-cji niejednoznacznych wyników genotypowania HLA w aspek-cie wyniku transplantacji. Racjonalne zastosowanie dost˛epnych metod genotypo-wania HLA o odpowiedniej rozdzielczo´sci oraz prawidłowa interpretacja wyników s ˛a warunkiem doboru optymalnego dawcy KKM oraz zmniejszenia cz˛esto´sci wyst˛e-powania gro´znych powikła ´n immunologicznych i infekcyjnych.

Słowa kluczowe: genotypowanie HLA, rozdzielczo´s´c metod badania HLA,

niejedno-znaczne wyniki bada ´n HLA, immunogenetyczny dobór dawcy szpiku, alogeniczna transplantacja krwiotwórczych komórek macierzystych

(11)

1. Wykorzystanie genotypowania HLA w procedurach doboru ...

1.1. Wst˛ep

Immunogenetyczna zgodno´s´c dawcy z biorc ˛a przeszczepu krwiotwórczych

komórek macierzystych (KKM) jest warunkowana sekwencj ˛a aminokwasów

w cz ˛asteczkach HLA maj ˛ac ˛a swe odzwierciedlenie w genotypach dawcy i biorcy, badanych na poziomie DNA. Niezgodno´s´c HLA lub sekwencji aminokwasów w obr˛ebie peptydów prezentowanych w kontek´scie cz ˛asteczek HLA sprzyja wy-st˛epowaniu gro´znych powikła ´n immunologicznych i infekcyjnych po

transplan-tacji KKM i pogarsza prze˙zycie biorców. Zastosowanie nowoczesnych

tech-nik biologii molekularnej do typowania HLA biorców i dawców wpłyn˛eło na

znaczn ˛a popraw˛e wyników alogenicznych transplantacji KKM [1]. Nadal

jed-nak nie zawsze mo˙zliwe jest uzyskanie jednoznacznych wyników genotypowa-nia w zwi ˛azku z wysokim stopniem zło˙zono´sci układu HLA. Przyczynia si˛e do tego zarówno niezwykła poligeniczno´s´c, jak i wysoki stopie ´n polimorfizmu wielu genetycznych loci HLA [2]. Obserwowana jednocze´snie wysoka homologia se-kwencji wielu alleli [3] i współdominuj ˛ace kodowanie genów HLA w układzie

di-ploidalnym sprzyjaj ˛a otrzymywaniu niejednoznacznych wyników

genotypowa-nia i utrudgenotypowa-niaj ˛a wiarygodne dobranie w pełni zgodnego dawcy KKM. W pracy

przedstawiono zasady prawidłowego zastosowania odpowiednio dobranych me-tod bada ´n HLA i interpretacji otrzymanych wyników w procesie doboru aloge-nicznego dawcy KKM.

1.2. Metody typowania HLA i prezentacji wyników

W doborze pary dawca-biorca KKM stosowane s ˛a ró˙zne metody typowania

HLA oparte najcz˛e´sciej na badaniu DNA [4]. Metoda hybrydyzacji ze swoistymi sondami oligonukleotydowymi (ang. sequence-specific oligonucleotide probe-hybridization, SSOP) polega na amplifikacji jednego lub kilku długich

fragmen-tów genu HLA odpowiadaj ˛acych eksonom i sondowaniu ich poprzez odwrotn ˛a

hybrydyzacj˛e z szeregiem krótkich sond genetycznych o znanych sekwencjach [5]. Sondy oligonukleotydowe opłaszczone s ˛a na mikrokulkach polistyrenowych (Luminex), mikromacierzach (Histo SPOT, BAG Health Care) lub paskach nitroce-lulozowych (Innogenetics). Rozdzielczo´s´c metod zale˙zy od liczby rozró˙znialnych no´sników (mikrokulek, spotów lub pr ˛a˙zków) w te´scie oraz od ró˙znorodno´sci sond oligonukleotydowych immobilizowanych na rozró˙znialnych no´snikach. Metod ˛a SSOP bada si˛e odr˛ebnie ka˙zde locus i najcz˛e´sciej mo˙zna w ten sposób osi ˛agn ˛a´c nisk ˛a rozdzielczo´s´c badania HLA ograniczon ˛a do „rodziny alleli’‘. Czynione s ˛a wysiłki nad podwy˙zszeniem rozdzielczo´sci testów poprzez zwi˛ekszenie pojemno-´sci no´sników sond, lub zastosowanie haplotypowo swoistych sond (tzw. specialty probes) mog ˛acych rozstrzygn ˛a´c niektóre niejednoznaczno´sci cis/trans.

Metoda amplifikacji ze swoistymi primerami (ang. sequence-specific primers, SSP) obejmuje wykonanie wielu amplifikacji krótkich fragmentów genu HLA przy u˙zyciu szeregu par primerów o znanych sekwencjach [6]. Amplifikacja przewadzana jest w wielu oddzielnych mieszaninach reakcyjnych, a wykrywanie pro-duktów amplifikacji zachodzi w elektroforezie na ˙zelu agarozowym. Zestaw pri-merów w testach SSP obejmuje kilkana´scie lub wi˛ecej fragmentów jednego

(12)

lo-1.3. Rozdzielczo´s´c metod genotypowania HLA cus HLA, co pozwala na okre´slenie alleli na poziomie niskiej rozdzielczo´sci. Me-toda SSP mo˙ze by´c wzbogacona o drugi, dokładniejszy stopie ´n. Wykorzystuje si˛e wówczas kilkana´scie lub kilkadziesi ˛at par primerów skierowanych do fragmen-tów jednej rodziny alleli, co mo˙ze znacznie zaw˛ezi´c wynik do jednego lub kilku alleli tej samej rodziny. Mówimy wówczas o wyniku na poziomie, odpowied-nio, wysokiej lub po´sredniej rozdzielczo´sci. Rzadziej obecnie stosowan ˛a metod ˛a jest elektroforetyczna analiza konformacji po hybrydyzacji z referencyjn ˛a nici ˛a DNA (ang. reference strand-mediated conformation analysis, RSCA) [7]. Pomiar opiera si˛e na ró˙znicy ruchliwo´sci fragmentów DNA w elektroforezie kapilarnej na ˙zelu poliakrylamidowym. Wad ˛a tej metody jest zale˙zno´s´c wyniku od szybko-´sci migracji w elektroforezie, która mo˙ze by´c podobna dla ró˙zni ˛acych si˛e alleli, a dla nowych sekwencji nie jest znana. Zalet ˛a jest separacja haplotypów i nie wyst˛epowanie niejednoznaczno´sci heterozygotycznych cis/trans. Sekwencjono-wanie (ang. sequencing-based typing, SBT) jest metod ˛a definitywn ˛a dla znacz-nie dłu˙zszych fragmentów badanych genów ni˙z wymienione wcze´sznacz-niej metody. Polega ono na wst˛epnej amplifikacji jednego lub kilku kompletnych eksonów z zastosowaniem znakowanych fluorescencyjnie trifosforanów dideoksynukle-otydów terminalnych dodanych do mieszaniny amplifikacyjnej w okre´slonych proporcjach w stosunku do nie znakowanych trifosforanów „zwykłych’‘ nukle-otydów. Okre´slenie sekwencji nukleotydów amplifikowanych fragmentów od-bywa si˛e na drodze rozwini˛ecia elektroforetycznego w kapilarach wypełnionych poliakrylamidem o liniowej cz ˛asteczce (LPA) lub specjalnym polimerem rozdziel-czym (ang. performance optimized polymer 6, POP6) i laserowej analizie fluore-scencji kolejnych nukleotydów przy u˙zyciu sekwenatora DNA. Powy˙zsza wersja SBT opiera si˛e na klasycznej metodzie sekwencjonowania wg. Sangera [8]. Now-sze wersje SBT, tzw. new generation sequencing (NGS) obejmuj ˛a przygotowanie bibliotek DNA poprzez frakcjonowanie DNA próbki na małe fragmenty (najcz˛e-´sciej, poni˙zej 1000 bp) o t˛epych ko ´ncach, ł ˛aczenie z sekwencjami adaptorowymi (biotynylowanymi primerami), immobilizacj˛e w obr˛ebie mikroreaktorowych be-adsów i klonaln ˛a amplifikacj˛e jednoniciowych fragmentów DNA [9]. Ostatnim etapem jest sekwencjonowanie przez syntez˛e, czyli pyrosekwencjonowanie [10].

Obydwie metody sekwencjonowania HLA wymagaj ˛a zastosowania precyzyjnych

procedur walidacji uzyskanych sekwencji oraz porównawczej analizy bibliotek znanych alleli HLA przy u˙zyciu zaawansowanego oprogramowania. Dzi˛eki za-awansowaniu technicznemu metody SBT pozwalaj ˛a znacznie cz˛e´sciej ni˙z SSOP czy SSP uzyska´c wynik genotypowania HLA na poziomie podwy˙zszonej lub wy-sokiej rozdzielczo´sci.

