55 (3): 275-279, 2015 Published online: 16.04.2015 ISSN 1427-4337
Received: 27.03.2014 / Accepted: 23.02.2015
Biological, biotechnological and chemical possibilities
in reducing of grey mould (Botrytis cinerea) severity on strawberries
Biologiczne, biotechniczne i chemiczne możliwości
ograniczania szarej pleśni truskawki (Botrytis cinerea)
Urszula Wachowska*, Justyna Borowska, Edyta Kwiatkowska, Elżbieta Kowalska
Summary
The objective of this study was to determine the efficacy of the Signum 33 WG (boscalid + piraclostrobin), Vaxiplant SL (laminarin) and a suspension of the yeast-like fungus Aureobasidium pullulans in controlling of the development of Botrytis cinerea on strawberry leaves, flowers and fruits. The experiments were carried out in vivo on strawberry leaves, under controlled conditions on flowering strawberry plants, and on a two-year plantation of strawberries cultivar Senga Sengana. Vaxiplant SL limited severity of grey mould on infested leaves and flowers, similarly as Signum 33 WG treatments and foliar application of A. pullulans suspension. On the strawberry plantation, all tested products didn’t show statistical differences in control of grey mould severity. The applied protective treatments had no also significant effect on the average marketable strawberry yield.
Key words: strawberry; biological control; yeasts; laminarin; Botrytis cinerea Streszczenie
Celem badań była ocena skuteczności preparatów Signum 33 WG (boskalid + piraklostrobina), Vaxiplant SL (laminaryna) oraz zawiesiny komórek grzyba Aureobasidium pullulans w ograniczeniu rozwoju Botrytis cinerea na liściach, kwiatach i owocach truskawki. Doświadczenia prowadzono w warunkach in vivo na liściach truskawki, na kwitnących roślinach truskawki w warunkach kontrolowanych oraz na dwuletniej plantacji truskawki odmiany Senga Sengana. Preparat Vaxiplant SL ograniczał powierzchnię porażenia liści i kwiatów przez grzyb B. cinerea, podobnie jak zabiegi ochronne wykonane fungicydem Signum 33 WG lub nalistnie zawiesiną komórek A. pullulans. Na plantacji truskawki odmiany Senga Sengana żaden z zastosowanych preparatów nie ograniczył istotnie nasilenia szarej pleśni. Zabiegi ochronne nie miały także istotnego wpływu na plonowanie truskawki.
Słowa kluczowe: truskawka; biologiczna ochrona; drożdże; laminaryna; Botrytis cinerea Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie
Katedra Fitopatologii i Entomologii Prawocheńskiego 17, 10-720 Olsztyn
*corresponding author: urszula.wachowska@uwm.edu.pl
The Polish Society of Plant Protection
The Institute of Plant Protection – National Research Institute The Committee of Plant Protection of the Polish Academy of Science
Biological and biotechnological control of B. cinerea / Biologiczne i biotechniczne zwalczanie B. cinerea
278
Wstęp / Introduction
Grzyb Botrytis cinerea Pers. Ex. Fr. poraża kwiaty truskawki prowadząc do ich zamierania, jak również owoce, czego następstwem są objawy typowej dla szarej pleśni zgnilizny widocznej w czasie ich dojrzewania, tran-sportowania i przechowywania (Helbig 2002). Jednym ze sposobów ochrony truskawek przed szarą pleśnią jest ochrona chemiczna. Jednak zbyt częste stosowanie fungi-cydów o podobnym mechanizmie działania może pro-wadzić do powstawania form odpornych tego patogenu (Diánez i wsp. 2002). Nowe uregulowania prawne (Dz.U. 2013, poz. 455) wskazujące na konieczność stosowania integrowanej ochrony roślin przez wszystkich profesjonal-nych użytkowników środków ochrony roślin oraz wzrasta-jące wymagania konsumentów, skłaniają do poszukiwania alternatywnych metod ochrony. Jedną z nich może być metoda biologiczna, w której wykorzystywane są np. droż-dże indukujące mechanizmy obronne roślin lub konku-rujące o przestrzeń i składniki odżywcze z patogenami (Ippolito i wsp. 2000; Castoria i wsp. 2001; Droby i wsp. 2002; Helbig 2002; Wang i wsp. 2009). Zwiększa się także zainteresowanie stymulatorami odporności roślin (Maty-siak i Adamczewski 2009). Jednym z nich jest preparat Vaxiplant SL zawierający laminarynę, wyciąg z listownicy palczastej (Laminaria digitala).
Celem badań była ocena skuteczności preparatów Signum 33 WG, Vaxiplant SL oraz zawiesiny komórek grzyba Aureobasidium pullulans w ograniczeniu rozwoju B. cinerea na liściach, kwiatach i owocach truskawki.
