ISBN 978-83-61512-40-0
BADANIA
IMMUNOGENETYCZNE
W TRANSPLANTOLOGII
I DIAGNOSTYCE
Katarzyny Boguni-Kubik
B
A
D
A
N
IA
IM
M
U
N
O
G
E
N
E
T
Y
C
Z
N
E
W
T
R
A
N
S
P
L
A
N
T
O
L
O
G
II
I D
IA
G
N
O
S
T
Y
C
E
stron 221 - grzbiet 11,28mm
BADANIA
IMMUNOGENETYCZNE
W TRANSPLANTOLOGII
I DIAGNOSTYCE
Praca zbiorowa pod redakcj ˛
a
Skład komputerowy, projekt okładki
Tomasz Kubik
Ksi ˛a˙zka udost˛epniana na licencji Creative Commons: Uznanie autorstwa-U˙zycie
niekomercyjne-Na tych samych warunkach 3.0, Wrocław 2012. Pewne prawa
zastrze˙zone na rzecz Autorów i Wydawcy. Zezwala si˛e na niekomercyjne wykorzy-stanie tre´sci pod warunkiem wskazania Autorów i Wydawcy jako wła´scicieli praw do tekstu oraz zachowania niniejszej informacji licencyjnej tak długo, jak tylko na utwory zale˙zne b˛edzie udzielana taka sama licencja. Tekst licencji dost˛epny na stronie: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/pl/
ISBN 978-83-61512-40-0
Wydawca
I-BIS S.C.
Druk i oprawa
I-BiS S.C., ul. Lelewela 4, 53-505 Wrocław
S
PIS TRE ´
SCI
Słowo wst˛epne 5
1. Wykorzystanie genotypowania HLA w procedurach doboru dawców krwiotwórczych komórek macierzystych
Jacek Nowak 9
2. Banki krwi p˛epowinowej w Polsce i na ´swiecie
Anna Maria Gronkowska, El˙zbieta Urbanowska 21
3. Typowanie nieklasycznych antygenów zgodno´sci tkankowej – znacze-nie w doborze pary dawca biorca alogenicznego przeszczepienia ko-mórek krwiotwórczych
Milena Iwaszko, Katarzyna G˛ebura, Katarzyna Bogunia-Kubik 40
4. Identyfkacja przeciwciał anty-HLA u chorych po przeszczepie hema-topoetycznych komórek macierzystych
Urszula Siekiera 53
5. Udział pracowni typowania tkankowego w procedurze alokacji nerek pobranych od dawców zmarłych
Michał Kolasi ´nski 58
6. Identyfikacja przeciwciał anty-HLA jako badanie zapobiegaj ˛ace od-rzucaniu humoralnemu u biorców nerek podwy˙zszonego ryzyka im-munologicznego
Gra˙zyna Moszkowska 66
7. Cz˛esto´s´c wyst˛epowania HLA DRB1*03 i DRB1*04 u potencjalnych biorców nerek
Barbara Krasnod˛ebska-Szponder, Katarzyna Galant, Izabela Czy˙zewska,
Iwona Wojciechowska-Koszko, Stefania Giedry´s-Kalemba 77
8. Próba krzy˙zowa analizowana metod ˛a cytometrii przepływowej
Barbara Pi ˛atosa 84
9. Oznaczanie wewn ˛atrzkomórkowych cytokin metod ˛a cytometrii prze-pływowej z zastosowaniem immunofluorescencji
Spis tre´sci
10. Liczba TREC jako marker diagnostyczny limfopoezy
Barbara Wysocza ´nska 100
11. Asocjacje HLA z wybranymi jednostkami chorobowymi Monika Mordak, Marzena Lenart, Rafał Szatanek,
Monika Baj-Krzyworzeka, Kazimierz W˛eglarczyk, Maciej Siedlar 111
12. Cz˛esto´s´c wyst˛epowania HLA klasy I i II u pacjentów z ostr ˛a białaczk ˛a szpikow ˛a, białaczkami limfatycznymi oraz u potencjalnych dawców szpiku
Barbara Krasnod˛ebska-Szponder, Katarzyna Galant, Izabela Czy˙zewska,
Barbara Zdziarska, Stefania Giedrys-Kalemba 126
13. Badania technikami cytogenetyki klasycznej (kariotypowanie) i flu-orescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w hematoonkologii
Barbara Pie ´nkowska-Grela 135
14. Aberracje strukturalne DNA w nowotworowych rozrostach z komórki macierzystej hematopoezy
Marta Libura, Marta Przestrzelska, Marta Wi˛esik, Karolina Karabin,
Patrycja Rybarczyk, Albert Moskowicz 145
15. STR i real-time PCR metody badania chimeryzmu poprzeszczepowego
Anna Młynarczewska 155
16. Współczesne technologie identyfikacji długo´sci telomerów
Barbara Wysocza ´nska 160
17. Genotypowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu
Lidia Karabon 170
18. Diagnostyka laboratoryjna niepo˙z ˛adanych poprzetoczeniowych reak-cji immunologicznych
Jolanta Korsak 182
19. Znaczenie standaryzacji bada ´n genetycznych: Mi˛edzylaboratoryjny Test Kontroli Jako´sci Bada ´n FISH w Hematoonkologii
Barbara Pie ´nkowska-Grela, Beata Grygalewicz 205
20. Znaczenie standaryzacji bada ´n immunogenetycznych: Warsztaty Kontroli Jako´sci Typowania HLA
S
ŁOWO WST ˛
EPNE
„Badania diagnostyczne w transplantologii i diagnostyce” to zbiór opracowa ´n dotycz ˛acych rutynowej działalno´sci laboratoriów diagnostycznych, współpracu-j ˛acych z o´srodkami medycznymi i transplantacyjnymi. Znalazły si˛e w nim rów-nie˙z doniesienia Autorów posługuj ˛acych si˛e na co dzie ´n technikami biologii mo-lekularnej w trakcie realizacji prac badawczych.
Pierwszym z poruszanych zagadnie ´n jest problem optymalnego doboru
dawcy i biorcy alogenicznego przeszczepienia komórek krwiotwórczych. Dobór ten jest rutynowo prowadzony w oparciu o potwierdzenie genetycznej zgodno-´sci mi˛edzy dawc ˛a i biorc ˛a przeszczepienia w zakresie klasycznych loci HLA klasy I (A, B, C) i klasy II (DRB1 i DQB1). W czterech pierwszych rozdziałach mono-grafii przedstawiono techniki molekularne wykorzystywane do genotypowania HLA, okre´slono zasady doboru dawcy rodzinnego i poszukiwania dawcy niepo-skrewnionego oraz omówiono udział rejestrów honorowych dawców i banków krwi p˛epowinowej. Przedyskutowano równie˙z wyniki, które wskazuj ˛a na poten-cjalne znaczenie typowania nieklasycznych loci HLA (np. HLA-E, HLA-G czy MI-CA/B) dla powodzenia alogenicznego przeszczepienia komórek krwiotwórczych, oraz przedstawiono wst˛epne dane dotycz ˛ace monitorowania przeciwciał anty-HLA u biorcy przeszczepu.
Nast˛epnym poruszanym zagadnieniem jest dobór dawcy narz ˛adu
unaczynio-nego. Opiera si˛e on na wynikach typowania HLA loci A, B, DR oraz wynikach próby krzy˙zowej. W rozdziałach od pi ˛atego do siódmego omówiono rutynow ˛a procedur˛e doboru dawcy i biorcy oraz przedstawiono trudno´sci w znalezieniu odpowiedniego dawcy dla pacjentów z grupy podwy˙zszonego ryzyka immunolo-gicznego.
Poruszone zostały aspekty zwi ˛azane ze znaczeniem obecno´sci przeciwciał anty-HLA u biorcy, z konieczno´sci ˛a okre´slania ich swoisto´sci oraz monitorowa-nia obecno´sci przeciwciał anty-HLA swoistych dla dawcy po transplantacji. W tej cz˛e´sci przedstawiono równie˙z analiz˛e porównawcz ˛a wyników typowania HLA w grupie potencjalnych biorców nerek i w populacji osób zdrowych.
Dwa nast˛epne rozdziały niniejszego zbioru dotycz ˛a wykorzystania cytometrii przepływowej do wykonania próby krzy˙zowej oraz analizy wewn ˛atrzkomórkowej produkcji cytokin.
Kolejne trzy rozdziały, od dziesi ˛atego do dwunastego, po´swi˛econo analizie zwi ˛azków liczby episomalnych cz ˛asteczek DNA powstaj ˛acych podczas rearan-˙zacji receptorów antygenowych limfocytów T (ang. T cell receptor excision cyc-les, TREC) oraz specyficzno´sci prezentuj ˛acych antygen cz ˛asteczek HLA z choro-bami. Pomiar liczby TREC stanowi pomocne narz˛edzie diagnostyczne w ocenie
Słowo wst˛epne
zaburzonego procesu limfopoezy w wielu sytuacjach klinicznych, jak np. u pa-cjentów z wrodzonymi lub nabytymi niedoborami odporno´sci podczas terapii, pacjentów po alogenicznym przeszczepieniu komórek krwiotwórczych oraz pa-cjentów z chorobami autoimmunologicznymi. Z kolei typowanie HLA mo˙ze by´c
pomocne w prognozowaniu predyspozycji genetycznej do wyst ˛apienia pewnych
chorób, dynamiki post˛epu choroby, jak równie˙z w zdefiniowaniu klinicznych ty-pów choroby. W pracy asocjacje HLA z chorobami przedstawiono na przykładzie
zwi ˛azków z wybranymi chorobami o podło˙zu autoimmunizacyjnym, zapalnym
i infekcyjnym oraz chorobami rozrostowymi układu krwiotwórczego.
Z rozdziałem dwunastym ko ´nczy si˛e cz˛e´sci monografii podkre´slaj ˛aca rol˛e ty-powania tkankowego oraz istotne znaczenie metod słu˙z ˛acych do typowania HLA w klinice człowieka. W pi˛eciu kolejnych rozdziałach, od trzynastego do siedem-nastego, przedstawiono techniki biologii molekularnej wykorzystane w bada-niach zmian budowy materiału genetycznego - pocz ˛awszy od liczby i struktury chromosomów oraz długo´sci telomerów, a sko ´nczywszy na mutacjach wewn ˛ atrz-genowych i zmianach pojedynczych nukleotydach w sekwencji DNA. Techniki te znajduj ˛a szerokie zastosowanie w diagnostyce hematologicznej. Opisano bada-nia aberracji zwi ˛azanych z przemieszczaniem du˙zych fragmentów DNA i muta-cji wewn ˛atrzgenowych, prowadz ˛acych do transformacji nowotworowych. Dzi˛eki nim mo˙zna równie˙z analizowa´c zmienn ˛a długo´s´c telomerów i aktywno´s´c telo-merazy w kontek´scie obserwowanych mutacji i wpływu na rozwój chorób rozro-stowych. Wyniki tego typu bada ´n pozwalaj ˛a zrozumie´c mechanizmy
przedwcze-snego starzenia komórkowego, osi ˛agania stanu spoczynkowego komórki,
apop-tozy oraz procesu nowotworzenia. Metody biologii molekularnej wykorzysty-wane s ˛a równie˙z do monitorowania przebiegu potransplantacyjnego i post˛epów leczenia, w tym do oceny wła´sciwej odnowy hematologicznej i ´sledzenia cho-roby resztkowej (markery molekularne, poprzeszczepowy chimeryzm). Dostar-czaj ˛a te˙z narz˛edzi badawczych, ukierunkowanych na diagnostyk˛e potransplan-tacyjnych czynników prognostycznych.