1.3. Rozdzielczo´s´c metod genotypowania HLA

Genotypowanie HLA mo˙ze dostarczy´c informacji na poziomie niskiej, po´sred-niej, podwy˙zszonej lub wysokiej rozdzielczo´sci, w zale˙zno´sci od zastosowanych testów. Za badanie o niskiej rozdzielczo´sci jest uznawane okre´slenie grupy alleli o zbli˙zonej sekwencji, przedstawiane w zapisie w postaci nazwy locus, gwiazdki (´swiadcz ˛acej o genetycznym sposobie typowania) i ci ˛agu dwóch cyfr okre´slaj ˛ a-11

(13)

1. Wykorzystanie genotypowania HLA w procedurach doboru ...

cych swoisto´s´c rodziny podobnych alleli (np. A*01 lub DRB1*15). Badanie o wy-sokiej rozdzielczo´sci dostarcza jednoznacznej informacji przynajmniej o tej cz˛e-´sci allelu HLA, która koduje sekwencj˛e aminokwasów w cz ˛asteczce HLA i odpo-wiada za efekt biologiczny (jednoznaczna identyfikacja antygenu HLA). Zapis wy-niku genotypowania o wysokiej rozdzielczo´sci obejmuje nazw˛e locus, gwiazdk˛e i przynajmniej dwa ci ˛agi po 2 lub 3 cyfry, oddzielone dwukropkiem, oznaczaj ˛ace odpowiednio, rodzin˛e alleli i kolejny numer sekwencji eksonowej, np. A*02:115 lub DRB1*13:02. Jednoznaczny zapis allelu mo˙ze by´c dłu˙zszy. Kolejny ci ˛ag

cyfr, wyst˛epuj ˛acy po drugim dwukropku w zapisie wyniku genotypowania HLA

(np. A*24:02:01 i A*24:02:02) dotyczy tzw. substytucji synonimowych (inny triplet nukleotydów koduje ten sam aminokwas), a kolejny czwarty ci ˛ag cyfr po trzecim dwukropku dotyczy polimorfizmu nukleotydów w intronach, tj. poza obszarem kodowania białka (np. A*01:01:01:01 i A*01:01:01:02). Niejednoznaczny wynik ge-notypowania HLA mo˙ze obejmowa´c kilka (czasami wiele) alleli nale˙z ˛acych do tej samej rodziny o niskiej rozdzielczo´sci, np. DRB1*04:01/03/04/08 oznacza alterna-tywn ˛a obecno´s´c jednego z 4 alleli DRB1, tj. DRB1*04:01, DRB1*04:03, DRB1*04:04 lub DRB1*04:08. Brak jednoznaczno´sci wyniku na tym poziomie jest okre´slany mianem wyniku o po´sredniej rozdzielczo´sci. Zapis wyniku o po´sredniej rozdziel-czo´sci mo˙ze ulec skróceniu dzi˛eki zastosowaniu tzw. kodów NMDP, czyli dwu, trzy lub czteroliterowych skrótów, których ewidencj˛e prowadzi National Marrow Donor Program na ogólnodost˛epnej stronie internetowej [11]. Przykładowo, za-pis DRB1*04:01/03/04/08 mo˙zna skróci´c u˙zywaj ˛ac kodu DRB1*04:EX. Okre´slenie „wynik genotypowania HLA o podwy˙zszonej rozdzielczo´sci’‘ oznacza istotne za-w˛e˙zenie wyniku o niskiej lub po´sredniej rozdzielczo´sci do niewielkiej grupy alleli, w´sród których znajduje si˛e tylko jeden allel CWD (poj˛ecie CWD wyja´sniono po-ni˙zej) lub allel typowy dla populacji, z której wywodzi si˛e badana osoba. Jako przykład podwy˙zszenia rozdzielczo´sci mo˙zna poda´c sytuacj˛e, w której w bada-niu wst˛epnym wykryto B*27:02/05/16/28 (B*27:BBV ). Jest to wynik o po´sredniej rozdzielczo´sci, gdy˙z obejmuje dwa allele – B*27:02 i B*27:05, nale˙z ˛ace do CWD i cz˛este równie˙z w populacji polskiej. Po wykonaniu ´sci´slejszego badania otrzy-mano wynik B*27:02/16/28 (B*27:AXW ) o podwy˙zszonej rozdzielczo´sci, gdy˙z al-lele B*27:16 i B*27:28 nie nale˙z ˛a do CWD i nie wyst˛epuj ˛a w polskiej populacji. Jedynym prawdopodobnym allelem pozostał w tej sytuacji B*27:02, co zbli˙za taki wynik pod wzgl˛edem informatywno´sci do wyniku o wysokiej rozdzielczo´sci.

Niejednoznaczne wyniki stanowi ˛a istotny problem diagnostyczny w zwi ˛azku m.in. z nieokre´slonym znaczeniem praktycznym dodatkowych alleli niewyklu-czonych w badaniu o po´sredniej rozdzielczo´sci. Próbuj ˛ac rozwi ˛aza´c niedogod-no´sci zwi ˛azane z wykonywaniem wielu dodatkowych typowa ´n wymaganych nie-kiedy przez transplantologów pragn ˛acych oprze´c si˛e na jednoznacznych wyni-kach, przeprowadzono szerokie badania allelicznego poziomu HLA metodami definitywnymi i okre´slono zakres niejednoznaczno´sci, które zawsze były roz-strzygane w postaci genotypu zawieraj ˛acego najcz˛estsze allele. W badaniu Cano i wsp. [12] przeprowadzonym na reprezentatywnej dla populacji ogólno´swiato-wej grupie ponad 25 000 osób zdefiniowano tzw. powszechne i dobrze udoku-mentowane allele HLA (ang. common and well-documented, CWD). Lista alleli

(14)

1.4. Ró˙zne fazy doboru dawcy KKM ... nale˙z ˛acych do CWD obejmuje w zale˙zno´sci od locus od 26% do 33% wszystkich odkrytych dot ˛ad alleli HLA. Sposób interpretacji niejednoznacznych wyników bada ´n HLA zaakceptowany przez Ameryka ´nskie Towarzystwo Zgodno´sci Tkan-kowej i Immunogenetyki (ang. American Society of Histocompatibility and Im-munogenetics, ASHI) pozwala na zdefiniowanie genotypów HLA (genotyp obej-muje dwa odr˛ebnie kodowane allele w locus) na poziomie wysokiej rozdzielczo-´sci. Zgodnie z definicj ˛a ASHI genotyp o wysokiej rozdzielczo´sci mo˙ze zawiera´c szereg alternatywnych genotypów pod warunkiem, ˙ze tylko jeden z nich zawiera jeden (u homozygot) lub dwa (u heterozygot) allele CWD, a wszystkie pozostałe alternatywne genotypy zawieraj ˛a allele rzadkie, nie nale˙z ˛ace do CWD [12]. Oce-niono, ˙ze genotyp obejmuj ˛acy dwa allele CWD jest ok. 10 000 razy bardziej praw-dopodobny ni˙z ka˙zdy z alternatywnych genotypów zawieraj ˛acych dwa rzadkie allele. Je´sli alternatywne genotypy zawieraj ˛a ró˙zne allele CWD to wynik nie jest uznawany za badanie o wysokiej rozdzielczo´sci, a niejednoznaczno´sci te musz ˛a by´c w razie potrzeby rozstrzygni˛ete w bezpo´srednim genotypowaniu.

Dodatkowo, zgodnie z definicj ˛a ASHI, a tak˙ze Europejskiej Federacji Immuno-genetyki (EFI) wynik o wysokiej rozdzielczo´sci mo˙ze zawiera´c kilka alternatyw-nych alleli pod warunkiem, ˙ze substytucje nukleotydów wyst˛epuj ˛ace wewn ˛atrz eksonów zlokalizowane s ˛a poza istotnym z punktu widzenia efektu biologicznego obszarem rozpoznania antygenowego (ang. antigen recognition site, ARS), tj. poza eksonami 2 i 3 alleli klasy I i eksonem 2 alleli klasy II. Wydaje si˛e, ˙ze ł ˛aczne kryte-rium „obu alleli nale˙z ˛acych do CWD plus mo˙zliwo´s´c substytucji poza obszarem ARS’‘ stanowi racjonaln ˛a podstaw˛e decyzji klinicznych odno´snie zgodno´sci tkan-kowej pomi˛edzy dawc ˛a i biorc ˛a KKM. Istotn ˛a korzy´sci ˛a wynikaj ˛ac ˛a z przyj˛ecia powy˙zszej definicji wyniku genotypowania o wysokiej rozdzielczo´sci mo˙ze by´c przy´spieszenie doboru pary dawca-biorca, co ma istotne znaczenie kliniczne [13] w zwi ˛azku z zapotrzebowaniem na szybkie dobory dawców HSC dla zwi˛ekszaj ˛ a-cego si˛e odsetka biorców, u których wykryto ostr ˛a białaczk˛e [14]. Ostateczny wy-nik typowania HLA powinien obejmowa´c jedn ˛a par˛e alleli CWD oraz zawiera´c in-formacj˛e, ˙ze kompletna lista wszystkich alternatywnych genotypów, których nie wykluczono w bezpo´srednim genotypowaniu znajduje si˛e w laboratorium i zo-stanie udost˛epniona na pro´sb˛e lekarza.

Obecnie wszystkie cztery poziomy rozdzielczo´sci wyników bada ´n HLA jak

równie˙z interpretacja CWD/ARS znajduj ˛a zastosowanie w praktyce na ró˙znych etapach rekrutacji i doboru dawców KKM do transplantacji.

1.4. Ró˙zne fazy doboru dawcy KKM wymagaj ˛

a

odpowiedniego zakresu i rozdzielczo´sci

genotypowania HLA

Dobór dawcy alogenicznego przeszczepu KKM jest procesem wieloetapowym (Rycina 1.1). Procedura doboru rozpoczyna si˛e od ustalenia wskaza ´n do

alotran-splantacji KKM, poł ˛aczonego z wst˛epnym badaniem HLA pacjenta i członków

jego najbli˙zszej rodziny, tj. rodze ´nstwa i rodziców. Minimalny zakres wst˛epnego 13

(15)

1. Wykorzystanie genotypowania HLA w procedurach doboru ...

Dobór rodzinny Pacjent

WT: A, B, DRB1/SSOP n.r. (LTC HLA klasy I)

Haploidentyczny Szeroka rodzina CT: A, B, C, DRB1, DQB1/SSOP n.r. lub p.r. Zgodny rodzinny dawca CT: A, B, C, DRB1/SSOP n.r. Brak zgodnego rodzinnego dawcy WT: A, B, DRB1/SSOP n.r.

