R E N A TA M ATUSZEW SKA, BO ŻE N A KROGULSKA
W Y K R Y W A N IE I IZ O L A C J A B A K T E R II Z R O D Z A J U L E G I O N E L L A Z E Ś R O D O W IS K A W O D N E G O
D ETEC TIO N AND ISOLATION OF BACTERIA O F G ENU S L E G IO N E LL A FRO M W ATER EN V IR O N M EN T
Zakład Higieny Komunalnej Państwowy Zakład Higieny 00-791 Warszawa, ul.Chocimska 24 Kierownik: doc. dr hab. S. Maziarka
Przedstawiono wyniki badań dotyczących wyboru optymalnej procedury wy krywania i izolacji bakterii z rodzaju Legionella ze środowiska wodnego. Zasto sowano metodę filtracji membranowej. Porównano wzrost bakterii na filtrach celulozowych , poliwęglanowych i z fluorku poliwinylidenu. Określono optymalny czas obróbki wstępnej próbek wody (zakwaszenie, wysoka temperatura), pozw a lających na znaczną redukcję mikroflory towarzyszącej przy zachowaniu wzrostu bakterii z rodzaju Legionella.
WSTĘP
B a k te rie z ro d z a ju L egionella to tle n o w e G ra m u je m n e p ałec zk i, k tó re w y stę p u ją p o w sze ch n ie w n a tu ra ln y m śro d o w isk u w odnym i w gleb ie, m o g ą n a m n a ż a ć się ró w n ie ż w ew n ą trz k o m ó re k glo n ó w i p ie rw o tn ia k ó w [1, 11, 19]. K o lo n iz u ją sieć w o d o cią g o w ą w ody zim n ej i ciepłej, z b io rn ik i i w o d n e u rz ą d z e n ia c h ło d z ą c e o ra z klim aty zacy jn e, zw łaszcza je ż e li z a w ierają złogi o sa d ó w i rdzy. W sy stem a ch dystrybucji w ody b a k te rie te w ch o d z ą w skład b iofilm u p o w sta ją c e g o n a w ew n ętrz n y ch p o w ie rz c h n ia c h ru r i e l e m e n tó w u rz ą d z e ń k o n ta k tu ją c y c h się z w o d ą [16]. M o g ą ró w n ież w y stęp o w ać w k ro p lach w o d n e g o m ik ro a e ro so lu .
D o ro d zin y L egionellaceae n a le ż ą 34 g atu n k i Legionella przy czym najw iększym z a g ro ż e n ie m d la zd ro w ia czło w iek a je s t Legionella p n e u m o p h ila g ru p a se ro lo g ic z n a 1. Je st o n a czy n n ik iem etio lo g iczn y m tzw. ch o ro b y leg io n istó w (leg io n ello z y ) c h a r a k te ry zującej się z a p a le n ie m p łu c o b a rd z o ciężkim p rz e b ie g u (1 0 -2 0 % śm ie rte ln o śc i) [12] lub tzw. g o rączk i P o n tia c d ają c e j objaw y g ry p o p o d o b n e z sa m o istn y m w yleczeniem .
B a k te rie z ro d z a ju Legionella w ykazują d u ż ą zd o ln o ść a d a p ta c ji d o zm ien n y c h w a ru n k ó w śro d o w isk a. W z ro st Legionella o b se rw u je się przy p H o d 5,5 d o 9,2 p rzy czym o p ty m a ln y odczyn śro d o w isk a p o w in ie n w ynosić 6,8-н7,0 [1]. B a k te rie te ro sn ą w z a k re sie te m p e r a tu r 25^-45°C , pow yżej 50"C p rz e w a ż n ie g in ą [1, 20]. O p ty m a ln a te m p e r a tu ra w zro stu w ynosi 37"C. W e w n ą trz k o m ó re k glo n ó w lub p ie rw o tn ia k ó w nie tra c ą z d o ln o ści n a m n a ż a n ia w te m p e r a tu rz e 45°C, a żywe b a k te rie iz o lo w an e były z k o m ó re k glo n ó w n aw e t przy te m p e r a tu rz e w ody 68"C [1].