Istotnym zagadnieniem poruszonym w opracowaniu jest diagnostyka labora-toryjna niepo˙z ˛adanych immunologicznych reakcji zwi ˛azanych z przetoczeniem krwi lub jej składników. Po´swi˛econo mu rozdział osiemnasty.
Ostatnie dwa rozdziały niniejszego zbioru podkre´slaj ˛a znaczenie udziału pra-cowni diagnostycznych i immunogenetycznych w warsztatach kontroli jako´sci stosowanych technik laboratoryjnych.
Przedstawione prace podkre´slaj ˛a udział pracowni diagnostycznych, typowa-nia tkankowego i laboratoriów immunogenetycznych w prawidłowym zdiagno-zowaniu, przygotowaniu pacjenta do transplantacji, doborze odpowiedniego dawcy, monitorowaniu post˛epów leczenia i przebiegu potransplantacyjnego. Wspólny wysiłek pracowników tych instytucji, jak równie˙z placówek klinicz-nych i o´srodków przeszczepowych, przyczynia si˛e do rozwoju transplantologii i diagnostyki oraz ma znacz ˛acy wpływ na wdra˙zanie innowacyjnych technolo-gii w tych dziedzinach. Wprowadzanie za´s nowego panelu diagnostycznego we wskazanych sytuacjach klinicznych pozwala rozszerzy´c badania o nowe czynniki rokownicze i lepiej zadba´c o dobro pacjenta.
Słowo wst˛epne Niniejszy zbiór opracowa ´n nie powstałby bez zaanga˙zowania i ˙zyczliwo´sci wszystkich Autorów. Dlatego chciałabym serdecznie za to podzi˛ekowa´c, ˙zycz ˛ac wszystkim Autorom dalszych sukcesów i satysfakcji z wykonywanej pracy.
dr hab. Katarzyna Bogunia-Kubik, prof. nadzw. Wrocław, listopad 2012
R O Z D Z I A Ł
1
W
YKORZYSTANIE GENOTYPOWANIA
HLA
W PROCEDURACH DOBORU DAWCÓW
KRWIOTWÓRCZYCH KOMÓREK
MACIERZYSTYCH
Jacek NowakZakład Immunogenetyki Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa
Streszczenie
Niezgodno´s´c aminokwasów w cz ˛asteczkach HLA pomi˛edzy dawc ˛a i biorc ˛a przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (KKM) sprzyja wyst˛epowaniu gro´znych powikła ´n immunologicznych i infekcyjnych oraz pogarsza prze˙zycie bior-ców. W pracy przestawiono zasady zastosowania odpowiednich metod badania HLA w procesie doboru dawcy KKM. Podczas wst˛epnych i potwierdzaj ˛acych bada ´n chorych posiadaj ˛acych wskazania do transplantacji KKM i członków ich rodzin oraz wst˛epnych bada ´n rekrutowanych niespokrewnionych dawców wymagane s ˛a przy-najmniej badania HLA-A, B i DRB1 o niskiej rozdzielczo´sci. Podczas selekcji niespo-krewnionych dawców KKM zachodzi cz˛esto konieczno´s´c wykonania bada ´n dodat-kowych loci lub bada ´n A, B, DRB1 o wysokiej rozdzielczo´sci, co jest czasochłonne. W procesie doboru preferowani s ˛a zatem niespokrewnieni dawcy o poziomie wyty-powania wy˙zszym od wymaga ´n minimalnych. Ostateczne genotypowanie potwier-dzaj ˛ace pary dawca-biorca musi by´c wykonane na odpowiednio wysokim poziomie rozdzielczo´sci, pozwalaj ˛acym na wykluczenie lub identyfikacj˛e niezgodno´sci alle-licznych w zakresie HLA-A, B, C, DRB1 i DQB1. Pomimo stosowania nowoczesnych technik biologii molekularnej otrzymanie niejednoznacznych wyników bada ´n HLA jest cz˛esto nie do unikni˛ecia. W pracy przedstawiono równie˙z przesłanki interpreta-cji oraz zasady walidainterpreta-cji niejednoznacznych wyników genotypowania HLA w aspek-cie wyniku transplantacji. Racjonalne zastosowanie dost˛epnych metod genotypo-wania HLA o odpowiedniej rozdzielczo´sci oraz prawidłowa interpretacja wyników s ˛a warunkiem doboru optymalnego dawcy KKM oraz zmniejszenia cz˛esto´sci wyst˛e-powania gro´znych powikła ´n immunologicznych i infekcyjnych.
Słowa kluczowe: genotypowanie HLA, rozdzielczo´s´c metod badania HLA,
niejedno-znaczne wyniki bada ´n HLA, immunogenetyczny dobór dawcy szpiku, alogeniczna transplantacja krwiotwórczych komórek macierzystych
1. Wykorzystanie genotypowania HLA w procedurach doboru ...
1.1. Wst˛ep
Immunogenetyczna zgodno´s´c dawcy z biorc ˛a przeszczepu krwiotwórczych
komórek macierzystych (KKM) jest warunkowana sekwencj ˛a aminokwasów
w cz ˛asteczkach HLA maj ˛ac ˛a swe odzwierciedlenie w genotypach dawcy i biorcy, badanych na poziomie DNA. Niezgodno´s´c HLA lub sekwencji aminokwasów w obr˛ebie peptydów prezentowanych w kontek´scie cz ˛asteczek HLA sprzyja wy-st˛epowaniu gro´znych powikła ´n immunologicznych i infekcyjnych po
transplan-tacji KKM i pogarsza prze˙zycie biorców. Zastosowanie nowoczesnych
tech-nik biologii molekularnej do typowania HLA biorców i dawców wpłyn˛eło na
znaczn ˛a popraw˛e wyników alogenicznych transplantacji KKM [1]. Nadal
jed-nak nie zawsze mo˙zliwe jest uzyskanie jednoznacznych wyników genotypowa-nia w zwi ˛azku z wysokim stopniem zło˙zono´sci układu HLA. Przyczynia si˛e do tego zarówno niezwykła poligeniczno´s´c, jak i wysoki stopie ´n polimorfizmu wielu genetycznych loci HLA [2]. Obserwowana jednocze´snie wysoka homologia se-kwencji wielu alleli [3] i współdominuj ˛ace kodowanie genów HLA w układzie
di-ploidalnym sprzyjaj ˛a otrzymywaniu niejednoznacznych wyników
genotypowa-nia i utrudgenotypowa-niaj ˛a wiarygodne dobranie w pełni zgodnego dawcy KKM. W pracy
przedstawiono zasady prawidłowego zastosowania odpowiednio dobranych me-tod bada ´n HLA i interpretacji otrzymanych wyników w procesie doboru aloge-nicznego dawcy KKM.
1.2. Metody typowania HLA i prezentacji wyników
W doborze pary dawca-biorca KKM stosowane s ˛a ró˙zne metody typowania
HLA oparte najcz˛e´sciej na badaniu DNA [4]. Metoda hybrydyzacji ze swoistymi sondami oligonukleotydowymi (ang. sequence-specific oligonucleotide probe-hybridization, SSOP) polega na amplifikacji jednego lub kilku długich
fragmen-tów genu HLA odpowiadaj ˛acych eksonom i sondowaniu ich poprzez odwrotn ˛a
hybrydyzacj˛e z szeregiem krótkich sond genetycznych o znanych sekwencjach [5]. Sondy oligonukleotydowe opłaszczone s ˛a na mikrokulkach polistyrenowych (Luminex), mikromacierzach (Histo SPOT, BAG Health Care) lub paskach nitroce-lulozowych (Innogenetics). Rozdzielczo´s´c metod zale˙zy od liczby rozró˙znialnych no´sników (mikrokulek, spotów lub pr ˛a˙zków) w te´scie oraz od ró˙znorodno´sci sond oligonukleotydowych immobilizowanych na rozró˙znialnych no´snikach. Metod ˛a SSOP bada si˛e odr˛ebnie ka˙zde locus i najcz˛e´sciej mo˙zna w ten sposób osi ˛agn ˛a´c nisk ˛a rozdzielczo´s´c badania HLA ograniczon ˛a do „rodziny alleli’‘. Czynione s ˛a wysiłki nad podwy˙zszeniem rozdzielczo´sci testów poprzez zwi˛ekszenie pojemno-´sci no´sników sond, lub zastosowanie haplotypowo swoistych sond (tzw. specialty probes) mog ˛acych rozstrzygn ˛a´c niektóre niejednoznaczno´sci cis/trans.
Metoda amplifikacji ze swoistymi primerami (ang. sequence-specific primers, SSP) obejmuje wykonanie wielu amplifikacji krótkich fragmentów genu HLA przy u˙zyciu szeregu par primerów o znanych sekwencjach [6]. Amplifikacja przewadzana jest w wielu oddzielnych mieszaninach reakcyjnych, a wykrywanie pro-duktów amplifikacji zachodzi w elektroforezie na ˙zelu agarozowym. Zestaw pri-merów w testach SSP obejmuje kilkana´scie lub wi˛ecej fragmentów jednego
lo-1.3. Rozdzielczo´s´c metod genotypowania HLA cus HLA, co pozwala na okre´slenie alleli na poziomie niskiej rozdzielczo´sci. Me-toda SSP mo˙ze by´c wzbogacona o drugi, dokładniejszy stopie ´n. Wykorzystuje si˛e wówczas kilkana´scie lub kilkadziesi ˛at par primerów skierowanych do fragmen-tów jednej rodziny alleli, co mo˙ze znacznie zaw˛ezi´c wynik do jednego lub kilku alleli tej samej rodziny. Mówimy wówczas o wyniku na poziomie, odpowied-nio, wysokiej lub po´sredniej rozdzielczo´sci. Rzadziej obecnie stosowan ˛a metod ˛a jest elektroforetyczna analiza konformacji po hybrydyzacji z referencyjn ˛a nici ˛a DNA (ang. reference strand-mediated conformation analysis, RSCA) [7]. Pomiar opiera si˛e na ró˙znicy ruchliwo´sci fragmentów DNA w elektroforezie kapilarnej na ˙zelu poliakrylamidowym. Wad ˛a tej metody jest zale˙zno´s´c wyniku od szybko-´sci migracji w elektroforezie, która mo˙ze by´c podobna dla ró˙zni ˛acych si˛e alleli, a dla nowych sekwencji nie jest znana. Zalet ˛a jest separacja haplotypów i nie wyst˛epowanie niejednoznaczno´sci heterozygotycznych cis/trans. Sekwencjono-wanie (ang. sequencing-based typing, SBT) jest metod ˛a definitywn ˛a dla znacz-nie dłu˙zszych fragmentów badanych genów ni˙z wymienione wcze´sznacz-niej metody. Polega ono na wst˛epnej amplifikacji jednego lub kilku kompletnych eksonów z zastosowaniem znakowanych fluorescencyjnie trifosforanów dideoksynukle-otydów terminalnych dodanych do mieszaniny amplifikacyjnej w okre´slonych proporcjach w stosunku do nie znakowanych trifosforanów „zwykłych’‘ nukle-otydów. Okre´slenie sekwencji nukleotydów amplifikowanych fragmentów od-bywa si˛e na drodze rozwini˛ecia elektroforetycznego w kapilarach wypełnionych poliakrylamidem o liniowej cz ˛asteczce (LPA) lub specjalnym polimerem rozdziel-czym (ang. performance optimized polymer 6, POP6) i laserowej analizie fluore-scencji kolejnych nukleotydów przy u˙zyciu sekwenatora DNA. Powy˙zsza wersja SBT opiera si˛e na klasycznej metodzie sekwencjonowania wg. Sangera [8]. Now-sze wersje SBT, tzw. new generation sequencing (NGS) obejmuj ˛a przygotowanie bibliotek DNA poprzez frakcjonowanie DNA próbki na małe fragmenty (najcz˛e-´sciej, poni˙zej 1000 bp) o t˛epych ko ´ncach, ł ˛aczenie z sekwencjami adaptorowymi (biotynylowanymi primerami), immobilizacj˛e w obr˛ebie mikroreaktorowych be-adsów i klonaln ˛a amplifikacj˛e jednoniciowych fragmentów DNA [9]. Ostatnim etapem jest sekwencjonowanie przez syntez˛e, czyli pyrosekwencjonowanie [10].