Materiały i metody / Materials and methods
Testowano wpływ temperatury na wzrost izolatu A. pu-llulans, pochodzącego z liści pszenicy ozimej, na podłożu glukozowo-ziemniaczanym. Celem badań było wyklucze-nie możliwości rozwoju tego izolatu w temperaturze ciała zwierząt stałocieplnych. Na pożywkę w płytkach Petriego nanoszono po 100l zawiesiny izolatu A. pullulans o gęs-tości 102 komórek w 1 cm3
wody. Po czterech dobach inkubacji w temperaturze 4, 14, 24 i 35°C liczono kolonie grzyba, a następnie dokonano transformacji danych zgod-nie ze wzorem log (liczba kolonii + 1).
Ocenę skuteczności A. pullulans oraz Vaxiplant SL w ograniczeniu nasilenia szarej pleśni przeprowadzono na liściach z roślin truskawki odmiany Senga Sengana. Końce liści (po 5 w każdej kombinacji) zanurzano w wodnej za-wiesinie grzyba A. pullulans o gęstości 106 komórek w 1 cm3 wody lub preparacie Vaxiplant SL o stężeniu roz-tworu 0,25%. Następnie liście umieszczono na wilgotnej bibule w szklanych płytkach Petriego o średnicy 9 cm, po 24, 38, 72 i 96 godzinach, na szczytach liści wyłożono 5 mm krążki podłoża glukozowo-ziemniaczanego przeroś-niętego 7-dniową grzybnią B. cinerea. Kombinację kon-trolną stanowiły liście zanurzone w sterylnej wodzie i ino-kulowane patogenem. Doświadczenie założono w pięciu powtórzeniach. Po siedmiu dobach inkubacji w ciemności, w temperaturze 24°C zmierzono powierzchnię liści i pow-stałych nekroz stosując program ImageJ 1.48p. Wyniki
przedstawiono jako procent powierzchni nekroz w sto-sunku do całej powierzchni liścia.
Określono również skuteczność izolatu A. pullulans oraz preparatów Vaxiplant SL i Signum 33 WG w ogra-niczeniu porażenia kwiatów truskawki przez B. cinerea. Do doniczek o średnicy 12 cm, wypełnionych ziemią ogrodniczą wymieszaną z piaskiem w proporcjach 1:1, wysadzono sadzonki truskawki odmiany Senga Sengana. Rośliny umieszczono w fitotronie i podlewano roztworem Hoeglanda. Rośliny rosły w warunkach 70–80% wilgot-ności względnej powietrza i temperaturze 23°C w dzień oraz 16°C w nocy, przy 12-godzinnym naświetlaniu w dzień. Po dwóch tygodniach kwiaty (po pięć na roślinie) zainokulowano zawiesiną B. cinerea o gęstości 104 w 1 cm3 zmytą z 7-dniowych kolonii. Inokulacja patoge-nem została przeprowadzona po 48 godzinach od zabiegu (Ap L) lub podlania (Ap S) roślin izolatem A. pullulans o gęstości 106
komórek w 1 cm3 wody, opryskania roślin preparatem Vaxiplant SL w stężeniu 0,25% lub fungicy-dem Signum 33 WG w stężeniu 0,36%. Kontrolę stanowiły rośliny nieopryskiwane. Ocenę stopnia porażenia kwiatów przeprowadzono po siedmiu dniach od momentu inokulacji patogenem, określając procent powierzchni porażonych kwiatów (wprowadzenie ich obrazów do pamięci kompu-tera) stosując program ImageJ 1.48p. Doświadczenie prze-prowadzono w trzech powtórzeniach.
W latach 2012 i 2013 oceniono wpływ zabiegów och-ronnych na plonowanie i zdrowotność roślin truskawki odmiany Senga Sengana posadzonych w sierpniu 2011 ro-ku w ogrodzie doświadczalnym Uniwersytetu Warmińsko- Mazurskiego w Olsztynie. Rośliny wysadzono w odstę-pach 90 cm, każde poletko stanowiły 4 rośliny. Rośliny opryskiwano 4-krotnie zapobiegawczo (Ap L) lub podle-wano (Ap S) zawiesiną izolatu A. pullulans o stężeniu 106
w 1 cm3, co 6–7 dni rozpoczynając od fazy początku kwitnienia roślin do dojrzewania owoców. Kombinację porównawczą stanowiły rośliny opryskiwane dwukrotnie w okresie kwitnienia środkiem Signum 33 WG (boskalid + piraklostrobina) w dawce 18 g/100 m2 oraz czterokrotnie preparatem Vaxiplant SL zastosowanym w dawce 15 g/100 m2. Kontrolę stanowiły rośliny nieopryskiwane. Doświadczenie założono w czterech powtórzeniach. Owo-ce truskawki zbierano trzykrotnie: 13 (I), 19 (II) i 24 (III) czerwca 2013 roku. Na wszystkich roślinach w kom-binacjach policzono i zważono owoce zdrowe oraz chore.
Uzyskane dane, dotyczące liczebności A. pullulans oznaczonej metodą hodowlaną transformowano loga-rytmicznie zgodnie ze wzorem log (jednostki tworzące kolonie + 1). Powierzchnię zmian chorobowych oszacowa-no analizując obrazy porażonych liści i kwiatów progra-mem ImageJ 1.48p. Skuteczność ochrony oszacowano wed-ług wzoru Abbotta (Abbott 1925). Analizę wariancji prze-prowadzono z wykorzystaniem programu STATISTICA v. 9.0. Test Duncana (p = 0,01) zastosowano dla określenia istotności różnic między plonowaniem roślin, liczebnością porażonych owoców oraz między średnim nasileniem objawów chorobowych na liściach i kwiatach (procent powierzchni nekroz liści i kwiatów w stosunku do całej powierzchni).