Dobór niespokrewnionego dawcy KKM

Brak zgodnego niespokrewnionego dawcy CT: A, B, C, DRB1, DQB1/SSOP p.r./SSP p.r./SBT w.r. Zgodny niespokrewniony dawca CT: A, B, C, DRB1, DQB1/SSOP p.r./SSP p.r./SBT w.r. Alogeniczna transplantacja KKM

Specjalistyczny dobór dawcy KKM

Brak zgodnego niespokrewnionego dawcy Zgodny niespokrewniony dawca CT: A, B, C, DRB1, DQB1/SSOP p.r./SSP p.r./SBT w.r. 10/10, 9/10 Niespokrewniony dawca CT: A, B, C, DRB1, DQB1/SSOP p.r./SSP p.r./SBT w.r. 8/10, 7/10 CT: A, B, C, DRB1, DQB1/SSOP p.r./SSP p.r./SBT w.r. CBU, 2CBU 6/6, 5/6, 4/6 (WT: A, B, DRB1/SSOP n.r.) Leczenie alternatywne

Rycina 1.1: Algorytm doboru dawcy alogenicznego przeszczepu krwiotwórczych komó-rek macierzystych z uwzgl˛ednieniem wykorzystania metod genotypowania HLA. WT, wst˛epne typowanie; CT, typowanie potwierdzaj ˛ace; SBT, metoda oparta na sekwencjo-nowaniu genów; SSOP, metoda swoistych sond oligonukleotydowych; SSP, metoda swo-istych primerów; LCT, serologiczna metoda typowania HLA klasy I, tj. test limfocyto-toksyczny; KKM, przeszczep zawieraj ˛acy krwiotwórcze komórki macierzyste; CBU, jed-nostka krwi p˛epowinowej (ang. cord blood unit); n.r., niska rozdzielczo´s´c; p.r., po´srednia-/podwy˙zszona rozdzielczo´s´c; w.r., wysoka rozdzielczo´s´c.

badania rodzinnego obejmuje loci HLA-A, B i DRB1 o niskiej rozdzielczo´sci i naj-cz˛e´sciej bywa wykonywany przy u˙zyciu generycznych testów HLA wykorzystuj ˛ a-cych metod˛e PCR-SSP lub PCR-SSOP o niskiej lub po´sredniej rozdzielczo´sci.

Na tym etapie, słu˙z ˛acym do wykazania istnienia lub braku zgodnego dawcy rodzinnego, oprócz wyników genetycznego typowania HLA-A, B i DRB1 mo˙z-liwe jest alternatywne wykorzystanie wyników serologicznych bada ´n HLA klasy I. Ze wzgl˛edu na ograniczon ˛a wiarygodno´s´c bada ´n serologicznych [15] wymaga to jednak zastosowania jednoznacznych elementów kontroli. Przede

wszyst-kim, oprócz chorego i rodze ´nstwa badanie powinno obejmowa´c równie˙z

ro-dziców. Ponadto, rodzina powinna by´c odpowiednio liczna, aby mo˙zliwe było okre´slenie segregacji haplotypów. Wyniki serologicznych bada ´n HLA klasy I, zwłaszcza interpretowane bez nale˙zytej ostro˙zno´sci, obejmuj ˛ace jedynie chorego i jego rodze ´nstwo mog ˛a w niektórych przypadkach spowodowa´c omyłkow ˛a

(16)

dys-1.4. Ró˙zne fazy doboru dawcy KKM ... kwalifikacj˛e zgodnego dawcy albo kwalifikacj˛e dawcy niezgodnego. Dodatko-wym zabezpieczeniem przed skutkami podobnych bł˛edów oraz mo˙zliwych po-myłek administracyjnych powinno by´c wykonanie genotypowania potwierdza-j ˛acego (ang. confirmatory typing, CT) wyselekcjonowanej, potencjalnie zgodnej

pary rodzinny dawca – biorca, obejmuj ˛acego nowe próbki krwi obu osób.

Mi-nimalnym zakresem rodzinnego genotypowania potwierdzaj ˛acego w przypadku

całkowitej zgodno´sci s ˛a loci HLA-A, B, C i DRB1 na poziomie niskiej rozdzielczo-´sci. Mówimy wówczas o zgodno´sci 8 alleli spo´sród 8 badanych, czyli o zgodno-´sci 8/8. W niektórych krajach zalecane jest równie˙z badanie locus DQB1 w celu potwierdzenia zgodno´sci haplotypów HLA. Wymagania odno´snie zakresu bada ´n HLA pary dawca - biorca s ˛a rozszerzone w przypadku kwalifikacji cz˛e´sciowo

nie-zgodnego dawcy rodzinnego w zwi ˛azku z ró˙znicami haplotypowymi na

pozio-mie alleli. Cz˛e´sciowo niezgodny dawca rodzinny jest zwykle identyczny z chorym w zakresie jednego haplotypu HLA oraz zgodny na zasadzie przypadku w zakresie niektórych loci drugiego haplotypu. Aby potwierdzi´c spodziewany stopie ´n zgod-no´sci nale˙zy dokona´c precyzyjnej analizy haplotypów w rodzinie i w razie w ˛ at-pliwo´sci wykona´c badanie o wysokiej rozdzielczo´sci w zakresie wybranych loci HLA, tj. A, B, C, DRB1 i/lub DQB1. Rozszerzone badanie potwierdzaj ˛ace wykony-wane w przypadku nie pełnej zgodno´sci dawcy rodzinnego ma na celu uzyskanie kompletnej informacji o liczbie i swoisto´sci alleli niezgodnych w badanym zakre-sie. Brak zgodnego dawcy rodzinnego i wykrycie nie akceptowalnych niezgod-no´sci u haplotypowo identycznego dawcy rodzinnego stanowi wskazanie do po-szukiwania niespokrewnionego dawcy przeszczepu KKM, o ile istnieje medyczne wskazanie do transplantacji od dawcy alternatywnego [16].

Immunogenetyczny dobór niespokrewnionego (lub alternatywnego) dawcy ma na celu znalezienie w rejestrach wolontariusza o odpowiednim stanie zdro-wia i pełnej zgodno´sci immunogenetycznej w zakresie pi˛eciu najwa˙zniejszych loci HLA, tj. A, B, C, DRB1 i DQB1 na poziomie alleli [17]. Wst˛epne dane za-warte w rejestrach s ˛a najcz˛e´sciej ograniczone do trzech (A, B i DRB1) lub nawet dwóch (A i B) loci HLA i do poziomu niskiej rozdzielczo´sci. Dane te w wi˛ekszo-´sci przypadków nie s ˛a wystarczaj ˛ace do wskazania dawcy, który w wyniku bada ´n potwierdzaj ˛acych okazałby si˛e zgodny na poziomie alleli wszystkich 5 wymaga-nych loci. Konieczno´s´c wykonania bada ´n dodatkowych loci (C lub DQB1 o niskiej rozdzielczo´sci), lub bada ´n loci DRB1, B lub A o podwy˙zszonej rozdzielczo´sci nie zachodzi w przypadku dawców, którzy podczas rekrutacji mieli wykonane rozsze-rzone badania HLA. Dawcy tacy s ˛a preferowani przez o´srodki wykonuj ˛ace dobór, zwłaszcza w przypadku chorych zagro˙zonych szybk ˛a progresj ˛a lub krótk ˛a remi-sj ˛a choroby, lub gdy dobór jest pilny z innych przyczyn medycznych. Z punktu widzenia chorego bardzo korzystne jest rozszerzenie wst˛epnego typowania daw-ców do rejestru o locus C na poziomie niskiej rozdzielczo´sci oraz najbardziej po-limorficznego locus jakim jest HLA-B do podwy˙zszonej/wysokiej rozdzielczo´sci. Z tych samych powodów pełna informacja na temat wszystkich niejednoznacz-nych alleli uzyskaniejednoznacz-nych w badaniu o po´sredniej rozdzielczo´sci, np. zapisana w po-staci kodów NMDP mo˙ze si˛e okaza´c wystarczaj ˛aco informatywna, aby rozstrzy-gn ˛a´c czy dawca jest potencjalnie zgodny z chorym w zakresie w ˛atpliwego locus.

(17)

1. Wykorzystanie genotypowania HLA w procedurach doboru ...

Dlatego absolutnie konieczne jest rutynowe przekazywanie przez o´srodki daw-ców szpiku uzupełnionych genotypów rekrutowanych do rejestru dawdaw-ców, za-wieraj ˛acych kody NMDP, je´sli informacja o mo˙zliwych alternatywnych allelach wynika z przeprowadzonych wst˛epnych bada ´n HLA. Mo˙ze si˛e to przyczyni´c do skrócenia czasu trwania doboru zgodnego dawcy KKM. W przypadku zgodno´sci 10/10 wyniki genotypowania potwierdzaj ˛acego na poziomie wysokiej rozdziel-czo´sci dawcy i chorego raportowane s ˛a do o´srodka transplantacji szpiku z propo-zycj ˛a akceptacji dawcy.

Dobranie całkowicie zgodnego niespokrewnionego dawcy cz˛esto wymaga wy-konania precyzyjnie zaplanowanych typowa ´n uzupełniaj ˛acych u jednego, kilku,

a czasem u wielu wyselekcjonowanych potencjalnych dawców i mog ˛a

obejmo-wa´c jedno lub kilka loci HLA, co jest czasochłonne i kosztowne. Badania rozsze-rzaj ˛ace maj ˛a na celu wyja´snienie polimorfizmu dawców lub poszukiwanie u daw-ców charakterystycznych dla chorego rzadkich sprz˛e˙ze ´n haplotypowych pomi˛e-dzy loci B-C, DRB1-DQB1 i innymi. Zjawisko silnej nierównowagi sprz˛e˙ze ´n po-mi˛edzy wszystkimi loci HLA sprawia, ˙ze etap rozszerzaj ˛acego typowania wybra-nych loci HLA mo˙ze by´c kluczowy dla znalezienia w pełni zgodnego dawcy. Mog ˛a tutaj by´c stosowane metody o niskiej, po´sredniej lub wysokiej rozdzielczo´sci, za-le˙znie od rodzaju polimorfizmu obserwowanego u potencjalnych dawców. Bada-nia rozszerzaj ˛ace powinny by´c tak zaplanowane, aby wyłoni´c przynajmniej jed-nego dawc˛e, który w genotypowaniu potwierdzaj ˛acym oka˙ze si˛e zgodny z chorym w zakresie 10/10 [18].