B a k te rie z ro d z a ju Legionella w ym agają d o w zro stu o b ec n o śc i cysteiny o ra z n ie o r g a n ic z n e g o ż e la za ( II I) [1]. W iększość stosow anych do hodow li L egionella p o d ło ż y za w ie ra b u fo ro w a n y a g a r z d o d a tk ie m e k s tra k tu d ro żd ż o w e g o , w ęgla ak ty w o w a n eg o i a - k e to g lu ta r a n u [5, 6, 7]. P o n a d to d o podłoży, w celu zw ięk szen ia ich w ybiórczości p rzy izolacji L egionella ze śro d o w isk a w o d n e g o z a le ca się sto so w a n ie różn y ch a n ty b io tyków [1, 5].
Z e w zg lęd u n a sto su n k o w o n isk ą k o n c e n tra c ję tych b a k te rii w w o d zie o ra z n a liczną m ik ro flo rę to w arz y szą cą w ykryw anie i izolacja b a k te rii z ro d z a ju Legionella ze ś r o d o w iska w o d n e g o stw a rz a d u ż e tru d n o śc i. A by zw iększyć p ra w d o p o d o b ie ń s tw o izolacji tych b a k te rii z w ody, b a d a n e p ró b k i p rz e w a ż n ie za gęszcza się sto s u ją c filtra c ję m e m b ra n o w ą lu b w iro w a n ie [3, 8, 9, 13]. W celu w y elim in o w an ia m ik ro flo ry to w arzy szącej n ie k tó rz y a u to rz y z a le c a ją o b ró b k ę w stę p n ą b a d a n e j p ró b k i w ody p o le g a ją c ą n a p o d n ie sie n iu te m p e r a tu ry d o 50°C lub za k w aszen iu d o p H = 2,2 [2—4].
Z e w zględu n a d u ż ą r ó ż n o ro d n o ś ć p ro p o n o w a n y c h m e to d izolacji i h o dow li L e gionella p r z e p ro w a d z o n o b a d a n ia m o d e lo w e, któ ry ch ce le m było w y b ra n ie o p ty m a ln y c h w a ru n k ó w h odow li o ra z o p ra c o w a n ie je d n o lite j m e to d y izolacji tych b a k te rii ze ś r o d o w iska w o d n e g o , k tó r ą m o ż n a byłoby zalecić d o ru ty n o w eg o sto so w a n ia p rz e z k rajo w e służby s a n ita rn e .
M A TERIAŁY I M ETO D Y
W badaniach stosowano szczepy wzorcowe: Legionella pneumophila A TCC 33152, Escherichia coli ATCC 35218, Staphylococcus aureus ATCC 12600 Streptococcus faecalis ATCC 29212 oraz Pseudomonas aeruginosa - szczep z kolekcji własnej wyizolowany ze środowiska wodnego. Do każdego badania przygotowywano zawiesinę wyjściową z 72 godzinnej hodowli L. pneumophila i 24 godzinnej hodowli każdego z pozostałych szczepów o gęstości 5 wg skali M cFarlanda, tzn. około 1,5 x 1СГ komórek/ml.
Do przygotowania zawiesiny wyjściowej i jej kolejnych rozcieńczeń stosowano czterokrotnie rozcieńczony płyn Ringera. W badaniach stosowano buforowane podłoże agarowe z ekstraktem drożdżowym, cysteiną i węglem aktywowanym (BCYE) o składzie (w g/l): ekstrakt drożdżowy 9,0; węgiel aktywny 3,0; agar 13,0; ACES - bufor (kwas N-2-acetamido-2-amino etanosulfono- wyjwodorotlenek potasu 10,0; dwufosforan żelaza (III) 0,25; chlorowodorek L-cysteiny 0,4; sól potasowa a-ketoglutaranu 1,0. Podłoże uzupełniano dodatkiem selektywnym G V PC o składzie: wankomycyna - HC1 1,0 mg /1, polimyksyna В 79200 I.U., cykloheksymid 80 mg/l, glicyna 3,0 g/l. Końcowe pH podłoża kompletnego wynosiło 6,9± 0,1. W badaniach stosowano również kwaśny bufor HC1-KC1 pH 2,2 ± 0,2 , podłoże Endo i Endo FM dla bakterii coli typu fekalnego [14,15] oraz agar zwykły.