Obydwie metody sekwencjonowania HLA wymagaj ˛a zastosowania precyzyjnych
procedur walidacji uzyskanych sekwencji oraz porównawczej analizy bibliotek znanych alleli HLA przy u˙zyciu zaawansowanego oprogramowania. Dzi˛eki za-awansowaniu technicznemu metody SBT pozwalaj ˛a znacznie cz˛e´sciej ni˙z SSOP czy SSP uzyska´c wynik genotypowania HLA na poziomie podwy˙zszonej lub wy-sokiej rozdzielczo´sci.
1.3. Rozdzielczo´s´c metod genotypowania HLA
Genotypowanie HLA mo˙ze dostarczy´c informacji na poziomie niskiej, po´sred-niej, podwy˙zszonej lub wysokiej rozdzielczo´sci, w zale˙zno´sci od zastosowanych testów. Za badanie o niskiej rozdzielczo´sci jest uznawane okre´slenie grupy alleli o zbli˙zonej sekwencji, przedstawiane w zapisie w postaci nazwy locus, gwiazdki (´swiadcz ˛acej o genetycznym sposobie typowania) i ci ˛agu dwóch cyfr okre´slaj ˛ a-11
1. Wykorzystanie genotypowania HLA w procedurach doboru ...
cych swoisto´s´c rodziny podobnych alleli (np. A*01 lub DRB1*15). Badanie o wy-sokiej rozdzielczo´sci dostarcza jednoznacznej informacji przynajmniej o tej cz˛e-´sci allelu HLA, która koduje sekwencj˛e aminokwasów w cz ˛asteczce HLA i odpo-wiada za efekt biologiczny (jednoznaczna identyfikacja antygenu HLA). Zapis wy-niku genotypowania o wysokiej rozdzielczo´sci obejmuje nazw˛e locus, gwiazdk˛e i przynajmniej dwa ci ˛agi po 2 lub 3 cyfry, oddzielone dwukropkiem, oznaczaj ˛ace odpowiednio, rodzin˛e alleli i kolejny numer sekwencji eksonowej, np. A*02:115 lub DRB1*13:02. Jednoznaczny zapis allelu mo˙ze by´c dłu˙zszy. Kolejny ci ˛ag
cyfr, wyst˛epuj ˛acy po drugim dwukropku w zapisie wyniku genotypowania HLA
(np. A*24:02:01 i A*24:02:02) dotyczy tzw. substytucji synonimowych (inny triplet nukleotydów koduje ten sam aminokwas), a kolejny czwarty ci ˛ag cyfr po trzecim dwukropku dotyczy polimorfizmu nukleotydów w intronach, tj. poza obszarem kodowania białka (np. A*01:01:01:01 i A*01:01:01:02). Niejednoznaczny wynik ge-notypowania HLA mo˙ze obejmowa´c kilka (czasami wiele) alleli nale˙z ˛acych do tej samej rodziny o niskiej rozdzielczo´sci, np. DRB1*04:01/03/04/08 oznacza alterna-tywn ˛a obecno´s´c jednego z 4 alleli DRB1, tj. DRB1*04:01, DRB1*04:03, DRB1*04:04 lub DRB1*04:08. Brak jednoznaczno´sci wyniku na tym poziomie jest okre´slany mianem wyniku o po´sredniej rozdzielczo´sci. Zapis wyniku o po´sredniej rozdziel-czo´sci mo˙ze ulec skróceniu dzi˛eki zastosowaniu tzw. kodów NMDP, czyli dwu, trzy lub czteroliterowych skrótów, których ewidencj˛e prowadzi National Marrow Donor Program na ogólnodost˛epnej stronie internetowej [11]. Przykładowo, za-pis DRB1*04:01/03/04/08 mo˙zna skróci´c u˙zywaj ˛ac kodu DRB1*04:EX. Okre´slenie „wynik genotypowania HLA o podwy˙zszonej rozdzielczo´sci’‘ oznacza istotne za-w˛e˙zenie wyniku o niskiej lub po´sredniej rozdzielczo´sci do niewielkiej grupy alleli, w´sród których znajduje si˛e tylko jeden allel CWD (poj˛ecie CWD wyja´sniono po-ni˙zej) lub allel typowy dla populacji, z której wywodzi si˛e badana osoba. Jako przykład podwy˙zszenia rozdzielczo´sci mo˙zna poda´c sytuacj˛e, w której w bada-niu wst˛epnym wykryto B*27:02/05/16/28 (B*27:BBV ). Jest to wynik o po´sredniej rozdzielczo´sci, gdy˙z obejmuje dwa allele – B*27:02 i B*27:05, nale˙z ˛ace do CWD i cz˛este równie˙z w populacji polskiej. Po wykonaniu ´sci´slejszego badania otrzy-mano wynik B*27:02/16/28 (B*27:AXW ) o podwy˙zszonej rozdzielczo´sci, gdy˙z al-lele B*27:16 i B*27:28 nie nale˙z ˛a do CWD i nie wyst˛epuj ˛a w polskiej populacji. Jedynym prawdopodobnym allelem pozostał w tej sytuacji B*27:02, co zbli˙za taki wynik pod wzgl˛edem informatywno´sci do wyniku o wysokiej rozdzielczo´sci.
Niejednoznaczne wyniki stanowi ˛a istotny problem diagnostyczny w zwi ˛azku m.in. z nieokre´slonym znaczeniem praktycznym dodatkowych alleli niewyklu-czonych w badaniu o po´sredniej rozdzielczo´sci. Próbuj ˛ac rozwi ˛aza´c niedogod-no´sci zwi ˛azane z wykonywaniem wielu dodatkowych typowa ´n wymaganych nie-kiedy przez transplantologów pragn ˛acych oprze´c si˛e na jednoznacznych wyni-kach, przeprowadzono szerokie badania allelicznego poziomu HLA metodami definitywnymi i okre´slono zakres niejednoznaczno´sci, które zawsze były roz-strzygane w postaci genotypu zawieraj ˛acego najcz˛estsze allele. W badaniu Cano i wsp. [12] przeprowadzonym na reprezentatywnej dla populacji ogólno´swiato-wej grupie ponad 25 000 osób zdefiniowano tzw. powszechne i dobrze udoku-mentowane allele HLA (ang. common and well-documented, CWD). Lista alleli
1.4. Ró˙zne fazy doboru dawcy KKM ... nale˙z ˛acych do CWD obejmuje w zale˙zno´sci od locus od 26% do 33% wszystkich odkrytych dot ˛ad alleli HLA. Sposób interpretacji niejednoznacznych wyników bada ´n HLA zaakceptowany przez Ameryka ´nskie Towarzystwo Zgodno´sci Tkan-kowej i Immunogenetyki (ang. American Society of Histocompatibility and Im-munogenetics, ASHI) pozwala na zdefiniowanie genotypów HLA (genotyp obej-muje dwa odr˛ebnie kodowane allele w locus) na poziomie wysokiej rozdzielczo-´sci. Zgodnie z definicj ˛a ASHI genotyp o wysokiej rozdzielczo´sci mo˙ze zawiera´c szereg alternatywnych genotypów pod warunkiem, ˙ze tylko jeden z nich zawiera jeden (u homozygot) lub dwa (u heterozygot) allele CWD, a wszystkie pozostałe alternatywne genotypy zawieraj ˛a allele rzadkie, nie nale˙z ˛ace do CWD [12]. Oce-niono, ˙ze genotyp obejmuj ˛acy dwa allele CWD jest ok. 10 000 razy bardziej praw-dopodobny ni˙z ka˙zdy z alternatywnych genotypów zawieraj ˛acych dwa rzadkie allele. Je´sli alternatywne genotypy zawieraj ˛a ró˙zne allele CWD to wynik nie jest uznawany za badanie o wysokiej rozdzielczo´sci, a niejednoznaczno´sci te musz ˛a by´c w razie potrzeby rozstrzygni˛ete w bezpo´srednim genotypowaniu.
Dodatkowo, zgodnie z definicj ˛a ASHI, a tak˙ze Europejskiej Federacji Immuno-genetyki (EFI) wynik o wysokiej rozdzielczo´sci mo˙ze zawiera´c kilka alternatyw-nych alleli pod warunkiem, ˙ze substytucje nukleotydów wyst˛epuj ˛ace wewn ˛atrz eksonów zlokalizowane s ˛a poza istotnym z punktu widzenia efektu biologicznego obszarem rozpoznania antygenowego (ang. antigen recognition site, ARS), tj. poza eksonami 2 i 3 alleli klasy I i eksonem 2 alleli klasy II. Wydaje si˛e, ˙ze ł ˛aczne kryte-rium „obu alleli nale˙z ˛acych do CWD plus mo˙zliwo´s´c substytucji poza obszarem ARS’‘ stanowi racjonaln ˛a podstaw˛e decyzji klinicznych odno´snie zgodno´sci tkan-kowej pomi˛edzy dawc ˛a i biorc ˛a KKM. Istotn ˛a korzy´sci ˛a wynikaj ˛ac ˛a z przyj˛ecia powy˙zszej definicji wyniku genotypowania o wysokiej rozdzielczo´sci mo˙ze by´c przy´spieszenie doboru pary dawca-biorca, co ma istotne znaczenie kliniczne [13] w zwi ˛azku z zapotrzebowaniem na szybkie dobory dawców HSC dla zwi˛ekszaj ˛ a-cego si˛e odsetka biorców, u których wykryto ostr ˛a białaczk˛e [14]. Ostateczny wy-nik typowania HLA powinien obejmowa´c jedn ˛a par˛e alleli CWD oraz zawiera´c in-formacj˛e, ˙ze kompletna lista wszystkich alternatywnych genotypów, których nie wykluczono w bezpo´srednim genotypowaniu znajduje si˛e w laboratorium i zo-stanie udost˛epniona na pro´sb˛e lekarza.
Obecnie wszystkie cztery poziomy rozdzielczo´sci wyników bada ´n HLA jak
równie˙z interpretacja CWD/ARS znajduj ˛a zastosowanie w praktyce na ró˙znych etapach rekrutacji i doboru dawców KKM do transplantacji.
1.4. Ró˙zne fazy doboru dawcy KKM wymagaj ˛
a
odpowiedniego zakresu i rozdzielczo´sci
genotypowania HLA
Dobór dawcy alogenicznego przeszczepu KKM jest procesem wieloetapowym (Rycina 1.1). Procedura doboru rozpoczyna si˛e od ustalenia wskaza ´n do
alotran-splantacji KKM, poł ˛aczonego z wst˛epnym badaniem HLA pacjenta i członków
jego najbli˙zszej rodziny, tj. rodze ´nstwa i rodziców. Minimalny zakres wst˛epnego 13
1. Wykorzystanie genotypowania HLA w procedurach doboru ...
Dobór rodzinny Pacjent
WT: A, B, DRB1/SSOP n.r. (LTC HLA klasy I)
Haploidentyczny Szeroka rodzina CT: A, B, C, DRB1, DQB1/SSOP n.r. lub p.r. Zgodny rodzinny dawca CT: A, B, C, DRB1/SSOP n.r. Brak zgodnego rodzinnego dawcy WT: A, B, DRB1/SSOP n.r.