Innym wynikiem pierwszej fazy doboru niespokrewnionego dawcy mo˙ze by´c wykazanie braku pełnej zgodno´sci wyselekcjonowanego dawcy. Przeprowadzana jest wówczas powtórna analiza dost˛epnych danych HLA potencjalnych dawców obejmuj ˛aca globaln ˛a baz˛e BMDW i szczegółowe raporty rejestrów krajowych ce-lem okre´slenia szansy dobrania dawcy 10/10. W przypadku braku potencjału, okre´slana jest szansa dobrania akceptowalnego cz˛e´sciowo niezgodnego niespo-krewnionego [17] lub rodzinnego dawcy albo jednostek krwi p˛epowinowej, zgod-nych w zakresie 6, 5 lub 4 spo´sród 6 swoisto´sci HLA-A, B i DRB1. Próba dobra-nia ka˙zdego kolejnego akceptowalnego dawcy jest coraz mniej skuteczna i coraz bardziej czasochłonna. Czas upływaj ˛acy pomi˛edzy rozpoznaniem choroby, a wy-konaniem transplantacji powinien by´c mo˙zliwie krótki w zwi ˛azku ze znacznie pogarszaj ˛acymi si˛e wynikami w przypadku wykonania transplantacji w nie opty-malnej lub zaawansowanej fazie choroby [19]. Przedłu˙zaj ˛acy si˛e czas trwania do-boru po niepowodzeniu pierwszej jego fazy wynika z konieczno´sci badania naj-cz˛e´sciej wielu dawców, u których nie znane, a po zbadaniu najnaj-cz˛e´sciej niezgodne z chorym s ˛a niektóre swoisto´sci HLA o wysokiej rozdzielczo´sci. Mo˙ze to ozna-cza´c, ˙ze pacjent posiada unikalne sprz˛e˙zenia swoisto´sci genetycznych niektó-rych loci lub unikalny genotyp HLA na poziomie alleli. Racjonalnym post˛epowa-niem jest wówczas zbadanie w zakresie w ˛atpliwych loci reprezentatywnej próby, np. 10-25 spo´sród 100 lub wi˛ecej potencjalnych, słabo wytypowanych dawców raportowanych w BMDW oraz wzmocnienie informatywno´sci badania poprzez okre´slenie proporcji dawców niezgodnych do niezbadanych w zakresie alleli w ˛ at-pliwego locus. Badanie reprezentatywnej próby potencjalnych dawców w trybie

(18)

1.4. Ró˙zne fazy doboru dawcy KKM ... typowania uzupełniaj ˛acego powinno by´c wykonane mo˙zliwie sprawnie, tj. w ca-łej grupie jednocze´snie, a w przypadku pacjentów pilnych sprowadzenie próbki i wykonanie ostatecznego typowania potwierdzaj ˛acego o wysokiej rozdzielczo-´sci powinno dotyczy´c dwóch lub wi˛ecej wyselekcjonowanych dawców jednocze-´snie [20]. Liczne przykłady potwierdzaj ˛a mo˙zliwo´s´c selekcji dawcy 10/10 lub 9/10 w reprezentatywnej grupie oraz brak skuteczno´sci uporczywego badania dodat-kowych dawców powy˙zej reprezentatywnej próby w przypadkach unikalnego ge-notypu HLA chorego [21].

W przypadkach braku potencjalnych dawców wytypowanych w zakresie HLA-A, B i DRB1 istnieje bardzo mała szansa na zgodno´s´c dawcy wytypowanego tylko w zakresie genów klasy I, tj. A i B. Obecnie rejestry raportuj ˛ace do BMDW obej-muj ˛a ok. 3 mln. tak zwanych dawców A,B. Szansa na pełn ˛a zgodno´s´c 10/10 które-go´s z dawców A,B wzrasta około o´smiokrotnie (p=0.006), gdy zgodne s ˛a równie˙z antygeny HLA-C [22]. Jest to dodatkowym uzasadnieniem dla wykonywania ge-notypowania HLA-C przynajmniej o niskiej rozdzielczo´sci, ju˙z na wst˛epnym eta-pie rekrutacji dawców.

W przypadku wykazania unikalnego genotypu HLA chorego i wyczerpania mo˙zliwo´sci doboru dawcy o stopniu zgodno´sci 10/10 i 9/10 mo˙zliwe bywa wyko-rzystanie wielkiego populacyjnego potencjału BMDW i próba przeprowadzenia haplotypowego doboru dawcy o stopniu zgodno´sci 9/10 [23]. Podstaw ˛a haploty-powego doboru jest obserwacja, ˙ze pojedyncza niezgodno´s´c swoisto´sci jednego z dystalnych loci haplotypu HLA (tj. A lub DQB1) jest w populacji europejskiej mniej szkodliwa ni˙z niezgodno´s´c swoisto´sci centralnych loci haplotypu HLA [19]. Sposób haplotypowego doboru dawcy na przykładzie chorej z ostr ˛a białaczk ˛a limfoblastyczn ˛a przedstawiono wcze´sniej [24].

Dobór haplotypowy jest ułatwiony po zastosowaniu populacyjnej analizy ha-plotypowej pod k ˛atem haplotypów chorego, przy u˙zyciu oprogramowania PHASE KEY v. 1.0, opracowanego w Zakładzie Immunogenetyki Instytutu Hematologii i Transfuzjologii (oprogramowanie wraz z instrukcj ˛a obsługi dost˛epne u autora). Ostatecznym wynikiem uzupełniaj ˛acych bada ´n HLA wraz z analiz ˛a haplotypow ˛a jest cz˛esto wykazanie niezgodno´sci jednego antygenu w locus A lub DQB1 i po-twierdzenie zgodno´sci wszystkich pozostałych alleli. Wynik taki wskazuje na zgodno´s´c jednego haplotypu w cało´sci, jak równie˙z całej pozostałej cz˛e´sci haplo-typu niezgodnego w locus A lub DQB1. Oznacza to mo˙zliwo´s´c dobrania dawcy o stopniu zgodno´sci 9/10 pochodz ˛acego z puli dawców cz˛e´sciowo niezgodnych, nie za´s spo´sród dawców potencjalnie w pełni zgodnych.

Innym sposobem pokonywania trudno´sci zwi ˛azanych z brakiem zarówno

optymalnego rodzinnego, jak i niespokrewnionego dawcy komórek krwiotwór-czych jest transplantacja jednej lub dwóch jednostek krwi p˛epowinowej (Ry-cina 1.1). Transplantacja krwi p˛epowinowej ł ˛aczy si˛e przewa˙znie z niezgodno´sci ˛a jednej lub dwóch spo´sród 6 cz ˛asteczek HLA-A, B, DRB1 (zgodno´s´c 5/6 lub 4/6), lecz niezgodno´sci te s ˛a stosunkowo dobrze tolerowane z powodu niedojrzało´sci i wi˛ekszej plastyczno´sci immunologicznej w porównaniu z komórkami

pocho-dz ˛acymi od dorosłego dawcy. Rekomendowanym poziomem zgodno´sci w

przy-padkach przeszczepie ´n krwi p˛epowinowej jest zgodno´s´c 6/6, 5/6 lub 4/6

(19)

1. Wykorzystanie genotypowania HLA w procedurach doboru ...

´sci zbadanych w zakresie HLA-A i B na poziomie antygenowym (niska rozdziel-czo´s´c) oraz DRB1 na poziomie allelicznym (wysoka rozdzielrozdziel-czo´s´c). Jednocze´snie zaleca si˛e uzupełnienie bada ´n w zakresie A, B, C, DRB1 i DQB1 na poziomie alleli w celu umo˙zliwienia racjonalnej oceny zagro˙zenia wyst ˛apieniem ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (aGvHD) i odrzuceniem przeszczepu [25].

1.5. Podsumowanie

Genotypowanie HLA przy u˙zyciu prawidłowo dobranych i skrupulatnie kontrolowanych metod molekularnych jest podstawowym elementem doboru pary dawca-biorca alogenicznego przeszczepu KKM. Współczesna

immuno-genetyka dysponuje szerokim arsenałem molekularnych metod słu˙z ˛acych do

identyfikowania sekwencji genów HLA. Metody te charakteryzuj ˛a si˛e ró˙znorod-no´sci ˛a zastosowanych technologii i ró˙znym zakresem definiowanych sekwencji

DNA. Odmienne s ˛a równie˙z potrzeby badawcze podczas genotypowania HLA.

Podczas wst˛epnych i potwierdzaj ˛acych bada ´n chorych posiadaj ˛acych

wska-zania do transplantacji KKM i członków ich rodzin oraz wst˛epnych bada ´n

rekrutowanych niespokrewnionych dawców najcz˛e´sciej wystarczaj ˛acy jest niski poziom rozdzielczo´sci bada ´n HLA w zakresie loci A, B i DRB1. Podczas selekcji niespokrewnionych dawców KKM zachodzi cz˛esto konieczno´s´c wykonania bada ´n dodatkowych loci lub bada ´n A, B, DRB1 o wysokiej rozdzielczo´sci, co jest czasochłonne. Przedłu˙zaj ˛acy si˛e dobór niespokrewnionego dawcy mo˙ze spowodowa´c przej´scie stanu pacjenta w faz˛e nieoptymaln ˛a dla leczenia

trans-plantacyjnego i dlatego w procesie doboru preferowani s ˛a dawcy o poziomie

wytypowania wy˙zszym od wymaga ´n minimalnych (>A,B,DRB1 o niskiej rozdziel-czo´sci). Ostateczne genotypowanie potwierdzaj ˛ace pary dawca-biorca musi by´c

wykonane na odpowiednio wysokim poziomie rozdzielczo´sci, pozwalaj ˛acym na

wykluczenie lub identyfikacj˛e niezgodno´sci allelicznych w zakresie HLA-A, B, C, DRB1 i DQB1. W procesie doboru alogenicznego dawcy KKM nale˙zy stosowa´c metody molekularne o optymalnej wiarygodno´sci i rozdzielczo´sci, odpowiednio

do fazy doboru. Niejednoznaczne wyniki genotypowania HLA s ˛a w wielu

przy-padkach nie do unikni˛ecia, st ˛ad konieczne jest pełne zrozumienie potencjalnego znaczenia niejednoznaczno´sci dla ostatecznego wyniku transplantacji. Prawi-dłowe zastosowanie dost˛epnych metod genotypowania HLA o odpowiedniej rozdzielczo´sci jest warunkiem przeprowadzenia doboru optymalnego dawcy. Optymalizacja doboru mo˙ze pozwoli´c na dalsz ˛a popraw˛e prze˙zycia chorych po transplantacji komórek krwiotwórczych oraz na zmniejszenie cz˛esto´sci wyst˛epowania gro´znych powikła ´n immunologicznych i infekcyjnych.