W dalszych badaniach zastosowano niezależnie dwie procedury obróbki wstępnej próbek zawierających szczepy wzorcowe bakterii (procedura A i B).
P r o c e d u r a A: 10 ml z odpowiedniego rozcieńczenia hodowli każdego ze szczepów mieszano w stosunku 1:1 z kwaśnym buforem HCI-KCI pH 2,2 ± 0,2. Zastosowany w doświad czeniach czas kontaktu wynosił 10, 20 i 30 minut. Próbki zawierające szczep Legionella pneu mophila posiewano powierzchniowo na podłoże GVPC (podłoże BCYE + dodatek selektywny GV PC), próbki z innymi stosowanymi w badaniach szczepami posiewano na agar zwykły. Do próbek kontrolnych zamiast kwaśnego buforu dodawano taką samą objętość płynu Ringera.
P r o c e d u r a B: 10 ml z odpowiedniego rozcieńczenia hodowli każdego ze szczepów wzorcowych-umieszczano w łaźni wodnej w tem peraturze 50°C. Po upływie założonego w do świadczeniach czasu ogrzewania (30 i 45 minut) próbki zawierające szczep Legionella pneum op hila posiewano powierzchniowo na podłoże GV PC (podłoże BCYE + dodatek selektywny
GVPC), próbki z pozostałymi stosowanymi w badaniach szczepami posiewano na agar zwykły. Kontrolę stanowiły takie same rozcieńczenia hodowli każdego ze szczepów nie poddane działaniu podwyższonej temperatury.
Inkubację płytek z posiewami próbek po obróbce wstępnej zgodnie z proceduram i A i В prowadzono w tem peraturze 37°C, w przypadku szczepu L. pneumophila wyniki odczytywano po 72 godzinach, w pozostałych przypadkach po 24 godzinach. Wszystkie posiewy wykonywano w dwóch powtórzeniach.
W serii doświadczeń mających na celu wybór najbardziej odpowiednich filtrów m em brano wych, zastosowano filtry z mieszanych estrów celulozy, poliwęglanów (typ Isopore), fluorku poliwinylidenu (typ D urapore). Stosowano filtry firmy Millipore o średnicy 47 mm i średnicy porów 0,45 (.tm. Po przesączeniu odpowiednich rozcieńczeń hodowli szczepu wzorcowego L. pneumophila filtry membranowe umieszczano na podłożu GVPC. Płytki inkubowano w tem pe raturze 37°C, obserwacje wzrostu kolonii prowadzono codziennie przez 7 dni. Kontrolę stanowiły płytki z posiewem powierzchniowym tych samych hodowli szczepu wzorcowego. Wszystkie po siewy wykonywano w pięciu równoległych powtórzeniach
W YNIKI I ICH O M Ó W IEN IE
W pierw szym e ta p ie b a d a ń sp ra w d z o n o sk u te c z n o ść u w a ln ia n ia b a k te rii z filtró w m e m b ran o w y ch n a d ro d z e so nifikacji i w y trząsan ia. P o łą c z e n ie m e to d y z a g ęszcz an ia p ró b e k w ody p rz e z filtrac ję m e m b ra n o w ą z p o siew em p o w ierz ch n io w y m ,p o u w o ln ie n iu b a k te rii z filtró w d o płynu Ringera stosow ali te z inni a u to rz y [3,13,17]. B a d a n ia w stę p n e p rz e p ro w a d z o n o n a szczep ie w zorcow ym E. coli sto su ją c uży w an e p o w sz e c h n ie w b a d an iac h ru tynow ych w ody filtry ce lu lo zo w e i p o d ło ż e E n d o .