Dobór niespokrewnionego dawcy KKM
Brak zgodnego niespokrewnionego dawcy CT: A, B, C, DRB1, DQB1/SSOP p.r./SSP p.r./SBT w.r. Zgodny niespokrewniony dawca CT: A, B, C, DRB1, DQB1/SSOP p.r./SSP p.r./SBT w.r. Alogeniczna transplantacja KKM
Specjalistyczny dobór dawcy KKM
Brak zgodnego niespokrewnionego dawcy Zgodny niespokrewniony dawca CT: A, B, C, DRB1, DQB1/SSOP p.r./SSP p.r./SBT w.r. 10/10, 9/10 Niespokrewniony dawca CT: A, B, C, DRB1, DQB1/SSOP p.r./SSP p.r./SBT w.r. 8/10, 7/10 CT: A, B, C, DRB1, DQB1/SSOP p.r./SSP p.r./SBT w.r. CBU, 2CBU 6/6, 5/6, 4/6 (WT: A, B, DRB1/SSOP n.r.) Leczenie alternatywne
Rycina 1.1: Algorytm doboru dawcy alogenicznego przeszczepu krwiotwórczych komó-rek macierzystych z uwzgl˛ednieniem wykorzystania metod genotypowania HLA. WT, wst˛epne typowanie; CT, typowanie potwierdzaj ˛ace; SBT, metoda oparta na sekwencjo-nowaniu genów; SSOP, metoda swoistych sond oligonukleotydowych; SSP, metoda swo-istych primerów; LCT, serologiczna metoda typowania HLA klasy I, tj. test limfocyto-toksyczny; KKM, przeszczep zawieraj ˛acy krwiotwórcze komórki macierzyste; CBU, jed-nostka krwi p˛epowinowej (ang. cord blood unit); n.r., niska rozdzielczo´s´c; p.r., po´srednia-/podwy˙zszona rozdzielczo´s´c; w.r., wysoka rozdzielczo´s´c.
badania rodzinnego obejmuje loci HLA-A, B i DRB1 o niskiej rozdzielczo´sci i naj-cz˛e´sciej bywa wykonywany przy u˙zyciu generycznych testów HLA wykorzystuj ˛ a-cych metod˛e PCR-SSP lub PCR-SSOP o niskiej lub po´sredniej rozdzielczo´sci.
Na tym etapie, słu˙z ˛acym do wykazania istnienia lub braku zgodnego dawcy rodzinnego, oprócz wyników genetycznego typowania HLA-A, B i DRB1 mo˙z-liwe jest alternatywne wykorzystanie wyników serologicznych bada ´n HLA klasy I. Ze wzgl˛edu na ograniczon ˛a wiarygodno´s´c bada ´n serologicznych [15] wymaga to jednak zastosowania jednoznacznych elementów kontroli. Przede
wszyst-kim, oprócz chorego i rodze ´nstwa badanie powinno obejmowa´c równie˙z
ro-dziców. Ponadto, rodzina powinna by´c odpowiednio liczna, aby mo˙zliwe było okre´slenie segregacji haplotypów. Wyniki serologicznych bada ´n HLA klasy I, zwłaszcza interpretowane bez nale˙zytej ostro˙zno´sci, obejmuj ˛ace jedynie chorego i jego rodze ´nstwo mog ˛a w niektórych przypadkach spowodowa´c omyłkow ˛a
dys-1.4. Ró˙zne fazy doboru dawcy KKM ... kwalifikacj˛e zgodnego dawcy albo kwalifikacj˛e dawcy niezgodnego. Dodatko-wym zabezpieczeniem przed skutkami podobnych bł˛edów oraz mo˙zliwych po-myłek administracyjnych powinno by´c wykonanie genotypowania potwierdza-j ˛acego (ang. confirmatory typing, CT) wyselekcjonowanej, potencjalnie zgodnej
pary rodzinny dawca – biorca, obejmuj ˛acego nowe próbki krwi obu osób.
Mi-nimalnym zakresem rodzinnego genotypowania potwierdzaj ˛acego w przypadku
całkowitej zgodno´sci s ˛a loci HLA-A, B, C i DRB1 na poziomie niskiej rozdzielczo-´sci. Mówimy wówczas o zgodno´sci 8 alleli spo´sród 8 badanych, czyli o zgodno-´sci 8/8. W niektórych krajach zalecane jest równie˙z badanie locus DQB1 w celu potwierdzenia zgodno´sci haplotypów HLA. Wymagania odno´snie zakresu bada ´n HLA pary dawca - biorca s ˛a rozszerzone w przypadku kwalifikacji cz˛e´sciowo
nie-zgodnego dawcy rodzinnego w zwi ˛azku z ró˙znicami haplotypowymi na
pozio-mie alleli. Cz˛e´sciowo niezgodny dawca rodzinny jest zwykle identyczny z chorym w zakresie jednego haplotypu HLA oraz zgodny na zasadzie przypadku w zakresie niektórych loci drugiego haplotypu. Aby potwierdzi´c spodziewany stopie ´n zgod-no´sci nale˙zy dokona´c precyzyjnej analizy haplotypów w rodzinie i w razie w ˛ at-pliwo´sci wykona´c badanie o wysokiej rozdzielczo´sci w zakresie wybranych loci HLA, tj. A, B, C, DRB1 i/lub DQB1. Rozszerzone badanie potwierdzaj ˛ace wykony-wane w przypadku nie pełnej zgodno´sci dawcy rodzinnego ma na celu uzyskanie kompletnej informacji o liczbie i swoisto´sci alleli niezgodnych w badanym zakre-sie. Brak zgodnego dawcy rodzinnego i wykrycie nie akceptowalnych niezgod-no´sci u haplotypowo identycznego dawcy rodzinnego stanowi wskazanie do po-szukiwania niespokrewnionego dawcy przeszczepu KKM, o ile istnieje medyczne wskazanie do transplantacji od dawcy alternatywnego [16].
Immunogenetyczny dobór niespokrewnionego (lub alternatywnego) dawcy ma na celu znalezienie w rejestrach wolontariusza o odpowiednim stanie zdro-wia i pełnej zgodno´sci immunogenetycznej w zakresie pi˛eciu najwa˙zniejszych loci HLA, tj. A, B, C, DRB1 i DQB1 na poziomie alleli [17]. Wst˛epne dane za-warte w rejestrach s ˛a najcz˛e´sciej ograniczone do trzech (A, B i DRB1) lub nawet dwóch (A i B) loci HLA i do poziomu niskiej rozdzielczo´sci. Dane te w wi˛ekszo-´sci przypadków nie s ˛a wystarczaj ˛ace do wskazania dawcy, który w wyniku bada ´n potwierdzaj ˛acych okazałby si˛e zgodny na poziomie alleli wszystkich 5 wymaga-nych loci. Konieczno´s´c wykonania bada ´n dodatkowych loci (C lub DQB1 o niskiej rozdzielczo´sci), lub bada ´n loci DRB1, B lub A o podwy˙zszonej rozdzielczo´sci nie zachodzi w przypadku dawców, którzy podczas rekrutacji mieli wykonane rozsze-rzone badania HLA. Dawcy tacy s ˛a preferowani przez o´srodki wykonuj ˛ace dobór, zwłaszcza w przypadku chorych zagro˙zonych szybk ˛a progresj ˛a lub krótk ˛a remi-sj ˛a choroby, lub gdy dobór jest pilny z innych przyczyn medycznych. Z punktu widzenia chorego bardzo korzystne jest rozszerzenie wst˛epnego typowania daw-ców do rejestru o locus C na poziomie niskiej rozdzielczo´sci oraz najbardziej po-limorficznego locus jakim jest HLA-B do podwy˙zszonej/wysokiej rozdzielczo´sci. Z tych samych powodów pełna informacja na temat wszystkich niejednoznacz-nych alleli uzyskaniejednoznacz-nych w badaniu o po´sredniej rozdzielczo´sci, np. zapisana w po-staci kodów NMDP mo˙ze si˛e okaza´c wystarczaj ˛aco informatywna, aby rozstrzy-gn ˛a´c czy dawca jest potencjalnie zgodny z chorym w zakresie w ˛atpliwego locus.
1. Wykorzystanie genotypowania HLA w procedurach doboru ...
Dlatego absolutnie konieczne jest rutynowe przekazywanie przez o´srodki daw-ców szpiku uzupełnionych genotypów rekrutowanych do rejestru dawdaw-ców, za-wieraj ˛acych kody NMDP, je´sli informacja o mo˙zliwych alternatywnych allelach wynika z przeprowadzonych wst˛epnych bada ´n HLA. Mo˙ze si˛e to przyczyni´c do skrócenia czasu trwania doboru zgodnego dawcy KKM. W przypadku zgodno´sci 10/10 wyniki genotypowania potwierdzaj ˛acego na poziomie wysokiej rozdziel-czo´sci dawcy i chorego raportowane s ˛a do o´srodka transplantacji szpiku z propo-zycj ˛a akceptacji dawcy.
Dobranie całkowicie zgodnego niespokrewnionego dawcy cz˛esto wymaga wy-konania precyzyjnie zaplanowanych typowa ´n uzupełniaj ˛acych u jednego, kilku,
a czasem u wielu wyselekcjonowanych potencjalnych dawców i mog ˛a
obejmo-wa´c jedno lub kilka loci HLA, co jest czasochłonne i kosztowne. Badania rozsze-rzaj ˛ace maj ˛a na celu wyja´snienie polimorfizmu dawców lub poszukiwanie u daw-ców charakterystycznych dla chorego rzadkich sprz˛e˙ze ´n haplotypowych pomi˛e-dzy loci B-C, DRB1-DQB1 i innymi. Zjawisko silnej nierównowagi sprz˛e˙ze ´n po-mi˛edzy wszystkimi loci HLA sprawia, ˙ze etap rozszerzaj ˛acego typowania wybra-nych loci HLA mo˙ze by´c kluczowy dla znalezienia w pełni zgodnego dawcy. Mog ˛a tutaj by´c stosowane metody o niskiej, po´sredniej lub wysokiej rozdzielczo´sci, za-le˙znie od rodzaju polimorfizmu obserwowanego u potencjalnych dawców. Bada-nia rozszerzaj ˛ace powinny by´c tak zaplanowane, aby wyłoni´c przynajmniej jed-nego dawc˛e, który w genotypowaniu potwierdzaj ˛acym oka˙ze si˛e zgodny z chorym w zakresie 10/10 [18].