Praca powstała przy współfinansowaniu w ramach projektu badawczego Na-rodowego Centrum Nauki Nr N N402 351138.

(20)

1.5. Podsumowanie

Literatura

[1] Viollier R., Socie G., Tichelli A. i wsp.: Recent improvement in outcome of unrelated donor transplantation for aplastic anemia. Bone Marrow Transplant., 2008; 41: 45-50 [2] Robinson J., Mistry K., McWilliam H. i wsp.: The IMGT/HLA database. Nucleic Acids

Res., 2011; 39: D1171-1176

[3] Holdsworth R., Hurley C.K., Marsh S.G. i wsp.: The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and -DQB1 alleles and their association with sero-logically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens. Tissue Antigens, 2009; 73: 95-170

[4] Nowak J., Mika-Witkowska R., Graczyk-Pol E.: Genetic methods of HLA typing. W: Molecular Aspects of Hematologic Malignancies, red.: M. Witt, M. Dawidowska, T. Szczepanski. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 2012, 325-339

[5] Dalva K., Beksac M. HLA typing with sequence-specific oligonucleotide primed PCR (PCR-SSO)and use of the Luminex technology. Methods Mol. Med., 2007; 134: 61-69 [6] Schaffer M., Olerup O.: HLA-AB typing by polymerase-chain reaction with sequence-specific primers: more accurate, less errors, and increased resolution compared to serological typing. Tissue Antigens, 2001; 58: 299-307

[7] Turner D.M., Poles A., Brown J. i wsp.: HLA-A typing by reference strand-mediated conformation analysis (RSCA) using a capillary-based semi-automated genetic ana-lyser. Tissue Antigens, 1999; 54: 400-404

[8] Sanger F.: The Croonian Lecture, 1975. Nucleotide sequences in DNA. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 1975; 191: 317-333

[9] Voelkerding K.V., Dames S.A., Durtschi J.D.: Next-generation sequencing: from basic research to diagnostics. Clin. Chem., 2009; 55: 641-658

[10] King C.R., Scott-Horton T.: Pyrosequencing: a simple method for accurate genoty-ping. Methods Mol. Biol., 2007; 373: 39-56

[11] National Marrow Donor Program, web page, Edition: Sep 24, 2012,http://www. marrow-donor.org/cgi-bin/DNA/dnatyp.pl

[12] Cano P., Klitz W., Mack S.J. i wsp.: Common and well-documented HLA alleles: report of the Ad-Hoc committee of the american society for histocompatiblity and immu-nogenetics. Hum. Immunol., 2007; 68: 392-417

[13] Tiercy J.M., Nicoloso G., Passweg J. i wsp.: The probability of identifying a 10/10 HLA allele-matched unrelated donor is highly predictable. Bone Marrow Transplant., 2007; 40: 515-522

[14] Nowak J., Graczyk-Pol E., Mika-Witkowska R., Zajko M., Rogatko-Koro´s M., Sak-Budzisz J.: Skuteczno´s´c poszukiwania przez O´srodek Instytutu Hematologii i Trans-fuzjologii niespokrewnionych dawców komórek krwiotwórczych w krajowych i za-granicznych rejestrach w latach 2001-2006 dla pacjentów z ostrymi i przewlekłymi białaczkami. Postepy Nauk Med., 2007; 20: 298-303

[15] Nowak J., Mika-Witkowska R., Siwik D., Zajko M., Łopacz P., Sak-Budzisz J.: Porów-nanie wyników typowania antygenów HLA klasy I uzyskanych metodami serologicz-nymi i molekularserologicz-nymi – analiza bł˛edów. Acta Haematol. Pol., 2004; 35, 251-257 [16] J˛edrzejczak W.W.: Aktualne wskazania do przeszczepiania krwiotwórczych komórek

macierzystych. Acta Haematol. Pol., 2009; 40: 305–311

[17] Nowak J.: Role of HLA in hematopoietic SCT. Bone Marrow Transplant., 2008; 42 Suppl. 2: S71-76

(21)

1. Wykorzystanie genotypowania HLA w procedurach doboru ...

[18] Nowak J., Wachowiak J.: Genetic basis of donor-recipient matching in allogeneic transplantation of hematopoietic stem cells. w: Molecular Aspects of Hematologic Malignancies, red.: M. Witt, M. Dawidowska, T. Szczepanski. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 2012, 237-254

[19] Petersdorf E.W., Gooley T., Malkki M. i wsp.: Clinical significance of donor-recipient HLA matching on survival after myeloablative hematopoietic cell transplantation from unrelated donors. Tissue Antigens, 2007; 69 Suppl. 1: 25-30

[20] Bray R.A., Hurley C.K., Kamani N.R. i wsp.: National marrow donor program HLA matching guidelines for unrelated adult donor hematopoietic cell transplants. Biol. Blood Marrow Transplant., 2008; 14: 45-53

[21] Tiercy J.M., Nicoloso G., Passweg J. i wsp.: The probability of identifying a 10/10 HLA allele-matched unrelated donor is highly predictable. Bone Marrow Transplant., 2007; 40: 515-522

[22] Nowak J., Mika-Witkowska R., Zajko M., Lopacz P.: Reliability of HLA-Cw data col-lected in unrelated bone marrow registry and their usefulness for preliminary donor selection. Int. J. Immunogenet., 2005; 32: 319-322

[23] Nowak J.: Dobór dawców komórek krwiotwórczych. w: Podstawy immunogenetyki transplantacyjnej, red.: J. Nowak, J. Fabija ´nska-Mitek. Pro Pharmacia Futura, War-szawa 2012, 82-91

[24] Marosz-Rudnicka A., Mika-Witkowska R., Graczyk-Pol E., Długok˛ecka A., Rogatko-Koro´s M., Nowak J.: Immunogenetyczny dobór dawcy allogenicznych krwiotwór-czych komórek macierzystych. Hematologia, 2012; 3(3): 1-10

[25] Kamani N., Spellman S., Hurley C.K. i wsp.: State of the art review: HLA matching and outcome of unrelated donor umbilical cord blood transplants. Biol. Blood Marrow Transplant., 2008; 14: 1-6

(22)

R O Z D Z I A Ł

2

B

ANKI KRWI P ˛

EPOWINOWEJ

W

P

OLSCE I NA ´

SWIECIE

Anna Maria Gronkowska, El˙zbieta Urbanowska

Pracownia Immunogenetyki, Bank Komórek Krwiotwórczych, Klinika Hematologii, Onkologii i Chorób Wewn˛etrznych, SP CSK WUM, Warszawa

Streszczenie

Krew p˛epowinowa oraz bogato ukrwione ło˙zysko s ˛a elementami odpadowymi po urodzeniu dziecka, pomimo obecno´sci w nich wyj ˛atkowo du˙zej liczby krwio-twórczych komórek macierzystych. Unikalno´sci ˛a tych komórek jest zdolno´s´c do samoodnawiania si˛e i ró˙znicowania i z tego powodu stanowi ˛a niezwykle cenny ma-teriał transplantacyjny, którego wykorzystanie podlega jednak pewnym ogranicze-niom. Pobran ˛a krew p˛epowinow ˛a, która po poddaniu preparatyce jest nast˛epnie zamra˙zana, przechowuje si˛e na całym ´swiecie w prywatnych lub publicznych tzw. bankach krwi p˛epowinowej. Zało˙zeniem autorek niniejszego opracowania jest po-kazanie mo˙zliwie jak najobiektywniej i najszerzej aspektów przydatno´sci zbiera-nia i przechowywazbiera-nia długoterminowo, w gł˛ebokim zamro˙zeniu, w akredytowa-nych bankach krwi p˛epowinowej, jako szybko dost˛epnego ´zródła komórek macie-rzystych, przede wszystkim krwiotwórczych do ich u˙zycia w transplantacjach alo-genicznych od dawców spokrewnionych i niespokrewnionych.

Słowa kluczowe: krew p˛epowinowa, badania immunogenetyczne, HLA, transplantacja,

CBU, banki krwi p˛epowinowej

2.1. Wst˛ep

Od przeszło 25 lat przeszczepianie alogenicznych komórek krwiotwórczych jest na ´swiecie powszechnie uznan ˛a metod ˛a leczenia chorób nowotworowych krwi i innych oraz tak˙ze ró˙znych nieprawidłowo´sci układu krwiotwórczego. Dla ponad połowy chorych, u których w ramach post˛epowania klinicznego rozwa-˙zana jest transplantacja krwiotwórczych komórek macierzystych nie ma mo˙zli-wo´sci na znalezienie potencjalnego dawcy w rejestrach kandydatów. Znalezie-nie odpowiedZnalezie-niego dawcy wymaga całkowitej identyczno´sci z biorc ˛a w zakresie antygenów zgodno´sci tkankowej (ang. human leukocyte antigens, HLA) zarówno klasy I – locus A, B i C oraz klasy II – locus DRB1 i DQB1 i coraz cz˛e´sciej tak˙ze DPB1 na poziomie wysokiej rozdzielczo´sci, co stanowi nadal realny problem dla transplantologów [1].