W p rz e p ro w a d z o n e j serii d o św ia d cz eń w y trzą san ie w czasie o d 1 m in u t d o 10 m in u t nie p rzy n io sło o cz ek iw a n eg o e fe k tu . B a k te rie p o zo staw ały zw ią za n e z filtram i, w p o siew ie p o w ierz ch n io w y m n a p ły tk a ch rosły je d y n ie p o je d y n cz e k o lo n ie .
Z a sto so w a n ie u ltra d ź w ię k ó w w czasie 1 - 4,5 m in u ty p ro w a d z iło tylko d o cz ę śc io w ego u w a ln ia n ia b a k te rii z filtró w (śre d n i odzysk 4 6 ,6 % ), przy czym k o lo n ie w p o sie w ie pow ierzch n io w y m były z n ie k sz ta łc o n e o rozm ytych b rze g ach , c z ę s to k ro ć daw ały w zro st zlew ny u tru d n ia ją c y ich p o lic ze n ie . T ru d n o ś c i z u w aln ia n ie m m ik ro o rg a n iz m ó w z c e lulozow ych filtró w m e m b ran o w y ch o p isu ją też inni au to rzy . B ou la n g er i E delstein s to p ie ń od zy sk u b a k te rii p o d c z a s so nifikacji o c e n ia ją n a 13% , S m ith i w sp. n a 4 3 % [3,17]. P rzyczyną, je s t p ra w d o p o d o b n ie k r ę ta s tr u k tu ra p o ró w filtró w celulozow ych, z te g o też w zględu n ie k tó rz y a u to rz y p r o p o n u ją sto so w a n ie filtró w p o liw ęglanow ych, poliw inyli- denow ych lub nylonow ych ch a ra k te ry z u ją c y c h się p ro s tą i g ła d k ą b u d o w ą p o ró w [17].
W d alszej części b a d a ń o b o k filtró w z estró w celulozy z a sto so w a n o filtry poliw ęgla- now e (ty p u Is o p o re ) o ra z filtry z flu o rk u poliw in y lid en u (ty p u D u r a p o re ) przy czym zre zy g n o w an o z e ta p u u w a ln ia n ia b a k te rii z filtrów . C e le m d o św ia d cz eń była o b s e rw a cja w zro stu k o lo n ii szczep u Legionella p n e u m o p h ila A T C C 33152 b e z p o ś r e d n io na filtrac h m e m b ra n o w y c h um ie sz cza n y ch na p o d ło ż u G V P C i p o ró w n a n ie liczby k o lo n ii b a k te rii ro sn ąc y ch n a filtrac h z liczbą k o lo n ii n a p ły tk ach k o n tro ln y c h z p o sie w em po w ierzchniow ym . W yniki z 5-ciu n ie z a le ż n ie p rze p ro w a d z o n y c h d o św ia d cz eń p r z e d sta w io n o n a rycinie 1.
R ó ż n ic e m iędzy liczbą ko lo n ii rosn ący ch n a filtrac h celulozow ych, n a filtrac h typu D u ra p o re i w posiew ie pow ierzch n io w y m były sto su n k o w o n iew ielk ie. W szystkie w yniki m ieściły się w tym sam ym rz ę d z ie w ielkości (1,3 - 5,6 x 10s/m l). N ajm n iej ko lo n ii ro sło na filtra c h typu Is o p o re (1,0 x 107 - 1,0 x 10s/m l). K o lo n ie L egionella w posiew ie
Rye. 1. Porównanie odzysku bakterii L. pneumophila na różnych typach filtrów membranowych i w posiewie powierzchniowym
pow ierzchniow ym na podłożu G V P C jak i na filtrach m em branow ych były błyszczące o gładkich brzegach. K olonie rosnące bezpośrednio na podłożu G V P C były białe z charakterystyczną przezroczystą strefą. S trefa w okół kolonii była w yraźnie widoczna rów nież n a filtrach z fluorku poliwinylidenu (D u rap o re), przy czym kolonie na tych filtrach były barwy krem ow ej. N a filtrach celulozowych i poliwęglanowych (Iso p o re) nie zaobserw ow ano w okół kolonii Legionella stref przejaśnienia, kolonie miały o d p o w iednio barw ę krem ow ą i białą.