Innym wynikiem pierwszej fazy doboru niespokrewnionego dawcy mo˙ze by´c wykazanie braku pełnej zgodno´sci wyselekcjonowanego dawcy. Przeprowadzana jest wówczas powtórna analiza dost˛epnych danych HLA potencjalnych dawców obejmuj ˛aca globaln ˛a baz˛e BMDW i szczegółowe raporty rejestrów krajowych ce-lem okre´slenia szansy dobrania dawcy 10/10. W przypadku braku potencjału, okre´slana jest szansa dobrania akceptowalnego cz˛e´sciowo niezgodnego niespo-krewnionego [17] lub rodzinnego dawcy albo jednostek krwi p˛epowinowej, zgod-nych w zakresie 6, 5 lub 4 spo´sród 6 swoisto´sci HLA-A, B i DRB1. Próba dobra-nia ka˙zdego kolejnego akceptowalnego dawcy jest coraz mniej skuteczna i coraz bardziej czasochłonna. Czas upływaj ˛acy pomi˛edzy rozpoznaniem choroby, a wy-konaniem transplantacji powinien by´c mo˙zliwie krótki w zwi ˛azku ze znacznie pogarszaj ˛acymi si˛e wynikami w przypadku wykonania transplantacji w nie opty-malnej lub zaawansowanej fazie choroby [19]. Przedłu˙zaj ˛acy si˛e czas trwania do-boru po niepowodzeniu pierwszej jego fazy wynika z konieczno´sci badania naj-cz˛e´sciej wielu dawców, u których nie znane, a po zbadaniu najnaj-cz˛e´sciej niezgodne z chorym s ˛a niektóre swoisto´sci HLA o wysokiej rozdzielczo´sci. Mo˙ze to ozna-cza´c, ˙ze pacjent posiada unikalne sprz˛e˙zenia swoisto´sci genetycznych niektó-rych loci lub unikalny genotyp HLA na poziomie alleli. Racjonalnym post˛epowa-niem jest wówczas zbadanie w zakresie w ˛atpliwych loci reprezentatywnej próby, np. 10-25 spo´sród 100 lub wi˛ecej potencjalnych, słabo wytypowanych dawców raportowanych w BMDW oraz wzmocnienie informatywno´sci badania poprzez okre´slenie proporcji dawców niezgodnych do niezbadanych w zakresie alleli w ˛ at-pliwego locus. Badanie reprezentatywnej próby potencjalnych dawców w trybie
1.4. Ró˙zne fazy doboru dawcy KKM ... typowania uzupełniaj ˛acego powinno by´c wykonane mo˙zliwie sprawnie, tj. w ca-łej grupie jednocze´snie, a w przypadku pacjentów pilnych sprowadzenie próbki i wykonanie ostatecznego typowania potwierdzaj ˛acego o wysokiej rozdzielczo-´sci powinno dotyczy´c dwóch lub wi˛ecej wyselekcjonowanych dawców jednocze-´snie [20]. Liczne przykłady potwierdzaj ˛a mo˙zliwo´s´c selekcji dawcy 10/10 lub 9/10 w reprezentatywnej grupie oraz brak skuteczno´sci uporczywego badania dodat-kowych dawców powy˙zej reprezentatywnej próby w przypadkach unikalnego ge-notypu HLA chorego [21].
W przypadkach braku potencjalnych dawców wytypowanych w zakresie HLA-A, B i DRB1 istnieje bardzo mała szansa na zgodno´s´c dawcy wytypowanego tylko w zakresie genów klasy I, tj. A i B. Obecnie rejestry raportuj ˛ace do BMDW obej-muj ˛a ok. 3 mln. tak zwanych dawców A,B. Szansa na pełn ˛a zgodno´s´c 10/10 które-go´s z dawców A,B wzrasta około o´smiokrotnie (p=0.006), gdy zgodne s ˛a równie˙z antygeny HLA-C [22]. Jest to dodatkowym uzasadnieniem dla wykonywania ge-notypowania HLA-C przynajmniej o niskiej rozdzielczo´sci, ju˙z na wst˛epnym eta-pie rekrutacji dawców.
W przypadku wykazania unikalnego genotypu HLA chorego i wyczerpania mo˙zliwo´sci doboru dawcy o stopniu zgodno´sci 10/10 i 9/10 mo˙zliwe bywa wyko-rzystanie wielkiego populacyjnego potencjału BMDW i próba przeprowadzenia haplotypowego doboru dawcy o stopniu zgodno´sci 9/10 [23]. Podstaw ˛a haploty-powego doboru jest obserwacja, ˙ze pojedyncza niezgodno´s´c swoisto´sci jednego z dystalnych loci haplotypu HLA (tj. A lub DQB1) jest w populacji europejskiej mniej szkodliwa ni˙z niezgodno´s´c swoisto´sci centralnych loci haplotypu HLA [19]. Sposób haplotypowego doboru dawcy na przykładzie chorej z ostr ˛a białaczk ˛a limfoblastyczn ˛a przedstawiono wcze´sniej [24].
Dobór haplotypowy jest ułatwiony po zastosowaniu populacyjnej analizy ha-plotypowej pod k ˛atem haplotypów chorego, przy u˙zyciu oprogramowania PHASE KEY v. 1.0, opracowanego w Zakładzie Immunogenetyki Instytutu Hematologii i Transfuzjologii (oprogramowanie wraz z instrukcj ˛a obsługi dost˛epne u autora). Ostatecznym wynikiem uzupełniaj ˛acych bada ´n HLA wraz z analiz ˛a haplotypow ˛a jest cz˛esto wykazanie niezgodno´sci jednego antygenu w locus A lub DQB1 i po-twierdzenie zgodno´sci wszystkich pozostałych alleli. Wynik taki wskazuje na zgodno´s´c jednego haplotypu w cało´sci, jak równie˙z całej pozostałej cz˛e´sci haplo-typu niezgodnego w locus A lub DQB1. Oznacza to mo˙zliwo´s´c dobrania dawcy o stopniu zgodno´sci 9/10 pochodz ˛acego z puli dawców cz˛e´sciowo niezgodnych, nie za´s spo´sród dawców potencjalnie w pełni zgodnych.
Innym sposobem pokonywania trudno´sci zwi ˛azanych z brakiem zarówno
optymalnego rodzinnego, jak i niespokrewnionego dawcy komórek krwiotwór-czych jest transplantacja jednej lub dwóch jednostek krwi p˛epowinowej (Ry-cina 1.1). Transplantacja krwi p˛epowinowej ł ˛aczy si˛e przewa˙znie z niezgodno´sci ˛a jednej lub dwóch spo´sród 6 cz ˛asteczek HLA-A, B, DRB1 (zgodno´s´c 5/6 lub 4/6), lecz niezgodno´sci te s ˛a stosunkowo dobrze tolerowane z powodu niedojrzało´sci i wi˛ekszej plastyczno´sci immunologicznej w porównaniu z komórkami
pocho-dz ˛acymi od dorosłego dawcy. Rekomendowanym poziomem zgodno´sci w
przy-padkach przeszczepie ´n krwi p˛epowinowej jest zgodno´s´c 6/6, 5/6 lub 4/6
1. Wykorzystanie genotypowania HLA w procedurach doboru ...
´sci zbadanych w zakresie HLA-A i B na poziomie antygenowym (niska rozdziel-czo´s´c) oraz DRB1 na poziomie allelicznym (wysoka rozdzielrozdziel-czo´s´c). Jednocze´snie zaleca si˛e uzupełnienie bada ´n w zakresie A, B, C, DRB1 i DQB1 na poziomie alleli w celu umo˙zliwienia racjonalnej oceny zagro˙zenia wyst ˛apieniem ostrej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (aGvHD) i odrzuceniem przeszczepu [25].
1.5. Podsumowanie
Genotypowanie HLA przy u˙zyciu prawidłowo dobranych i skrupulatnie kontrolowanych metod molekularnych jest podstawowym elementem doboru pary dawca-biorca alogenicznego przeszczepu KKM. Współczesna
immuno-genetyka dysponuje szerokim arsenałem molekularnych metod słu˙z ˛acych do
identyfikowania sekwencji genów HLA. Metody te charakteryzuj ˛a si˛e ró˙znorod-no´sci ˛a zastosowanych technologii i ró˙znym zakresem definiowanych sekwencji
DNA. Odmienne s ˛a równie˙z potrzeby badawcze podczas genotypowania HLA.
Podczas wst˛epnych i potwierdzaj ˛acych bada ´n chorych posiadaj ˛acych
wska-zania do transplantacji KKM i członków ich rodzin oraz wst˛epnych bada ´n
rekrutowanych niespokrewnionych dawców najcz˛e´sciej wystarczaj ˛acy jest niski poziom rozdzielczo´sci bada ´n HLA w zakresie loci A, B i DRB1. Podczas selekcji niespokrewnionych dawców KKM zachodzi cz˛esto konieczno´s´c wykonania bada ´n dodatkowych loci lub bada ´n A, B, DRB1 o wysokiej rozdzielczo´sci, co jest czasochłonne. Przedłu˙zaj ˛acy si˛e dobór niespokrewnionego dawcy mo˙ze spowodowa´c przej´scie stanu pacjenta w faz˛e nieoptymaln ˛a dla leczenia
trans-plantacyjnego i dlatego w procesie doboru preferowani s ˛a dawcy o poziomie
wytypowania wy˙zszym od wymaga ´n minimalnych (>A,B,DRB1 o niskiej rozdziel-czo´sci). Ostateczne genotypowanie potwierdzaj ˛ace pary dawca-biorca musi by´c
wykonane na odpowiednio wysokim poziomie rozdzielczo´sci, pozwalaj ˛acym na
wykluczenie lub identyfikacj˛e niezgodno´sci allelicznych w zakresie HLA-A, B, C, DRB1 i DQB1. W procesie doboru alogenicznego dawcy KKM nale˙zy stosowa´c metody molekularne o optymalnej wiarygodno´sci i rozdzielczo´sci, odpowiednio
do fazy doboru. Niejednoznaczne wyniki genotypowania HLA s ˛a w wielu
przy-padkach nie do unikni˛ecia, st ˛ad konieczne jest pełne zrozumienie potencjalnego znaczenia niejednoznaczno´sci dla ostatecznego wyniku transplantacji. Prawi-dłowe zastosowanie dost˛epnych metod genotypowania HLA o odpowiedniej rozdzielczo´sci jest warunkiem przeprowadzenia doboru optymalnego dawcy. Optymalizacja doboru mo˙ze pozwoli´c na dalsz ˛a popraw˛e prze˙zycia chorych po transplantacji komórek krwiotwórczych oraz na zmniejszenie cz˛esto´sci wyst˛epowania gro´znych powikła ´n immunologicznych i infekcyjnych.
Praca powstała przy współfinansowaniu w ramach projektu badawczego Na-rodowego Centrum Nauki Nr N N402 351138.
1.5. Podsumowanie
Literatura
[1] Viollier R., Socie G., Tichelli A. i wsp.: Recent improvement in outcome of unrelated donor transplantation for aplastic anemia. Bone Marrow Transplant., 2008; 41: 45-50 [2] Robinson J., Mistry K., McWilliam H. i wsp.: The IMGT/HLA database. Nucleic Acids
Res., 2011; 39: D1171-1176
[3] Holdsworth R., Hurley C.K., Marsh S.G. i wsp.: The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and -DQB1 alleles and their association with sero-logically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens. Tissue Antigens, 2009; 73: 95-170
[4] Nowak J., Mika-Witkowska R., Graczyk-Pol E.: Genetic methods of HLA typing. W: Molecular Aspects of Hematologic Malignancies, red.: M. Witt, M. Dawidowska, T. Szczepanski. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 2012, 325-339
[5] Dalva K., Beksac M. HLA typing with sequence-specific oligonucleotide primed PCR (PCR-SSO)and use of the Luminex technology. Methods Mol. Med., 2007; 134: 61-69 [6] Schaffer M., Olerup O.: HLA-AB typing by polymerase-chain reaction with sequence-specific primers: more accurate, less errors, and increased resolution compared to serological typing. Tissue Antigens, 2001; 58: 299-307
[7] Turner D.M., Poles A., Brown J. i wsp.: HLA-A typing by reference strand-mediated conformation analysis (RSCA) using a capillary-based semi-automated genetic ana-lyser. Tissue Antigens, 1999; 54: 400-404
[8] Sanger F.: The Croonian Lecture, 1975. Nucleotide sequences in DNA. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 1975; 191: 317-333
[9] Voelkerding K.V., Dames S.A., Durtschi J.D.: Next-generation sequencing: from basic research to diagnostics. Clin. Chem., 2009; 55: 641-658
[10] King C.R., Scott-Horton T.: Pyrosequencing: a simple method for accurate genoty-ping. Methods Mol. Biol., 2007; 373: 39-56
[11] National Marrow Donor Program, web page, Edition: Sep 24, 2012,http://www. marrow-donor.org/cgi-bin/DNA/dnatyp.pl
[12] Cano P., Klitz W., Mack S.J. i wsp.: Common and well-documented HLA alleles: report of the Ad-Hoc committee of the american society for histocompatiblity and immu-nogenetics. Hum. Immunol., 2007; 68: 392-417
[13] Tiercy J.M., Nicoloso G., Passweg J. i wsp.: The probability of identifying a 10/10 HLA allele-matched unrelated donor is highly predictable. Bone Marrow Transplant., 2007; 40: 515-522
[14] Nowak J., Graczyk-Pol E., Mika-Witkowska R., Zajko M., Rogatko-Koro´s M., Sak-Budzisz J.: Skuteczno´s´c poszukiwania przez O´srodek Instytutu Hematologii i Trans-fuzjologii niespokrewnionych dawców komórek krwiotwórczych w krajowych i za-granicznych rejestrach w latach 2001-2006 dla pacjentów z ostrymi i przewlekłymi białaczkami. Postepy Nauk Med., 2007; 20: 298-303
[15] Nowak J., Mika-Witkowska R., Siwik D., Zajko M., Łopacz P., Sak-Budzisz J.: Porów-nanie wyników typowania antygenów HLA klasy I uzyskanych metodami serologicz-nymi i molekularserologicz-nymi – analiza bł˛edów. Acta Haematol. Pol., 2004; 35, 251-257 [16] J˛edrzejczak W.W.: Aktualne wskazania do przeszczepiania krwiotwórczych komórek
macierzystych. Acta Haematol. Pol., 2009; 40: 305–311
[17] Nowak J.: Role of HLA in hematopoietic SCT. Bone Marrow Transplant., 2008; 42 Suppl. 2: S71-76