(23)

2. Banki krwi p˛epowinowej w Polsce i na ´swiecie

2.2. Krwiotwórcze komórki macierzyste z krwi

p˛epowinowej

Komórki macierzyste to niezró˙znicowane, pierwotne komórki, z których po-wstaj ˛a wszystkie komórki ludzkich tkanek, w tym równie˙z i krwi. Krwiotwórcze komórki macierzyste (KKM) maj ˛a unikaln ˛a cech˛e samoodnowy i ró˙znicowania si˛e, dzi˛eki czemu przez całe ˙zycie odtwarzana jest krew i układ odporno´sciowy. W zwi ˛azku z t ˛a unikaln ˛a zdolno´sci ˛a mo˙zna nimi zast ˛api´c chory szpik w przy-padku ró˙znych chorób nowotworowych krwi (białaczki, chłoniaki i in.), wrodzo-nych niedokrwisto´sci, nabytych anemii aplastyczwrodzo-nych, niedoborów immunolo-gicznych lub niektórych chorób metabolicznych i w ten sposób uratowa´c ˙zycie choremu [2].

Krew p˛epowinowa i bogato ukrwione ło˙zysko zawieraj ˛a krwiotwórcze

ko-mórki macierzyste. Po urodzeniu dziecka s ˛a jednak elementami odpadowymi

cho´c ze wzgl˛edu na unikalne cechy zawartych komórek stanowi ˛a niezwykle

cenny materiał transplantacyjny. Pobrana krew p˛epowinowa poddawana jest od razu laboratoryjnemu opracowaniu – pomiarom obj˛eto´sci zebranego preparatu i zawarto´sci w nim komórek CD34+, które s ˛a standardowym markerem krwiotwór-czych komórek macierzystych. Nast˛epnie podlega ona wytypowaniu technikami na poziomie DNA pod wzgl˛edem antygenów zgodno´sci tkankowej HLA w co naj-mniej trzech loci, tj. A, B i DR, ocenie ich ˙zywotno´sci w specjalnej hodowli oraz stanu bakteriologicznego preparatu. Po wykonaniu tych czynno´sci, krew p˛epo-winowa podlega gł˛ebokiemu zamro˙zeniu i przechowywana jest w specjalnych zbiornikach z ciekłym azotem, w których zbankowana oczekuje na wykorzysta-nie. Przeszczepienie odbywa si˛e bezpo´srednio po rozmro˙zeniu materiału przy łó˙zku chorego i bez uszkodzenia zdolno´sci tych komórek do samoodnowy oraz umiej˛etno´sci ponownego zasiedlenia w szpiku biorcy.

KKM pozyskane z krwi p˛epowinowej charakteryzuj ˛a si˛e du˙z ˛a plastyczno´sci ˛a immunologiczn ˛a, poniewa˙z s ˛a to tzw. komórki naiwne, czyli wykazuj ˛ace wi˛ek-sz ˛a dynamik˛e proliferacyjn ˛a oraz zdolno´s´c ró˙znicowania. Do´swiadczalnie stwier-dzono ich wi˛eksz ˛a skłonno´s´c do transdyferencjacji i tworzenie wi˛ekszych kolo-nii [3, 4]. Maj ˛a tak˙ze inne wymagania, co do czynników wzrostowych i zacho-wuj ˛a ekspansywno´s´c i ˙zywotno´s´c po długim okresie inkubacji in vitro. Wykazuj ˛a mniejsz ˛a alloreaktywno´s´c limfocytów ze wzgl˛edu na niedojrzało´s´c układu

odpor-no´sciowego noworodka. Mimo pocz ˛atkowej immunologicznej niekompetencji

limfocyty zachowuj ˛a pełn ˛a zdolno´s´c do aktywacji i rozwijaj ˛a sprawnie działaj ˛ac ˛a lini˛e obrony immunologicznej organizmu biorcy.

Dodatkowym aspektem wykorzystywania krwi p˛epowinowej jako ´zródła KKM jest brak w ˛atpliwo´sci natury etycznej, co do ich wykorzystania w medycynie w przeciwie ´nstwie do embrionalnych komórek macierzystych. Brak jest równie˙z jakiegokolwiek ryzyka zwi ˛azanego z uzyskiwaniem takiego materiału transplan-tacyjnego od dawców. Metody pobierania krwi p˛epowinowej s ˛a całkowicie niein-wazyjne, bardzo proste i niedrogie, a zdeponowana w banku jednostka jest do-st˛epna do natychmiastowego u˙zycia w celu przeszczepienia. Ponadto, co jest niezwykle wa˙zne brak w niej obecno´sci tych komórek nowotworowych, które

(24)

2.3. Transplantacje krwi p˛epowinowej powstaj ˛a w pó´zniejszym okresie ˙zycia pod wpływem ´srodowiska zewn˛etrznego. Ze wzgl˛edu na brak komórek immunokompetentnych znacznie mniejsze jest ryzyko powikła ´n zaka´znych oraz wyst ˛apienia reakcji przeszczep przeciwko go-spodarzowi (GvHD) ze wzgl˛edu na wi˛eksz ˛a tolerancj˛e pod wzgl˛edem antygenów zgodno´sci tkankowej [5]. Uwa˙za si˛e, ˙ze krwiotwórczych komórek macierzystych w krwi p˛epowinowej jest ich nawet do 10 x wi˛ecej ni˙z w szpiku czy krwi obwodo-wej. Wykazano równie˙z, ˙ze w´sród komórek krwi p˛epowinowej wyst˛epuje wi˛ekszy odsetek komórek macierzystych ni˙zej uorganizowanych w hierarchii krwiotwo-rzenia oraz, ˙ze wykazuj ˛a one wi˛ekszy potencjał do ekspansji i proliferacji w po-równaniu z komórkami szpiku lub krwi obwodowej [6, 7]. Zatem mniejsza liczba komórek krwiotwórczych jest w stanie zrekonstruowa´c chory szpik u biorcy, co do niedawna stanowiło istotne ograniczenie, je´sli chodzi o zastosowanie jednostek gromadzonych w bankach krwi p˛epowinowej na ´swiecie.

2.3. Transplantacje krwi p˛epowinowej

Pierwszego przeszczepienia alogenicznego jednostki krwi p˛epowinowej (CBUT) z powodzeniem dokonała Professor Eliane Gluckman w 1988 u dziecka z anemi ˛a Fanconi’ego w klinice w Pary˙zu [7]. Dawc ˛a była identyczna pod wzgl˛e-dem antygenów HLA siostra. Pacjent z pełn ˛a rekonstrukcj ˛a hematopoetyczn ˛a i limfoidaln ˛a do dzi´s czuje si˛e dobrze. Ten pierwszy sukces otworzył drog˛e do nowego pola w dziedzinie alogenicznych transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych [6–8]. Od tego te˙z momentu datuje si˛e pocz ˛atek tworzenia i orga-nizacji banków krwi p˛epowinowych.

Istnieje jednak powszechna opinia, ˙ze obj˛eto´s´c jednej jednostki krwi p˛epo-winowej wahaj ˛aca si˛e na ogół od kilkudziesi˛eciu mililitrów do co najwy˙zej 100 ml, zawieraj ˛aca niewiele ponad miliard hematopoetycznych komórek wystarcza´c mo˙ze do bezpiecznego przeszczepienia i odnowy krwiotworzenia tylko u dziecka o masie ciała do 30 kg. Jest to zdecydowanie za mało komórek, aby efektywnie zabezpieczy´c krwiotworzenie u dorosłego pacjenta po mieloablacji, to znaczy wyeliminowaniu chemioterapi ˛a komórek nowotworowych. A jak dot ˛ad wszyst-kie próby in vitro tzw. ekspansji prowadzone intensywnie w latach 90 ko ´nca XX wieku, czyli namno˙zenia krwiotwórczych komórek macierzystych krwi p˛epowi-nowej i uzyskiwania w ten sposób wi˛ekszej liczby komórek nie powiodły si˛e i wzbudzaj ˛a coraz mniejsze zainteresowanie naukowców [4]. Zwi˛ekszenia liczby komórek krwiotwórczych dokonano wi˛ec z powodzeniem poprzez wykorzystanie kilku jednostek CBU do zabiegu przeszczepienia u dorosłych chorych [9–12].

Pierwszy zabieg przeszczepienia krwi p˛epowinowej w Polsce wykonali w 1994 r. u chłopca z ostr ˛a białaczk ˛a szpikow ˛a prof. A. Lange we współpracy z prof. W.W. J˛edrzejczakiem. Natomiast w 2003 r. w Klinice Hematologii, Onko-logii i Chorób Wewn˛etrznych WUM dokonano przeszczepienia wi˛ecej ni˙z jednej jednostki krwi p˛epowinowej u 21-letniego chłopaka z ostr ˛a białaczk ˛a oporn ˛a na chemioterapi˛e, dla którego nie mo˙zna było znale´z´c dawcy niespokrewnionego w realnie szybkim czasie ze wzgl˛edu na rozwój choroby i konieczno´sci szybko przeprowadzonego zabiegu z punktu widzenia jego skuteczno´sci [13]. Podano 23

(25)

2. Banki krwi p˛epowinowej w Polsce i na ´swiecie

dwie jednostki krioprezerwowanej krwi p˛epowinowej ró˙zni ˛ace si˛e ł ˛acznie trzema antygenami HLA z biorc ˛a. Ró˙znice dotyczyły locus A oraz locus DR. Całkowita liczba przeszczepionych TNC wynosiła 2,2 ×107/kg m.c. biorcy, a komórek CD34 0,5 ×107/kg m.c. biorcy. Ł ˛aczna liczba przeszczepionych prekursorowych komó-rek krwiotwórczych tworz ˛acych kolonie erytroidalne wynosiła 2,2 ×104/kg m.c. biorcy, a liczba komórek prekursorowych tworz ˛acych kolonie granulocytarno-makrofagowe wynosiła 2,25 ×104/kg m.c. biorcy. Biorca posiadał grup˛e krwi O Rh dodatni ˛a, natomiast pierwsza jednostka krwi p˛epowinowej miała grup˛e A Rh ujemn ˛a, a druga jednostka grup˛e krwi B Rh dodatni ˛a. Chory zmarł w 103 dobie po przeszczepieniu na skutek objawów niewydolno´sci oddechowej. W badaniu cytologicznym wykonanym w setnej dobie po przeszczepieniu stwierdzono bo-gatokomórkowy i prawidłowy cytologicznie szpik. W ramach analizowania za-stosowanego post˛epowania klinicznego u chorego wykonano badanie typowania HLA w celu okre´slenia, które komórki macierzyste zregenerowały szpik. Stwier-dzenie po przeszczepieniu dwóch ró˙znych pod wzgl˛edem HLA CBU obecno´sci antygenu jednego z antygenów HLA DRB1 na limfocytach chorego, którego przed transplantacj ˛a nie okre´slono, wskazuje na rekonstrukcj˛e szpiku przez KKM po-chodz ˛ace z jednej z przeszczepionych jednostek [13]. Na ´swiecie po raz pierw-szy wykonano podobny zabieg transplantacji dwóch CBU u dorosłego chorego w 2001 r. w USA [35].