K olonie Legionella na filtrach m em branow ych, niezależnie od typu filtrów, rosną wolniej niż w posiew ie powierzchniowym. W posiewie powierzchniowym są w yraźnie w idoczne po 3 dniach in k u b a c ji, na filtrach po trzech dniach są zbyt d ro b n e by m ożna było je dokładnie policzyć i scharakteryzow ać ich m orfologię. O bserw acja w zrostu L egionella na filtrach m em branow ych należy prow adzić codziennie pom iędzy 3 a 7 dniem inkubacji.
W niektórych przypadkach dodaw anie czynników selektywnych do podłoża hodow lanego m oże być niewystarczające. Z naczna redukcję m ikroflory towarzyszącej m ożna rów nież uzyskać p o d d ając próbki wody przed posiew em działaniu podwyższonej te m p eratu ry lub zakw aszeniu. Wyniki badań mających na celu d o branie optym alnego czasu przetrzym yw ania p ró b ek wody w tem p eratu rze 50°C, po którym następow ałaby znaczna redukcja m ikroflory towarzyszącej, przy zachow aniu możliwości w zrostu L egionella przedstaw iono w tabeli I.
Inkubacja zaszczepionych p róbek wody w tem p eratu rze 50°C przez 30 m inut nie m iała znaczącego wpływu na w zrost L egionella p n e u m o p h ila , spow odow ała natom iast redukcję wyjściowej liczby kom órek Streptococcus fa eca lis o 3 log, P se u d o m o n a s a eru g in o sa o 2 log oraz Escherichia coli o 1 log P rzedłużenie czasu przetrzym yw ania zaszczepionych p róbek w tem p e ratu rze 50°C do 45 m inut spow odow ało całkow itą redukcję wyjściowej liczby kom órek E. coli, Str. fa eca lis oraz P. aeruginosa. Po 45 m inutach ogrzew ania zdolność w zrostu zachowały szczepy L . p n e u m o p h ila i S. aureus,
T a b e l a I. Wzrost szczepów wzorcowych bakterii po różnym czasie inkubacji w łaźni wodnej w tem peraturze 50“C
Growth of standard strains after different time o f incubation in w ater bath at 50°C
przy czym w obu przypadkach nastąpiła redukcja wyjściowej liczby kom órek o 1 log. D ziesięciokrotna redukcja liczby kom órek L egionella jak a następ u je podczas 45 m inut inkubacji w te m p e ra tu rze 50°C m oże prow adzić do uzyskania wyników fałszywie ujem nych, w przypadku badania p róbek wody zawierających niew ielka liczbę kom órek tych m ikroorganizm ów . D latego też należy przyjąć, że w badaniach wody w kierunku wykrywania pałeczek Legionella optym alnym czasem inkubacji w te m p e ra turze 50°C jest 30 m inut. R ów nież Steel i wsp. [18] najkorzystniejsze wyniki izolacji Legionella uzyskali po 30 m inutow ej inkubacji p róbek wody w tem p eratu rze 50°C. W dośw iadczeniach D en n is i wsp. [4] bakterie z rodzaju Legionella ginęły w tej te m p eratu rze po 240 m inutach inkubacji, bakterie grupy coli po 150 m inutach, M icrococcus sp. po 90 m inutach a P se u d o m o n a s sp. po 30 m inutach.