1. Wykorzystanie genotypowania HLA w procedurach doboru ...
[18] Nowak J., Wachowiak J.: Genetic basis of donor-recipient matching in allogeneic transplantation of hematopoietic stem cells. w: Molecular Aspects of Hematologic Malignancies, red.: M. Witt, M. Dawidowska, T. Szczepanski. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 2012, 237-254
[19] Petersdorf E.W., Gooley T., Malkki M. i wsp.: Clinical significance of donor-recipient HLA matching on survival after myeloablative hematopoietic cell transplantation from unrelated donors. Tissue Antigens, 2007; 69 Suppl. 1: 25-30
[20] Bray R.A., Hurley C.K., Kamani N.R. i wsp.: National marrow donor program HLA matching guidelines for unrelated adult donor hematopoietic cell transplants. Biol. Blood Marrow Transplant., 2008; 14: 45-53
[21] Tiercy J.M., Nicoloso G., Passweg J. i wsp.: The probability of identifying a 10/10 HLA allele-matched unrelated donor is highly predictable. Bone Marrow Transplant., 2007; 40: 515-522
[22] Nowak J., Mika-Witkowska R., Zajko M., Lopacz P.: Reliability of HLA-Cw data col-lected in unrelated bone marrow registry and their usefulness for preliminary donor selection. Int. J. Immunogenet., 2005; 32: 319-322
[23] Nowak J.: Dobór dawców komórek krwiotwórczych. w: Podstawy immunogenetyki transplantacyjnej, red.: J. Nowak, J. Fabija ´nska-Mitek. Pro Pharmacia Futura, War-szawa 2012, 82-91
[24] Marosz-Rudnicka A., Mika-Witkowska R., Graczyk-Pol E., Długok˛ecka A., Rogatko-Koro´s M., Nowak J.: Immunogenetyczny dobór dawcy allogenicznych krwiotwór-czych komórek macierzystych. Hematologia, 2012; 3(3): 1-10
[25] Kamani N., Spellman S., Hurley C.K. i wsp.: State of the art review: HLA matching and outcome of unrelated donor umbilical cord blood transplants. Biol. Blood Marrow Transplant., 2008; 14: 1-6
R O Z D Z I A Ł
2
B
ANKI KRWI P ˛
EPOWINOWEJ
W
P
OLSCE I NA ´
SWIECIE
Anna Maria Gronkowska, El˙zbieta Urbanowska
Pracownia Immunogenetyki, Bank Komórek Krwiotwórczych, Klinika Hematologii, Onkologii i Chorób Wewn˛etrznych, SP CSK WUM, Warszawa
Streszczenie
Krew p˛epowinowa oraz bogato ukrwione ło˙zysko s ˛a elementami odpadowymi po urodzeniu dziecka, pomimo obecno´sci w nich wyj ˛atkowo du˙zej liczby krwio-twórczych komórek macierzystych. Unikalno´sci ˛a tych komórek jest zdolno´s´c do samoodnawiania si˛e i ró˙znicowania i z tego powodu stanowi ˛a niezwykle cenny ma-teriał transplantacyjny, którego wykorzystanie podlega jednak pewnym ogranicze-niom. Pobran ˛a krew p˛epowinow ˛a, która po poddaniu preparatyce jest nast˛epnie zamra˙zana, przechowuje si˛e na całym ´swiecie w prywatnych lub publicznych tzw. bankach krwi p˛epowinowej. Zało˙zeniem autorek niniejszego opracowania jest po-kazanie mo˙zliwie jak najobiektywniej i najszerzej aspektów przydatno´sci zbiera-nia i przechowywazbiera-nia długoterminowo, w gł˛ebokim zamro˙zeniu, w akredytowa-nych bankach krwi p˛epowinowej, jako szybko dost˛epnego ´zródła komórek macie-rzystych, przede wszystkim krwiotwórczych do ich u˙zycia w transplantacjach alo-genicznych od dawców spokrewnionych i niespokrewnionych.
Słowa kluczowe: krew p˛epowinowa, badania immunogenetyczne, HLA, transplantacja,
CBU, banki krwi p˛epowinowej
2.1. Wst˛ep
Od przeszło 25 lat przeszczepianie alogenicznych komórek krwiotwórczych jest na ´swiecie powszechnie uznan ˛a metod ˛a leczenia chorób nowotworowych krwi i innych oraz tak˙ze ró˙znych nieprawidłowo´sci układu krwiotwórczego. Dla ponad połowy chorych, u których w ramach post˛epowania klinicznego rozwa-˙zana jest transplantacja krwiotwórczych komórek macierzystych nie ma mo˙zli-wo´sci na znalezienie potencjalnego dawcy w rejestrach kandydatów. Znalezie-nie odpowiedZnalezie-niego dawcy wymaga całkowitej identyczno´sci z biorc ˛a w zakresie antygenów zgodno´sci tkankowej (ang. human leukocyte antigens, HLA) zarówno klasy I – locus A, B i C oraz klasy II – locus DRB1 i DQB1 i coraz cz˛e´sciej tak˙ze DPB1 na poziomie wysokiej rozdzielczo´sci, co stanowi nadal realny problem dla transplantologów [1].
2. Banki krwi p˛epowinowej w Polsce i na ´swiecie
2.2. Krwiotwórcze komórki macierzyste z krwi
p˛epowinowej
Komórki macierzyste to niezró˙znicowane, pierwotne komórki, z których po-wstaj ˛a wszystkie komórki ludzkich tkanek, w tym równie˙z i krwi. Krwiotwórcze komórki macierzyste (KKM) maj ˛a unikaln ˛a cech˛e samoodnowy i ró˙znicowania si˛e, dzi˛eki czemu przez całe ˙zycie odtwarzana jest krew i układ odporno´sciowy. W zwi ˛azku z t ˛a unikaln ˛a zdolno´sci ˛a mo˙zna nimi zast ˛api´c chory szpik w przy-padku ró˙znych chorób nowotworowych krwi (białaczki, chłoniaki i in.), wrodzo-nych niedokrwisto´sci, nabytych anemii aplastyczwrodzo-nych, niedoborów immunolo-gicznych lub niektórych chorób metabolicznych i w ten sposób uratowa´c ˙zycie choremu [2].
Krew p˛epowinowa i bogato ukrwione ło˙zysko zawieraj ˛a krwiotwórcze
ko-mórki macierzyste. Po urodzeniu dziecka s ˛a jednak elementami odpadowymi
cho´c ze wzgl˛edu na unikalne cechy zawartych komórek stanowi ˛a niezwykle
cenny materiał transplantacyjny. Pobrana krew p˛epowinowa poddawana jest od razu laboratoryjnemu opracowaniu – pomiarom obj˛eto´sci zebranego preparatu i zawarto´sci w nim komórek CD34+, które s ˛a standardowym markerem krwiotwór-czych komórek macierzystych. Nast˛epnie podlega ona wytypowaniu technikami na poziomie DNA pod wzgl˛edem antygenów zgodno´sci tkankowej HLA w co naj-mniej trzech loci, tj. A, B i DR, ocenie ich ˙zywotno´sci w specjalnej hodowli oraz stanu bakteriologicznego preparatu. Po wykonaniu tych czynno´sci, krew p˛epo-winowa podlega gł˛ebokiemu zamro˙zeniu i przechowywana jest w specjalnych zbiornikach z ciekłym azotem, w których zbankowana oczekuje na wykorzysta-nie. Przeszczepienie odbywa si˛e bezpo´srednio po rozmro˙zeniu materiału przy łó˙zku chorego i bez uszkodzenia zdolno´sci tych komórek do samoodnowy oraz umiej˛etno´sci ponownego zasiedlenia w szpiku biorcy.
KKM pozyskane z krwi p˛epowinowej charakteryzuj ˛a si˛e du˙z ˛a plastyczno´sci ˛a immunologiczn ˛a, poniewa˙z s ˛a to tzw. komórki naiwne, czyli wykazuj ˛ace wi˛ek-sz ˛a dynamik˛e proliferacyjn ˛a oraz zdolno´s´c ró˙znicowania. Do´swiadczalnie stwier-dzono ich wi˛eksz ˛a skłonno´s´c do transdyferencjacji i tworzenie wi˛ekszych kolo-nii [3, 4]. Maj ˛a tak˙ze inne wymagania, co do czynników wzrostowych i zacho-wuj ˛a ekspansywno´s´c i ˙zywotno´s´c po długim okresie inkubacji in vitro. Wykazuj ˛a mniejsz ˛a alloreaktywno´s´c limfocytów ze wzgl˛edu na niedojrzało´s´c układu
odpor-no´sciowego noworodka. Mimo pocz ˛atkowej immunologicznej niekompetencji
limfocyty zachowuj ˛a pełn ˛a zdolno´s´c do aktywacji i rozwijaj ˛a sprawnie działaj ˛ac ˛a lini˛e obrony immunologicznej organizmu biorcy.