Z kolei w marcu 2007 r. pierwszy raz u˙zyto do transplantacji krwi p˛epowino-wej, która wcze´sniej została pobrana, przetworzona i przechowywana w prywat-nym banku od 2004 r. Przeszczepienie wykonano w Klinice Hematologii Dzieci˛e-cej we Wrocławiu u 8-letniej siostry noworodka, dziewczynki chorej na neurobla-stom, która ˙zyje dotychczas.

W ostatnich latach odnotowuje si˛e coraz wi˛eksze wykorzystywanie w trans-plantologii macierzystych komórek krwiotwórczych pozyskanych z krwi p˛epo-winowej i zdeponowanych w stanie gł˛ebokiego zamro˙zenia w tzw. bankach krwi p˛epowinowej. Co prawda znacz ˛ac ˛a przewag ˛a w przypadku przeszczepiania ko-mórek krwiotwórczych pochodz ˛acych z krwi p˛epowinowej jest akceptowalno´s´c mniejszego zakresu zgodno´sci HLA pomi˛edzy dawc ˛a a biorc ˛a zwi ˛azanego z nie-dojrzało´sci ˛a tych komórek i nie wykształcenia na ich powierzchni markerów zgodno´sci tkankowej. W przypadku transplantacji krwi p˛epowinowej dopusz-czalna jest zgodno´s´c w zakresie czterech loci A, B, C i DRB1, a nie co najmniej jednej niezgodno´sci, jak w przypadku dobrania ˙zywego dawcy krwiotwórczych komórek ze szpiku lub z krwi obwodowej. Przeszczepianiu komórek krwi p˛epo-winowej z reguły towarzyszy słabszy przebieg choroby „przeszczep przeciw go-spodarzowi” (GvHD) a i cz˛e´sciej efekt „przeszczepu przeciw białaczce” (GvLR) bardzo po˙z ˛adanego u niektórych chorych. Oba te czynniki maj ˛a istotne znacze-nie w podnoszeniu zainteresowania zbieraznacze-niem i „bankowaznacze-niem” jednostek krwi p˛epowinowej, co umo˙zliwia łatwiejsz ˛a dost˛epno´s´c do takiego materiału trans-plantacyjnego, zwłaszcza ˙ze jest to materiał ju˙z opracowany pod wzgl˛edem la-boratoryjnym. Oznacza to, ˙ze macierzyste komórki krwiotwórcze s ˛a przebadane pod wzgl˛edem bakteriologicznym i wirusologicznym, policzone oraz sprawdzony został ich potencjał biologiczny. Wobec tego zostało wykazane naukowo, ˙ze

(26)

2.4. Wybór ´zródła KKM do transplantacji mniejsza liczba komórek CBU jest w stanie zrekonstruowa´c chore krwiotworze-nie u biorcy, co dotychczas uwa˙zano na ´swiecie za podstawowe ograniczekrwiotworze-nie ich zastosowania. W ostatnim czasie pojawiło si˛e przypuszczenie, ˙ze sposo-bem omini˛ecia kwestii małej liczby komórek krwiotwórczych w pozyskiwanych przez banki jednostkach CB mo˙ze by´c przeszczepienie równolegle kilku jedno-stek i w ten sposób zwi˛ekszenie liczby multipotencjalnych komórek w materiale transplantacyjnym. Obecnie na ´swiecie wykonano ju˙z ponad 1500 takich trans-plantacji [14]. Zastosowanie wi˛ecej ni˙z jednej CBU wykazały, ˙ze prowadzi ono do szybszej odnowy układu krwiotworzenia u biorcy przeszczepu, pomimo ˙ze wsz-czepieniu ulega zawsze tylko jedna z jednostek, co wykazano badaniem chimery-zmu potransplantacyjnego [15]. Badanie chimerychimery-zmu obrazuje na poziomie ge-netycznym, które komórki rekonstruuj ˛a zniszczone komórki biorcy. Okazało si˛e, ˙ze u pacjenta po transplantacji wykrywane s ˛a tylko markery charakterystyczne dla jednej z nich [13, 16]. Mechanizmy le˙z ˛ace u podstaw tej obserwacji nie s ˛a znane. Badania z 2005 roku dowiodły, ˙ze komórki CBU, która nie uległa wszcze-pieniu spełniaj ˛a rol˛e pomocnicz ˛a dla komórek wszczepiaj ˛acych si˛e. Komórki

me-zenchymalne obecne równie˙z w CBU prawdopodobnie wspomagaj ˛a

wszczepie-nie komórek macierzystych jednej z kilku jednocze´swszczepie-nie podawanych jednostek i to tej, która zawiera wi˛eksz ˛a liczb˛e limfocytów T CD3+. Komórki mezenchy-malne mog ˛a wykazywa´c działanie supresyjne na limfocyty T CD3+ [17].

2.4. Wybór ´zródła KKM do transplantacji

Kryteria wyboru materiału transplantacyjnego zostały opracowane i zapropo-nowane przez V. Rocha i E. Gluckman [18]. Zgodnie z wytycznymi Europejskiej Grupy Przeszczepiania Szpiku EBMT do przeszczepienia alogenicznych KKM wy-bór rodzaju materiału transplantacyjnego zale˙zy przede wszystkim od zgodno´sci w HLA. W przypadku krwi p˛epowinowych dla CBU dotyczy to zgodno´sci w za-kresie HLA A, B i DRB1 na poziomie alleli, przy czym zgodno´s´c w HLA C jest nie brana pod uwag˛e. Tak˙ze zgodno´s´c alleliczna w HLA A i B generalnie nie jest roz-wa˙zana. Preferowana jest bardziej ró˙znica w A lub B ni˙z ró˙znica w DRB1 [5, 22]. Ponadto, niezb˛edna jest okre´slona liczba KKM w materiale transplantacyjnym, w tym liczba całkowita komórek j ˛adrzastych w zale˙zno´sci od stopnia zgodno´sci z chorymi w zakresie HLA:

• przy zgodno´sci 5/6 min. 2.5 ×107/kg TNC przed mro˙zeniem – 2.0 ×107/kg (po rozmro˙zeniu),

• przy zgodno´sci 4/6 min. 3.5 ×107/kg TCN przed mro˙zeniem – 3.0 ×107/kg (po rozmro˙zeniu),

oraz liczba komórek CD34 1.2 – 1.7 ×105/kg masy ciała biorcy. W Tabeli 2.1

przedstawiono warto´sci w ró˙znych materiałach transplantacyjnych dla krwio-twórczych komórek macierzystych uwzgl˛edniaj ˛ace liczby komórek jednoj ˛ adrza-stych CD3 i CD34 pozytywnych oraz wymagania dotycz ˛ace biorcy.

Wiadomo, ˙ze najlepszym dawc ˛a jest rodzony brat albo siostra, ale nie wszyscy chorzy mog ˛a mie´c takiego klasycznego dawc˛e. Zgodnie z prawami dziedziczenia 25

(27)

2. Banki krwi p˛epowinowej w Polsce i na ´swiecie

Tabela 2.1: Warto´sci krwiotwórczych komórek macierzystych (KKM) w ró˙znych materia-łach transplantacyjnych [27]. Rodzaj KKM Obj˛eto´s´c (kg m.c. dawcy) Zawarto´s´c CD34+ (liczba kom./ kg m.c. biorcy) Zawarto´s´c CD3+ (liczba kom./ kg m.c. biorcy) Dawka (liczba kom./ kg m.c. biorcy) Szpik 10-20 ml/kg 2-3×106/kg 25×106/kg >2×108 TNC/kg Krew obwodowa po mobilizacji 150-400 ml 8×106/kg 250×106/kg 5-10×106 CD34+/kg Krew p˛epowi-nowa 80-160 ml 0.2×106/kg 4×106/kg >3×107 TNC/kg tylko co czwarty brat lub siostra odziedziczy te same geny HLA od obojga rodzi-ców. Zale˙znie od wielko´sci rodzin, chory cz˛e´sciej lub rzadziej mo˙ze otrzyma´c ko-mórki krwiotwórcze od dawcy spokrewnionego. Statystyki mówi ˛a, ˙ze tylko około 35 % chorych ma zgodnego w HLA rodzinnego dawc˛e komórek krwiotwórczych. Pozostali chorzy wówczas zostaliby pozbawieni mo˙zliwo´sci zastosowania u nich takiej terapii. Przeszło 60% chorych zale˙znych jest od niespokrewnionego dawcy, inaczej nazywanego dawc ˛a alternatywnym i musz ˛a oczekiwa´c na znalezienie nie-spokrewnionego dawcy o identycznych antygenach HLA w rejestrach na ´swiecie. Transplantacje krwi p˛epowinowej s ˛a całkowicie bezpieczne, jednak maj ˛a ograniczenie spowodowane ilo´sci ˛a zbieranego materiału. Krew tak ˛a pobiera si˛e zawsze po odp˛epnieniu noworodka. Pozostaje ona w ło˙zysku i odci˛etej p˛epo-winie, a pobranie jej nie wyrz ˛adza jakiejkolwiek krzywdy ani matce ani dziecku. Zwykle udaje si˛e pozyska´c małe obj˛eto´sci około 100 ml lub nieco wi˛ecej. Z tego wzgl˛edu najlepsze wyniki przeszczepiania uzyskuje si˛e u biorców, którymi s ˛a dzieci z chorobami nienowotworowymi, wa˙z ˛acymi do 10 kg. W ostatnim okresie przeszło 7% transplantacji w Europie odbywa si˛e z zastosowaniem alogenicznych KKM pochodz ˛acych z krwi p˛epowinowej [7, 19, 20, 23].

