Replikacja, naprawa i
U eukariontów DNA występuje w kompleksie zwanym
chromatyną
Replikacja u eukariontów
• Inicjacja, elongacja, terminacja
• Problem końców chromosomów
• Jądro - organelle
Inicjacja
ORI (Origins of replication)
• ARS (Autonomously Replicating Sequence) u drożdży - Specyficzna sekwencja 200 pz jest minimalną sekwencja
wymaganą do inicjacji replikacji chromosomowego DNA.
U ssaków inicjacja (ORI) obejmuje sekwencję 10 000 pz U roślin sekwencje ORI nie są zidentyfikowane
W chromosomach istnieje wiele potencjalnych ORI, ale nie wszystkie funkcjonują w każdej komórce
Fragment DNA replikowany z jednego ORI nosi nazwę replikonu ( u roślin długość replikonu to przeciętnie 50-70 kb)
Nie wszystkie ORI startują w tym samym momencie, jednak
porządek ich uruchamiania jest w komórkach ściśle kontrolowany i zależy od stanu kondensacji chromatyny w danym miejscu.
Kontrola inicjacji
• Licencjonowanie (kontrola pozytywna) – zapewnia, że chromosomy będą się replikować tylko wtedy, gdy w sposób prawidłowy przejdą przez mitozę i znajdą się w komórce potomnej.
• Aby nastąpiła inicjacja, do ORI musi się przyłączyć Kompleks Rozpoznający Origin (ORC – Origin Recognition Complex) i dodatkowe białka (czynniki licencjonujące Cdc-6 i Cdt-1)
umożliwiające ścisłe pokrycie sąsiadującego DNA białkami MCM (Minichromosome Maintenance). Tylko DNA pokryty białkami MCM może być replikowany. Białka MCM są usuwane przez
Negatywna kontrola inicjacji - Geminina
• Geminina – białko występujące w komórkach w fazie G2
• Przeciwdziała przyłączaniu się białek MCM do świeżo
zreplikowanego DNA (zablokowanie czynnika Cdt-1)
• Jest degradowana po zakończeniu mitozy
Elongacja
• Kompleks wielo-enzymatyczny zawierający polimerazę DNA
katalizuje przyłączanie deoksyrybonukleotydów do 3’ końca DNA lub RNA przyłączonego do nici matrycowej DNA.
• Synteza DNA idzie w kierunku 5’ – 3’, a matryca jest odczytywana w kierunku 3’-5’.
• Polimeraza DNA może dodawać nukleotydy tylko do już istniejącego fragmentu kwasu nukleinowego (primera).
• Polimeraza DNA jest nieaktywna w nieobecności primera z wolną grupą 3’ OH, związanego poprzez wiązania wodorowe z matrycą. • Primery są syntetyzowane przez specyficzną polimerazę
rybonukleotydową zwaną ‘DNA primazą’. Inicjuje ona syntezę primera rozpoczynając od rybonukleotydu purynowego.
Elongacja - cd
• Ze względu na asymetrię widełek replikacyjnych *(kierunki!) synteza DNA jest w połowie nieciągła. Na nici wiodącej (jeden primer)
dodawanie nukleotydów odbywa się w sposób ciągły. Na nici opóźnionej synteza odbywa się w formie krótkich fragmentów Okazaki, z których każdy wymaga swojego primera.
• Wytworzenie ciągłej cząsteczki na matrycy nici opóźnionej wymaga systemu naprawy DNA zawierającego specyficzną rybonukleazę – RNazę H, który usuwa primery RNA i zastępuje je fragmentami DNA. Inny enzym – ligaza DNA łączy koniec 3’ nowego fragmentu DNA z 5’ końcem fragmentu DNA poniżej.
Elongacja - cd
• W jądrze eukariontów występują trzy główne polimerazy DNA – α, δ i ε.
• α – głównie funkcja primazy
• δ i ε – synteza DNA na nici prowadzącej i opóźnionej.
• Helikaza DNA (występuje w kompleksie z pol δ i ε ) rozplata dwuniciowy DNA u nasady widełek.
• Topoizomerazy DNA usuwają napięcia torsyjne powstające w wyniku rozplatania (są przyłączone przed widełkami).
Wierność replikacji
• Wysoka wierność replikacji (śr. 1 błąd na 10 9 zreplikowanych pz).
• Polimerazy DNA są enzymami z funkcją autokorety (proofreading), które usuwają własne błędy podczas replikacji.
• Kluczowe dla autokorekty są ich aktywności 3’-5’ egzonukleazy, dzięki którym usuwają źle sparowane nukleotydy od 3’ końca nowo zsyntetyzowanego fragmentu DNA. Specjalny system naprawy
Terminacja replikacji
• Terminacja następuje w miejscach, w których spotykają
się nowo syntetyzowane nici DNA powstałe z dwóch
Aktywność telomerazowa -replikacja końców
chromosomów (telomerów)
Chromosomy politeniczne (Drosophila – 10 rund replikacji bez rozdzielania cząsteczek = 2048 cząsteczek ułożonych obok siebie)
Przyczyny uszkodzeń DNA i ich efekty
• Tlen, wolne rodniki
• UV
• Związki alkilujące
• Spontaniczna deaminacja (C do
U)
• Przerwanie łańcucha
• Modyfikacje chemiczne zasad
• włączanie niesparowanych zasad
Systemy naprawy DNA
• Wycięcie nukleotydów
• (dimery pirymidyn, aberracje struktury) • Naprawa błędnie sparowanych
nukleotydów (mylnie sparowane zasady)
• Naprawa przez wycięcie zasad (nietypowe – hipoksantyna, uracyl-, zalkilowane zasady)
• Uwaga: demetylacja 5-met-cytozyny!
• Naprawa bezpośrednia
(metyloguanina, dimery pirymidyn)
• System helikazy XPA (Xerdoerma
pigmentosum)
• Homologi bakteryjnych białek typu
Mut
• Glikozylaza DNA, polimeraza δ
Rekombinacja DNA
• Gra ważną rolę w podziale mejotycznym komórek (zapewnia
zróżnicowanie genetyczne gamet) i, na dłuższą metę - w ewolucji (rearanżacje sekwencji DNA umożliwiają nowe kombinacje
sekwencji, które mogą generować nowe rodzaje RNA i białek, wpływając na fenotyp).
• Mechanizmy rekombinacji są powiązane ściśle z mechanizmami replikacji i naprawy
Rodzaje rekombinacji
• Rekombinacja homologiczna występuje pomiędzy długimi sekwencjami, które zawierają rejony w dużym stopniu do siebie podobne (np.
rekombionacja mejotyczna). Wymaga białek typu RecA; katalizują one reakcję przeniesienia nici, która umożliwia jednoniciowemu fragmentowi
wniknięcie w strukturę dwuniciową w rejonie homologii (powstaje przejściowa struktura trójniciowa).
• Rekombinacja miejscowo specyficzna (np. rearanżacja genów
immunoglobulin) występuje w specyficznych loci, nie wymaga długich rejonów homologii ani białek typu RecA. Wymaga białka rekombinazy (integrazy) i krótkich sekwencji palindroomowych w DNA donorowym i akceptorowym.
• Rekombinacja nieuprawniona może zachodzić w obecności krótkich rejonów homologicznych (udział polimerazy RNA), a także przy braku jakiejkolwiek homologii (np. integracja do genomów roślin) (udział gyrazy, tj.