Dodatkowym aspektem wykorzystywania krwi p˛epowinowej jako ´zródła KKM jest brak w ˛atpliwo´sci natury etycznej, co do ich wykorzystania w medycynie w przeciwie ´nstwie do embrionalnych komórek macierzystych. Brak jest równie˙z jakiegokolwiek ryzyka zwi ˛azanego z uzyskiwaniem takiego materiału transplan-tacyjnego od dawców. Metody pobierania krwi p˛epowinowej s ˛a całkowicie niein-wazyjne, bardzo proste i niedrogie, a zdeponowana w banku jednostka jest do-st˛epna do natychmiastowego u˙zycia w celu przeszczepienia. Ponadto, co jest niezwykle wa˙zne brak w niej obecno´sci tych komórek nowotworowych, które
2.3. Transplantacje krwi p˛epowinowej powstaj ˛a w pó´zniejszym okresie ˙zycia pod wpływem ´srodowiska zewn˛etrznego. Ze wzgl˛edu na brak komórek immunokompetentnych znacznie mniejsze jest ryzyko powikła ´n zaka´znych oraz wyst ˛apienia reakcji przeszczep przeciwko go-spodarzowi (GvHD) ze wzgl˛edu na wi˛eksz ˛a tolerancj˛e pod wzgl˛edem antygenów zgodno´sci tkankowej [5]. Uwa˙za si˛e, ˙ze krwiotwórczych komórek macierzystych w krwi p˛epowinowej jest ich nawet do 10 x wi˛ecej ni˙z w szpiku czy krwi obwodo-wej. Wykazano równie˙z, ˙ze w´sród komórek krwi p˛epowinowej wyst˛epuje wi˛ekszy odsetek komórek macierzystych ni˙zej uorganizowanych w hierarchii krwiotwo-rzenia oraz, ˙ze wykazuj ˛a one wi˛ekszy potencjał do ekspansji i proliferacji w po-równaniu z komórkami szpiku lub krwi obwodowej [6, 7]. Zatem mniejsza liczba komórek krwiotwórczych jest w stanie zrekonstruowa´c chory szpik u biorcy, co do niedawna stanowiło istotne ograniczenie, je´sli chodzi o zastosowanie jednostek gromadzonych w bankach krwi p˛epowinowej na ´swiecie.
2.3. Transplantacje krwi p˛epowinowej
Pierwszego przeszczepienia alogenicznego jednostki krwi p˛epowinowej (CBUT) z powodzeniem dokonała Professor Eliane Gluckman w 1988 u dziecka z anemi ˛a Fanconi’ego w klinice w Pary˙zu [7]. Dawc ˛a była identyczna pod wzgl˛e-dem antygenów HLA siostra. Pacjent z pełn ˛a rekonstrukcj ˛a hematopoetyczn ˛a i limfoidaln ˛a do dzi´s czuje si˛e dobrze. Ten pierwszy sukces otworzył drog˛e do nowego pola w dziedzinie alogenicznych transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych [6–8]. Od tego te˙z momentu datuje si˛e pocz ˛atek tworzenia i orga-nizacji banków krwi p˛epowinowych.
Istnieje jednak powszechna opinia, ˙ze obj˛eto´s´c jednej jednostki krwi p˛epo-winowej wahaj ˛aca si˛e na ogół od kilkudziesi˛eciu mililitrów do co najwy˙zej 100 ml, zawieraj ˛aca niewiele ponad miliard hematopoetycznych komórek wystarcza´c mo˙ze do bezpiecznego przeszczepienia i odnowy krwiotworzenia tylko u dziecka o masie ciała do 30 kg. Jest to zdecydowanie za mało komórek, aby efektywnie zabezpieczy´c krwiotworzenie u dorosłego pacjenta po mieloablacji, to znaczy wyeliminowaniu chemioterapi ˛a komórek nowotworowych. A jak dot ˛ad wszyst-kie próby in vitro tzw. ekspansji prowadzone intensywnie w latach 90 ko ´nca XX wieku, czyli namno˙zenia krwiotwórczych komórek macierzystych krwi p˛epowi-nowej i uzyskiwania w ten sposób wi˛ekszej liczby komórek nie powiodły si˛e i wzbudzaj ˛a coraz mniejsze zainteresowanie naukowców [4]. Zwi˛ekszenia liczby komórek krwiotwórczych dokonano wi˛ec z powodzeniem poprzez wykorzystanie kilku jednostek CBU do zabiegu przeszczepienia u dorosłych chorych [9–12].
Pierwszy zabieg przeszczepienia krwi p˛epowinowej w Polsce wykonali w 1994 r. u chłopca z ostr ˛a białaczk ˛a szpikow ˛a prof. A. Lange we współpracy z prof. W.W. J˛edrzejczakiem. Natomiast w 2003 r. w Klinice Hematologii, Onko-logii i Chorób Wewn˛etrznych WUM dokonano przeszczepienia wi˛ecej ni˙z jednej jednostki krwi p˛epowinowej u 21-letniego chłopaka z ostr ˛a białaczk ˛a oporn ˛a na chemioterapi˛e, dla którego nie mo˙zna było znale´z´c dawcy niespokrewnionego w realnie szybkim czasie ze wzgl˛edu na rozwój choroby i konieczno´sci szybko przeprowadzonego zabiegu z punktu widzenia jego skuteczno´sci [13]. Podano 23
2. Banki krwi p˛epowinowej w Polsce i na ´swiecie
dwie jednostki krioprezerwowanej krwi p˛epowinowej ró˙zni ˛ace si˛e ł ˛acznie trzema antygenami HLA z biorc ˛a. Ró˙znice dotyczyły locus A oraz locus DR. Całkowita liczba przeszczepionych TNC wynosiła 2,2 ×107/kg m.c. biorcy, a komórek CD34 0,5 ×107/kg m.c. biorcy. Ł ˛aczna liczba przeszczepionych prekursorowych komó-rek krwiotwórczych tworz ˛acych kolonie erytroidalne wynosiła 2,2 ×104/kg m.c. biorcy, a liczba komórek prekursorowych tworz ˛acych kolonie granulocytarno-makrofagowe wynosiła 2,25 ×104/kg m.c. biorcy. Biorca posiadał grup˛e krwi O Rh dodatni ˛a, natomiast pierwsza jednostka krwi p˛epowinowej miała grup˛e A Rh ujemn ˛a, a druga jednostka grup˛e krwi B Rh dodatni ˛a. Chory zmarł w 103 dobie po przeszczepieniu na skutek objawów niewydolno´sci oddechowej. W badaniu cytologicznym wykonanym w setnej dobie po przeszczepieniu stwierdzono bo-gatokomórkowy i prawidłowy cytologicznie szpik. W ramach analizowania za-stosowanego post˛epowania klinicznego u chorego wykonano badanie typowania HLA w celu okre´slenia, które komórki macierzyste zregenerowały szpik. Stwier-dzenie po przeszczepieniu dwóch ró˙znych pod wzgl˛edem HLA CBU obecno´sci antygenu jednego z antygenów HLA DRB1 na limfocytach chorego, którego przed transplantacj ˛a nie okre´slono, wskazuje na rekonstrukcj˛e szpiku przez KKM po-chodz ˛ace z jednej z przeszczepionych jednostek [13]. Na ´swiecie po raz pierw-szy wykonano podobny zabieg transplantacji dwóch CBU u dorosłego chorego w 2001 r. w USA [35].
Z kolei w marcu 2007 r. pierwszy raz u˙zyto do transplantacji krwi p˛epowino-wej, która wcze´sniej została pobrana, przetworzona i przechowywana w prywat-nym banku od 2004 r. Przeszczepienie wykonano w Klinice Hematologii Dzieci˛e-cej we Wrocławiu u 8-letniej siostry noworodka, dziewczynki chorej na neurobla-stom, która ˙zyje dotychczas.
W ostatnich latach odnotowuje si˛e coraz wi˛eksze wykorzystywanie w trans-plantologii macierzystych komórek krwiotwórczych pozyskanych z krwi p˛epo-winowej i zdeponowanych w stanie gł˛ebokiego zamro˙zenia w tzw. bankach krwi p˛epowinowej. Co prawda znacz ˛ac ˛a przewag ˛a w przypadku przeszczepiania ko-mórek krwiotwórczych pochodz ˛acych z krwi p˛epowinowej jest akceptowalno´s´c mniejszego zakresu zgodno´sci HLA pomi˛edzy dawc ˛a a biorc ˛a zwi ˛azanego z nie-dojrzało´sci ˛a tych komórek i nie wykształcenia na ich powierzchni markerów zgodno´sci tkankowej. W przypadku transplantacji krwi p˛epowinowej dopusz-czalna jest zgodno´s´c w zakresie czterech loci A, B, C i DRB1, a nie co najmniej jednej niezgodno´sci, jak w przypadku dobrania ˙zywego dawcy krwiotwórczych komórek ze szpiku lub z krwi obwodowej. Przeszczepianiu komórek krwi p˛epo-winowej z reguły towarzyszy słabszy przebieg choroby „przeszczep przeciw go-spodarzowi” (GvHD) a i cz˛e´sciej efekt „przeszczepu przeciw białaczce” (GvLR) bardzo po˙z ˛adanego u niektórych chorych. Oba te czynniki maj ˛a istotne znacze-nie w podnoszeniu zainteresowania zbieraznacze-niem i „bankowaznacze-niem” jednostek krwi p˛epowinowej, co umo˙zliwia łatwiejsz ˛a dost˛epno´s´c do takiego materiału trans-plantacyjnego, zwłaszcza ˙ze jest to materiał ju˙z opracowany pod wzgl˛edem la-boratoryjnym. Oznacza to, ˙ze macierzyste komórki krwiotwórcze s ˛a przebadane pod wzgl˛edem bakteriologicznym i wirusologicznym, policzone oraz sprawdzony został ich potencjał biologiczny. Wobec tego zostało wykazane naukowo, ˙ze
2.4. Wybór ´zródła KKM do transplantacji mniejsza liczba komórek CBU jest w stanie zrekonstruowa´c chore krwiotworze-nie u biorcy, co dotychczas uwa˙zano na ´swiecie za podstawowe ograniczekrwiotworze-nie ich zastosowania. W ostatnim czasie pojawiło si˛e przypuszczenie, ˙ze sposo-bem omini˛ecia kwestii małej liczby komórek krwiotwórczych w pozyskiwanych przez banki jednostkach CB mo˙ze by´c przeszczepienie równolegle kilku jedno-stek i w ten sposób zwi˛ekszenie liczby multipotencjalnych komórek w materiale transplantacyjnym. Obecnie na ´swiecie wykonano ju˙z ponad 1500 takich trans-plantacji [14]. Zastosowanie wi˛ecej ni˙z jednej CBU wykazały, ˙ze prowadzi ono do szybszej odnowy układu krwiotworzenia u biorcy przeszczepu, pomimo ˙ze wsz-czepieniu ulega zawsze tylko jedna z jednostek, co wykazano badaniem chimery-zmu potransplantacyjnego [15]. Badanie chimerychimery-zmu obrazuje na poziomie ge-netycznym, które komórki rekonstruuj ˛a zniszczone komórki biorcy. Okazało si˛e, ˙ze u pacjenta po transplantacji wykrywane s ˛a tylko markery charakterystyczne dla jednej z nich [13, 16]. Mechanizmy le˙z ˛ace u podstaw tej obserwacji nie s ˛a znane. Badania z 2005 roku dowiodły, ˙ze komórki CBU, która nie uległa wszcze-pieniu spełniaj ˛a rol˛e pomocnicz ˛a dla komórek wszczepiaj ˛acych si˛e. Komórki
me-zenchymalne obecne równie˙z w CBU prawdopodobnie wspomagaj ˛a
wszczepie-nie komórek macierzystych jednej z kilku jednocze´swszczepie-nie podawanych jednostek i to tej, która zawiera wi˛eksz ˛a liczb˛e limfocytów T CD3+. Komórki mezenchy-malne mog ˛a wykazywa´c działanie supresyjne na limfocyty T CD3+ [17].