P ro ced u rą stosow aną alternatyw nie lub rów nolegle do wysokiej tem p eratu ry , m ającą na celu redukcję m ikroflory towarzyszącej, jest p otraktow anie p ró b ek wody kwaśnym buforem o pH 2,2. W przeprow adzonych przez nas badaniach porów nano wpływ dzia łania niskiego odczynu pH na szczep wzorcowy L egionella oraz inne szczepy bakterii najczęściej w ystępujące w zanieczyszczonych próbkach wody. C elem badania było d o branie optym alnego czasu k o ntaktu, podczas którego wystąpi w ystarczająca redukcja m ikroflory towarzyszącej bez znacznego wpływu na wzrost L egionella. Wyniki po d an o w tabeli II.
Inkubację w kwaśnym buforze przeprow adzono w czasie k o n tak tu 10, 20 i 30 m inut. Z aobserw ow ano, że po 10 m inutach następ u je całkow ita redukcja liczby kom órek Str. fa e c a lis przy wyjściowej liczbie kom órek 1,1 x 108 cfu/ml. W przypadku pozostałych szczepów zanotow ano redukcję E. coli z 3,9 x 10s do 3,5 x 107 cfu/m l, S. aureus z 2,5 x 108 do 1,5 x 106 cfu/ml. Przedłużenie czasu k o n tak tu tych bakterii z kwaśnym buforem do 20 m inut spow odow ało całkow ita redukcję ich liczby. Przy najkrótszym z zastosow anych czasie kontaktu (10 m inut) redukcja liczby bakterii P. aeruginosa i L. p n e u m o p h ila wynosiła odpow iednio z 7,7 x 107 do 4,6 x 107 cfu/ml oraz 2,7 x 107 do 1,3 x 107 cfu/ml. Przedłużenie czasu k o ntaktu tych szczepów z kwaśnym buforem do 20 m inut spow odow ało całkow itą redukcję liczby kom órek P. aeruginosa, n atom iast liczba kom órek L. p n e u m o p h ila została zredukow ana do 2 x 10" cfu/ml.
T a b e l a I I . W zrost szczepów wzorcowych bakterii po różnym czasie inkubacji z kwaśnym buforem (pH 2,2)
Growth of standard strains after different tim e of contact with acid buffer (pH 2,2)
P rzedłużenie czasu inkubacji w buforze o pH 2,2 do 30 m inut spow odow ało całkow itą redukcję liczby kom órek L . p n e u m o p h ila .
S teel i wsp. zaproponow ali 5-cio i 10-cio minutowy czas kontaktu p ró b ek z kwaśnym buforem , przy czym skuteczniejszą redukcję m ikroflory towarzyszącej uzyskali po 10 m inutach [18]. B adania B o p p ’a i wsp. [2] wykazały oporność L . p n e u m o p h ila na 30 m inutow e działanie kw aśnego buforu, przedłużenie czasu k o ntaktu do 60 m inut pow o dow ało dziesięciokrotną redukcję wyjściowej liczby kom órek. Poniew aż je d n a k ju ż po 5 m inutach k o n tak tu następow ała stukrotna redukcja liczby bakterii towarzyszących autorzy uznali, że po 5 m inutach potraktow anie badanej próbki kwaśnym buforem jest w ystarczające dla efektywnej izolacji L egionella z zanieczyszczonych p ró b ek wody. R ów nież 5-cio m inutowy czas k o ntaktu badanych p róbek z kwaśnym buforem zaleca n o rm a ISO [8]. O wyraźnym wzroście efektywności izolacji L. p n e u m o p h ila z próbek środowiskowych poddaw anych obróbce wstępnej kwaśnym buforem donosi K usnetsov [10]. Z zanieczyszczonych p róbek wody potraktow anych buforem a u to r wyizolował do 2,2 x 105cfu/ml kom órek L egionella, podczas gdy z tych samych p róbek bez obróbki w stępnej odzysk Legionella był co najm niej dziesięciokrotnie niższy. A nalizując p rz e d staw ione wyniki b ad ań własnych jak również dan e z cytow anego piśm iennictw a, wydaje się , że najkorzystniejsze w arunki izolacji L egionella z p róbek wody o spodziew anym dużym zanieczyszczeniu m ożna uzyskać stosując 10 m inutowy czas kontaktu z kwaśnym buforem , natom iast przy spodziewanym mniejszym zanieczyszczeniu wystarczający m o że być 5 m inutowy czas kontaktu.