Zgodnie z wytycznymi Europejskiej Grupy Przeszczepiania Szpiku do

prze-szczepienia alogenicznych komórek krwiotwórczych kwalifikowani s ˛a chorzy

z ró˙znymi rozpoznaniami. Lista chorób, które leczone s ˛a transplantacjami krwio-twórczych komórek macierzystych stale si˛e wydłu˙za. Jednocze´snie zabieg taki powinien by´c elementem planowanego leczenia od momentu rozpoznania cho-roby. Preferowany jest zabieg od najlepszego z mo˙zliwych dawców ze wszystkich dost˛epnych ´zródeł [22].

2.5. Współpracuj ˛

ace organizacje mi˛edzynarodowe

Na ´swiecie tylko dla około 40% chorych wymagaj ˛acych transplantacji udaje si˛e znale´z´c potencjalnego dawc˛e komórek krwiotwórczych. Zasadniczym ´zródłem

poszukiwania s ˛a rejestry niespokrewnionych dawców komórek krwiotwórczych

i banki krwi p˛epowinowej tj. placówki przechowuj ˛ace wytestowane pod wzgl˛e-dem tkankowym i infekcyjnym jednostki krwi p˛epowinowej na ´swiecie.

(28)

2.5. Współpracuj ˛ace organizacje mi˛edzynarodowe W 1974 r. w Maastricht w Holandii ustanawiaj ˛ac wspólnie z naukowcami i

le-karzami uczestnicz ˛acymi w klinicznych transplantacjach komórek

krwiotwór-czych powołano do ˙zycia organizacj˛e – European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT) - w celu dzielenia si˛e swoimi do´swiadczeniami i pod-noszeniem wiedzy. Organizacja ta bazuje na umowie przedstawicieli krajów za-anga˙zowanych w wykonywanie tego rodzaju zabiegów i funkcjonuje na zasadzie non-profit. Zarz ˛ad EBMT odpowiada za wszystkie wypracowane decyzje i zasady, które podejmuje w drodze głosowania. Jej członkami s ˛a poszczególne aktywne o´srodki wykonuj ˛ace ka˙zdego rodzaju transplantacje krwiotwórczych komórek macierzystych oraz inne instytucje zaanga˙zowane w opiek˛e dawców i biorców. Rozró˙znia si˛e pełne członkostwo i tzw. towarzysz ˛ace, zwi ˛azane ze raportowaniem danych o transplantacjach do prowadzonego przez EBMT rejestru. Osoby aktyw-nie zaanga˙zowane w dziedziaktyw-nie transplantacji szpiku mog ˛a ubiega´c si˛e o indywi-dualne członkostwo w EBMT. Nowi członkowie przyjmowani s ˛a po przesłaniu do biura EBMT formularza wniosku o członkostwo. Wniosek zawiera podpisy dwóch osób z o´srodków, które ju˙z posiadaj ˛a członkostwo w EBMT. Po przyj˛eciu wniosku, sekretarz EBMT przyznaje tymczasowe członkostwo oraz kod identyfikacyjny dla o´srodka tzw. Centre Identification Code (CIC). Na odbywaj ˛acym si˛e okresowo walnym zgromadzeniu sekretarz przedstawia wszystkie wnioski o członkostwo i po ich zatwierdzeniu na posiedzeniu o´srodek staje si˛e odpowiednio - pełnym

członkiem EBMT, towarzysz ˛acym lub indywidualnym.

W 1988 r. z inicjatywy Immunology Working Party działaj ˛acej w ramach euro-pejskiej organizacji transplantacji szpiku EBMT rozpocz˛eła działalno´s´c I-sza edy-cja internetowej bazy danych o dawcach komórek hematopoetycznych. Kompu-terowa baza immunogenetycznych danych o antygenach zgodno´sci tkankowej zdrowych ochotników na całym ´swiecie została opublikowana na stronie inter-netowej Bone Marrow Donor Worldwide (BMDW z biurem w Leiden, Holandia) w lutym 1989 r. i zawierała dane o 155 000 dawców z 8 rejestrów.

Co miesi ˛ac rejestry zrzeszone w ramach BMDW przesyłaj ˛a aktualizacj˛e zawar-to´sci swoich baz elektronicznych do centralnego serwera. Organizacja BMDW stanowi dobrowolny wspólny wysiłek rejestrów niespokrewnionych dawców ko-mórek krwiotwórczych i banków krwi p˛epowinowej na ´swiecie. Kierownictwo tej organizacji stanowi jeden przedstawiciel z ka˙zdego rejestru dawców albo banku krwi p˛epowinowej i spotyka si˛e dwa razy do roku w celu omówienia osi ˛agni˛e´c i niezb˛ednych aktualnych zagadnie ´n organizacyjnych, prawnych i administracyj-nych.

O´srodki zajmuj ˛ace si˛e poszukiwaniem i doborem materiału transplantacyj-nego korzystaj ˛a na stronie internetowejwww.bmdw.orgz wyszukiwarki, pozwala-j ˛acej na znalezienie wszystkich dost˛epnych na ´swiecie kandydatów na dawców komórek krwiotwórczych dla potrzebuj ˛acego chorego pod warunkiem, ˙ze znane s ˛a HLA A, B i DR chorego. Uprawnieni u˙zytkownicy z tych o´srodków transplan-tacyjnych lub rejestrów i banków otrzymuj ˛a hasło i kod dost˛epu do bazy w celu wyłonienia odpowiedniego tj. w pełni zgodnego pod wzgl˛edem HLA, dawcy nie-spokrewnionego lub jednostki krwi p˛epowinowej, co nast˛epnie wymaga akcepta-cji o´srodka transplantacyjnego wykonuj ˛acego zabieg. Na szybko´s´c tego działania

(29)

2. Banki krwi p˛epowinowej w Polsce i na ´swiecie

Tabela 2.2: Wynik przeszukania jednostek krwi p˛epowinowych w bazie BMDW (dane BMDW z dn. 27 sierpnia 2012,http://www.bmdw.org/).

istotnie wpływa cz˛esto´s´c wyst˛epowania podobnych antygenów HLA w okre´slonej populacji.

Do stałych inicjatyw BMDW nale˙zy maksymalizowanie szansy na znajdowa-nie potencjalnych i dost˛epnych dawców komórek macierzystych albo jednostek krwi p˛epowinowej poprzez dostarczanie nowozrekrutowanych i opisanych feno-typowo HLA dawców i jednostek krwi p˛epowinowej dost˛epnych na całym ´swie-cie. Ponadto, nale˙zy te˙z dostarczanie istotnych powszechnych informacji z my-´sl ˛a o pacjencie, a tak˙ze przedstawianie statystyk mówi ˛acych o wzro´scie zasobów ró˙znych rejestrów dawców i banków CB, opisanych pod wzgl˛edem HLA dawców. W przypadku banków CB ka˙zda zgromadzona jednostka opisana zostaje równie˙z w zakresie jej obj˛eto´sci i zawarto´sci komórek jednoj ˛adrzastych. Przykładowy wy-nik przegl ˛adu internetowej bazy BMDW dla biorcy o okre´slonym HLA przedsta-wia Tabela 2.2.

´Swiatowa baza dost˛epnych dawców komórek krwiotwórczych BMDW funk-cjonuje w zgodzie z zaleceniami ustalanymi przez Europejsk ˛a Fundacj˛e Daw-ców - Eurodonor Foundation oraz pod auspicjami ´swiatowej organizacji dawDaw-ców

szpiku - World Marrow Donor Association (WMDA z siedzib ˛a w Leiden,

Cytaty

Powiązane dokumenty

Microbial contamination of peripheral blood and bone marrow hematopoietic cell products and environmental contamination in a stem cell bank: a single‑center report.

Warto zwrócić uwagę na to, że wśród najczęściej wymienianych proble- mów związanych z donacją nie ma bólu; dawcy, od których pobiera się komórki krwi obwodowej,

Rosnąca w kolejnych latach liczba donacji autologicznych PBSC świad- czy o ewolucji przeszczepienia komórek macierzystych od terapii eksperymentalnej do powszech- nie uznanej i

Postępowanie takie jest uzasadnione, ponieważ koncentraty krwinek płytkowych należą do składników krwi najbardziej narażonych na ryzyko zakażeń bakteryjnych ze względu na

1. Dzieci, które spełniają wymagania medyczne, aby zostać dawcami, mogą, zgodnie z zasadami etyki, być dawcami krwiotwórczych komórek macierzystych, jeśli zostanie spełnionych

Z po wo du he te ro gen no ści da nych na te mat umie ral no ści na OIOM -ie, w ce lu oce ny wpły wu nie za leż nych czyn ni ków pro gno stycz nych na umie ral ność, prze pro wa dzo

Jego wartość zwiększa się proporcjonalnie do gra- dientu prędkości przepływu określonej warstwy cieczy t oraz współczynnika lepkości cieczy h zgod- nie ze wzorem:.. t =

Wyniki: We krwi osób z chorobą niedokrwienną serca przed zabiegiem stwierdzono wyższe stężenie selektyny E, selektyny P i fibrynogenu oraz obniżoną liczbę płytek krwi.. W