2.4. Wybór ´zródła KKM do transplantacji
Kryteria wyboru materiału transplantacyjnego zostały opracowane i zapropo-nowane przez V. Rocha i E. Gluckman [18]. Zgodnie z wytycznymi Europejskiej Grupy Przeszczepiania Szpiku EBMT do przeszczepienia alogenicznych KKM wy-bór rodzaju materiału transplantacyjnego zale˙zy przede wszystkim od zgodno´sci w HLA. W przypadku krwi p˛epowinowych dla CBU dotyczy to zgodno´sci w za-kresie HLA A, B i DRB1 na poziomie alleli, przy czym zgodno´s´c w HLA C jest nie brana pod uwag˛e. Tak˙ze zgodno´s´c alleliczna w HLA A i B generalnie nie jest roz-wa˙zana. Preferowana jest bardziej ró˙znica w A lub B ni˙z ró˙znica w DRB1 [5, 22]. Ponadto, niezb˛edna jest okre´slona liczba KKM w materiale transplantacyjnym, w tym liczba całkowita komórek j ˛adrzastych w zale˙zno´sci od stopnia zgodno´sci z chorymi w zakresie HLA:
• przy zgodno´sci 5/6 min. 2.5 ×107/kg TNC przed mro˙zeniem – 2.0 ×107/kg (po rozmro˙zeniu),
• przy zgodno´sci 4/6 min. 3.5 ×107/kg TCN przed mro˙zeniem – 3.0 ×107/kg (po rozmro˙zeniu),
oraz liczba komórek CD34 1.2 – 1.7 ×105/kg masy ciała biorcy. W Tabeli 2.1
przedstawiono warto´sci w ró˙znych materiałach transplantacyjnych dla krwio-twórczych komórek macierzystych uwzgl˛edniaj ˛ace liczby komórek jednoj ˛ adrza-stych CD3 i CD34 pozytywnych oraz wymagania dotycz ˛ace biorcy.
Wiadomo, ˙ze najlepszym dawc ˛a jest rodzony brat albo siostra, ale nie wszyscy chorzy mog ˛a mie´c takiego klasycznego dawc˛e. Zgodnie z prawami dziedziczenia 25
2. Banki krwi p˛epowinowej w Polsce i na ´swiecie
Tabela 2.1: Warto´sci krwiotwórczych komórek macierzystych (KKM) w ró˙znych materia-łach transplantacyjnych [27]. Rodzaj KKM Obj˛eto´s´c (kg m.c. dawcy) Zawarto´s´c CD34+ (liczba kom./ kg m.c. biorcy) Zawarto´s´c CD3+ (liczba kom./ kg m.c. biorcy) Dawka (liczba kom./ kg m.c. biorcy) Szpik 10-20 ml/kg 2-3×106/kg 25×106/kg >2×108 TNC/kg Krew obwodowa po mobilizacji 150-400 ml 8×106/kg 250×106/kg 5-10×106 CD34+/kg Krew p˛epowi-nowa 80-160 ml 0.2×106/kg 4×106/kg >3×107 TNC/kg tylko co czwarty brat lub siostra odziedziczy te same geny HLA od obojga rodzi-ców. Zale˙znie od wielko´sci rodzin, chory cz˛e´sciej lub rzadziej mo˙ze otrzyma´c ko-mórki krwiotwórcze od dawcy spokrewnionego. Statystyki mówi ˛a, ˙ze tylko około 35 % chorych ma zgodnego w HLA rodzinnego dawc˛e komórek krwiotwórczych. Pozostali chorzy wówczas zostaliby pozbawieni mo˙zliwo´sci zastosowania u nich takiej terapii. Przeszło 60% chorych zale˙znych jest od niespokrewnionego dawcy, inaczej nazywanego dawc ˛a alternatywnym i musz ˛a oczekiwa´c na znalezienie nie-spokrewnionego dawcy o identycznych antygenach HLA w rejestrach na ´swiecie. Transplantacje krwi p˛epowinowej s ˛a całkowicie bezpieczne, jednak maj ˛a ograniczenie spowodowane ilo´sci ˛a zbieranego materiału. Krew tak ˛a pobiera si˛e zawsze po odp˛epnieniu noworodka. Pozostaje ona w ło˙zysku i odci˛etej p˛epo-winie, a pobranie jej nie wyrz ˛adza jakiejkolwiek krzywdy ani matce ani dziecku. Zwykle udaje si˛e pozyska´c małe obj˛eto´sci około 100 ml lub nieco wi˛ecej. Z tego wzgl˛edu najlepsze wyniki przeszczepiania uzyskuje si˛e u biorców, którymi s ˛a dzieci z chorobami nienowotworowymi, wa˙z ˛acymi do 10 kg. W ostatnim okresie przeszło 7% transplantacji w Europie odbywa si˛e z zastosowaniem alogenicznych KKM pochodz ˛acych z krwi p˛epowinowej [7, 19, 20, 23].
Zgodnie z wytycznymi Europejskiej Grupy Przeszczepiania Szpiku do
prze-szczepienia alogenicznych komórek krwiotwórczych kwalifikowani s ˛a chorzy
z ró˙znymi rozpoznaniami. Lista chorób, które leczone s ˛a transplantacjami krwio-twórczych komórek macierzystych stale si˛e wydłu˙za. Jednocze´snie zabieg taki powinien by´c elementem planowanego leczenia od momentu rozpoznania cho-roby. Preferowany jest zabieg od najlepszego z mo˙zliwych dawców ze wszystkich dost˛epnych ´zródeł [22].
2.5. Współpracuj ˛
ace organizacje mi˛edzynarodowe
Na ´swiecie tylko dla około 40% chorych wymagaj ˛acych transplantacji udaje si˛e znale´z´c potencjalnego dawc˛e komórek krwiotwórczych. Zasadniczym ´zródłem
poszukiwania s ˛a rejestry niespokrewnionych dawców komórek krwiotwórczych
i banki krwi p˛epowinowej tj. placówki przechowuj ˛ace wytestowane pod wzgl˛e-dem tkankowym i infekcyjnym jednostki krwi p˛epowinowej na ´swiecie.
2.5. Współpracuj ˛ace organizacje mi˛edzynarodowe W 1974 r. w Maastricht w Holandii ustanawiaj ˛ac wspólnie z naukowcami i
le-karzami uczestnicz ˛acymi w klinicznych transplantacjach komórek
krwiotwór-czych powołano do ˙zycia organizacj˛e – European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT) - w celu dzielenia si˛e swoimi do´swiadczeniami i pod-noszeniem wiedzy. Organizacja ta bazuje na umowie przedstawicieli krajów za-anga˙zowanych w wykonywanie tego rodzaju zabiegów i funkcjonuje na zasadzie non-profit. Zarz ˛ad EBMT odpowiada za wszystkie wypracowane decyzje i zasady, które podejmuje w drodze głosowania. Jej członkami s ˛a poszczególne aktywne o´srodki wykonuj ˛ace ka˙zdego rodzaju transplantacje krwiotwórczych komórek macierzystych oraz inne instytucje zaanga˙zowane w opiek˛e dawców i biorców. Rozró˙znia si˛e pełne członkostwo i tzw. towarzysz ˛ace, zwi ˛azane ze raportowaniem danych o transplantacjach do prowadzonego przez EBMT rejestru. Osoby aktyw-nie zaanga˙zowane w dziedziaktyw-nie transplantacji szpiku mog ˛a ubiega´c si˛e o indywi-dualne członkostwo w EBMT. Nowi członkowie przyjmowani s ˛a po przesłaniu do biura EBMT formularza wniosku o członkostwo. Wniosek zawiera podpisy dwóch osób z o´srodków, które ju˙z posiadaj ˛a członkostwo w EBMT. Po przyj˛eciu wniosku, sekretarz EBMT przyznaje tymczasowe członkostwo oraz kod identyfikacyjny dla o´srodka tzw. Centre Identification Code (CIC). Na odbywaj ˛acym si˛e okresowo walnym zgromadzeniu sekretarz przedstawia wszystkie wnioski o członkostwo i po ich zatwierdzeniu na posiedzeniu o´srodek staje si˛e odpowiednio - pełnym
członkiem EBMT, towarzysz ˛acym lub indywidualnym.
W 1988 r. z inicjatywy Immunology Working Party działaj ˛acej w ramach euro-pejskiej organizacji transplantacji szpiku EBMT rozpocz˛eła działalno´s´c I-sza edy-cja internetowej bazy danych o dawcach komórek hematopoetycznych. Kompu-terowa baza immunogenetycznych danych o antygenach zgodno´sci tkankowej zdrowych ochotników na całym ´swiecie została opublikowana na stronie inter-netowej Bone Marrow Donor Worldwide (BMDW z biurem w Leiden, Holandia) w lutym 1989 r. i zawierała dane o 155 000 dawców z 8 rejestrów.
Co miesi ˛ac rejestry zrzeszone w ramach BMDW przesyłaj ˛a aktualizacj˛e zawar-to´sci swoich baz elektronicznych do centralnego serwera. Organizacja BMDW stanowi dobrowolny wspólny wysiłek rejestrów niespokrewnionych dawców ko-mórek krwiotwórczych i banków krwi p˛epowinowej na ´swiecie. Kierownictwo tej organizacji stanowi jeden przedstawiciel z ka˙zdego rejestru dawców albo banku krwi p˛epowinowej i spotyka si˛e dwa razy do roku w celu omówienia osi ˛agni˛e´c i niezb˛ednych aktualnych zagadnie ´n organizacyjnych, prawnych i administracyj-nych.
O´srodki zajmuj ˛ace si˛e poszukiwaniem i doborem materiału transplantacyj-nego korzystaj ˛a na stronie internetowejwww.bmdw.orgz wyszukiwarki, pozwala-j ˛acej na znalezienie wszystkich dost˛epnych na ´swiecie kandydatów na dawców komórek krwiotwórczych dla potrzebuj ˛acego chorego pod warunkiem, ˙ze znane s ˛a HLA A, B i DR chorego. Uprawnieni u˙zytkownicy z tych o´srodków transplan-tacyjnych lub rejestrów i banków otrzymuj ˛a hasło i kod dost˛epu do bazy w celu wyłonienia odpowiedniego tj. w pełni zgodnego pod wzgl˛edem HLA, dawcy nie-spokrewnionego lub jednostki krwi p˛epowinowej, co nast˛epnie wymaga akcepta-cji o´srodka transplantacyjnego wykonuj ˛acego zabieg. Na szybko´s´c tego działania
2. Banki krwi p˛epowinowej w Polsce i na ´swiecie
Tabela 2.2: Wynik przeszukania jednostek krwi p˛epowinowych w bazie BMDW (dane BMDW z dn. 27 sierpnia 2012,http://www.bmdw.org/).
istotnie wpływa cz˛esto´s´c wyst˛epowania podobnych antygenów HLA w okre´slonej populacji.
Do stałych inicjatyw BMDW nale˙zy maksymalizowanie szansy na znajdowa-nie potencjalnych i dost˛epnych dawców komórek macierzystych albo jednostek krwi p˛epowinowej poprzez dostarczanie nowozrekrutowanych i opisanych feno-typowo HLA dawców i jednostek krwi p˛epowinowej dost˛epnych na całym ´swie-cie. Ponadto, nale˙zy te˙z dostarczanie istotnych powszechnych informacji z my-´sl ˛a o pacjencie, a tak˙ze przedstawianie statystyk mówi ˛acych o wzro´scie zasobów ró˙znych rejestrów dawców i banków CB, opisanych pod wzgl˛edem HLA dawców. W przypadku banków CB ka˙zda zgromadzona jednostka opisana zostaje równie˙z w zakresie jej obj˛eto´sci i zawarto´sci komórek jednoj ˛adrzastych. Przykładowy wy-nik przegl ˛adu internetowej bazy BMDW dla biorcy o okre´slonym HLA przedsta-wia Tabela 2.2.
´Swiatowa baza dost˛epnych dawców komórek krwiotwórczych BMDW funk-cjonuje w zgodzie z zaleceniami ustalanymi przez Europejsk ˛a Fundacj˛e Daw-ców - Eurodonor Foundation oraz pod auspicjami ´swiatowej organizacji dawDaw-ców
szpiku - World Marrow Donor Association (WMDA z siedzib ˛a w Leiden,