WNIOSKI
1. Próbki wody przeznaczone do badań, w kierunku wykrywania bakterii z rodzaju L egionella, w pierwszym etap ie powinny zostać p o d d an e działaniu kw aśnego buforu przez 10 m inut lub inkubacji w tem p eratu rze 50°C przez 30 m inut.
2. N ajkorzystniejszym w ariantem wykrywania i izolacji pałeczek Legionella ze śro dowiska w odnego m eto d ą filtracji m em branow ej jest zastosow anie filtrów z estrów celulozy lub fluorku poliwinylidenu i hodow la bakterii na filtrze um ieszczonym bez p o średnio na podłożu B C Y E z dodatkam i selektywnymi G V PC .
3. O b se rw a c je w zro stu L egionella należy p ro w a d zić c o d z ie n n ie p o m ię d zy 3 a 7 d n ie m hod o w li. K o lo n ie ro sn ą c e n a filtrac h m e m b ran o w y ch są błyszczące o g ład k ich b rze g ach , barw y k rem o w e j lub białej. N a filtrac h z flu o rk u p o liw in y lid en u w o k ó ł k o lo n ii m o ż n a z a o b se rw o w ać w y raźn ą s tre fę p rze jaśn ien ia .
R . M a t u s z e w s k a , B . K r o g u l s k a ,
D E TE C T IO N A ND ISOLATION O F BA CTERIA O F G ENU S L E G IO N E L L A FRO M W ATER EN V IR O N M EN T
Summary
The aim o f this work was to find method of isolation of bacteria of genus Legionella from water evironm ent. W ere used reference strains such as: L. pneumophila ATCC 33152, strains of bacteria contam inated w ater samples: E. coli ATCC 35218, S. aureus A TCC 12600, Str. faecalis ATCC 29212 and P. aeruginosa - strain from own colection, isolated from w ater environm ent. Because of the slow growth of bacteria of genus Legionella and dangers of contam ination the preliminary treatm ent of examined w ater samples should be done. W ater samples inoculated with standard strains of bacteria before inoculation by plated m em brane filtration or plated directly m ethods were undergone acid pretreatm ent (acid buffer pH 2,2) and heat pretreatm ent (temp. 50°C). The contact time used for studies was respectlively 10,20,30 min. and 30, 45 min. The best time used for acid treatm ent procedure was 10 min. , for heat treatm ent procedure was 30 min. Such adjust param eters of preliminary treatm ent o f w ater samples should reduce enough growth o f non-Legionella organisms and not to influence the growth of searched Legionella strains. The researches showed that the most succesfull of isolation is m em brane filtration m ethod, w here filters are directly placed on the culture medium. In studies buffered charcoal yeast extract agar medium with cysteine, activated charcoal and selective suplem ents were used. The growth of bacteria on the cellulose, polycarbonate and polyvinylidene fluoride filters were com pared. The best results were achieved with cellulose and polyvinylidene fluoride filters. Growth o f colonies o f bacteria on the filters should be examinated between 3rd and 7th days of incubation period at 37°C and 90% relative humidity. Legionella forming colonies growing on m em brane filters are shining with smooth edge, cream or white. On the polyvinyli dene fluoride filters around colonies clear zones are observed.
PIŚM IENNICTW O
1. Bergey’s M anual of Systematic Bacteriology Holt J.G. (Ed.) Williams and Wilkins Baltimore, Hong Kong, London, Sydney 1984 Vol 1, 279-288
2. Bopp C.A., Sum ner J.W., Morris G.K., Wells J.G.\ Isolation of Legionella spp.from environ m ental w ater samples by low-pH treatm ent and use of a selective medium. J.Clin.Microb. 1981, 4, 13, 714-719.
3. Boulanger C.A., Edelstein P.H. : Precision and accuracy of recovery of Legionella pneumophila from seeded tap water by filtration and centrifugation. Appl. Environ. Microb. 1995, 5, 61. 1805-1809.
4. Dennis P.J., Bartlett C.L.R., Wright A.E.: Comparison of isolation m ethods for Legionella spp. In Legionella. Proceedings of the 2nd International Symposium ed. Thornsberry, C. Balows, A. Feeley, J.C. and Jakubowski. 1984a. W ashington, DC: American Society for Microbiology. 5. Edelstein P.H.: Improved semiselective medium for isolation of Legionella pneumophila from
contam inated clinical and environm ental speciment. J. Clin. Microb. 1981, 9, 14, 298-303. 6. Edelstein H.\ Com parative study of selective m edia for isolation of Legionella pneumophila
7. Feeley J.C., Gibson R.J., Gorman G. W., Langford N.C., Rasheed K.J., Mackel D.C., Baine W.B.: Charcoal-Yeast Extrakt Agar: Primary isolation Medium for Legionella pneumophila. J. Clin. Microb. 1979, 10, 4, 437-441.
8. ISO/FDIS 11731:1998(E): W ater quality - Detection and enum aration o f Legionella. 9. ISO/CD 11731-2: 1998: W ater quality - Microbiological M ethods Detection and enum ara
tion of Legionella - Part 2: Detection in drinking w ater and treated bathing waters by m em brane filtration method.
10. Kusnetsov J.M., Jousimies-Somer H.R., Nevalainen A.I., Martikainen P.J.: Isolation of L e gionella from w ater samples using various culture methods. J. Appl. Bakter. 1994, 76,
155-162.
11. Lee J.V., West A.A.: Survival and growth of Legionella species in the environm ent. J. Appl. Bact. Symp. Suppl. 1991, 70, 1215-1219.
12. Magdzik W.: Choroby zakaźne i pasożytnicze. Zapobieganie i zwalczanie. Ed.II. Uniwersy teckie Wydawnictwo Medyczne. Kraków 1993,197-203.
13. Palmer C.J., Tsai Y.L., Paszko-Kolva С., Mayer С., Sangermano L .R : Detection o f Legionella species in sewage and ocean water by polymerase chain reaction, direct fluorescent-antibody, and plate culture methods. Appl. Environ. Microb. 1993, 11, 59, 3618-3624.
14. PN-77/C-04615/05. W oda i ścieki. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie bakterii grupy coli typu fekalnego m etodą fermentacyjna probówkową.
15. PN-77/C-04615/08. W oda i ścieki. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie bakterii grupy coli typu fekalnego m etodą filtrów membranowych.
16. Rogers J., Dowsett A.B., Dennis P.J., Lee J.V., Keevil С. W.: Influence of tem perature and plumbing m aterial selection on biofilm formation and growth of Legionella pneumophila in a model potable W ater system containing complex microbial flora. Appl. Environ. Microb. 1994, 60, 5, 1585-1592
17. Smith L., Carroll K , Motlice S.: Comparison o f m em brane filters for recovery of Legionellas. from w ater samles. Appl. Environ. Microb. 1993, 1, 59, 344-346.
18. Steele T.W., Lanser J., Sangster N .: Isolation of Legionella longbeachae serogroup 1 from potting mixes. Appl. Environ. Microb. 1990, 1, 56, 49-53.
19. Washington C., Winn Jr.: Legionella. Manual of Clinical Microbiology. Sixth ed. Ed. P.R. Murray. ASM PRESS W ashington, 1995, 533-544.
20. Yee R.B., Wadowsky R.M.: Multiplication of Legionella pneumophila in Unsterilized tap water. Appl. Environ. Microb. 1982, 43, 6, 1330-1334.