276 4
Wyniki i dyskusja / Results and discussion
Najbardziej intensywny wzrost izolatu A. pullulans zaobserwowano w temperaturze 24°C na podłożu gluko-zowo-ziemniaczanym (rys. 1). W temperaturze 4 i 35°C grzyb nie rozwijał się. W doświadczeniu na odciętych liściach preparat Vaxiplant SL istotnie ograniczył po-wierzchnię porażenia liści przez B. cinerea tylko w czasie 48 h między naniesieniem preparatu a inokulacją liści (tab. 1). Jego skuteczność wyniosła wówczas 36,5%. Natomiast w czasie 72 i 96 godzin, skuteczność środka Vaxiplant SL wyniosła odpowiednio 8,7 i 11,1% i nie różniła się istotnie od porażenia liści kontrolnych. Zastosowanie zawiesiny grzyba A. pullulans nie wpłynęło na ograniczenie porażenia liści przez B. cinerea (tab. 1).
W prezentowanych badaniach liście truskawki trakto-wane preparatem Vaxiplant SL wykazywały zdecydowanie silniejszą i szybszą reakcję obronną w porównaniu z dy-namiką reakcji obronnych wzbudzonych zawiesiną komórek izolatu A. pullulans. W czasie 48 godzin między naniesieniem tego preparatu na liście a inokulacją B. ci-nerea zanotowano istotnie mniejsze porażenie liści w po-równaniu do liści kontrolnych. Można wnioskować, że w liściach nastąpiło uruchomienie mechanizmów obron-nych. Laminaryna zawarta w preparacie Vaxiplant SL jest
polisacharydem, który wykazuje takie właściwości (Maty-siak i Adamczewski 2009). Antagonistyczny grzyb A. pullulans nie ograniczył porażenia liści. Natomiast Ippolito i wsp. (2000) wykazali wpływ A. pullulans na indukowanie odporności jabłoni, na co wskazywały ogra-niczone objawy porażenia jabłek przez B. cinerea i Peni-cillium expansum. Po 24 godzinach od zastosowania zawiesiny, w tkankach roślin wzrastała aktywność β-1,3-glukanazy, chitynazy i peroksydazy. W badaniach prowa-dzonych nad innymi czynnikami pełniącymi rolę anta-gonistów, np. Cryptococcus laurentii czy jasmonian metylu w zapobieganiu chorób przechowalniczych brzoskwini, już po 24 godzinach obserwowano wzrost aktywności β-1,3-glukanazy, peroksydazy oraz amonia-koliazy fenyloalaniny w temperaturze 25°C (Yao i Tian 2005).
Zastosowanie preparatu Vaxiplant SL na kwitnące rośliny w fitotronie ograniczyło o 47,5% porażenie kwiatów w porównaniu z kombinacją kontrolną (Bc), inokulowaną B. cinerea (rys. 2). Podobny efekt uzyskano również po zabiegach wykonanych fungicydem Signum 33 WG lub nalistnie zawiesiną A. pullulans. Natomiast po zastosowaniu zawiesiny A. pullulans doglebowo, obser-wowano więcej porażonych kwiatów niż w kombinacji kontrolnej (rys. 2).
Tabela 1. Porażenie blaszki liściowej truskawki (procent powierzchni liścia) Table 1. Infection of strawberry leaf (percentage of leaf area)
Zabiegi Treatments
Czas (godziny) od naniesienia preparatów do inokulacji liści Time (hours) since product application to leaf inoculation
24 48 72 96
Kontrola – Control 74,0 b 93,4 a 86,9 ab 82,8 ab
Aureobasidium pullulans 90,3 ab 94,5 a 84,6 ab 95,8 ab
Vaxiplant SL 83,5 ab 60,2 b 79,4 ab 68,7 ab
Jednakowymi literami oznaczono wartości nieróżniące się istotnie według testu Duncana (p = 0,01) Values determined identical letters do not differ significantly according to the Duncan test (p = 0.01)
Tabela 2. Wpływ różnych metod ochrony na plonowanie truskawek
Table 2. Effect of different methods of protection on the yield of strawberries
Zabiegi Treatments
Masa zdrowych owoców z rośliny w gramach Weight of healthy fruits per plant in grams
Procent owoców zdrowych z rośliny Percent of healthy fruit per plant
I II III średnio average I–III I II III średnio average I–III C 191,7 ab 182,5 ab 137,3 ab 170,5 A 90,9 ab 93,7 ab 91,9 ab 92,1 A Ap (S) 230,4 a 250,0 a 74,5 bc 185,0 A 93,6 ab 96,0 ab 89,3 ab 93,4 A Ap (L) 244,4 a 226,0 a 205,5 a 225,3 A 91,9 ab 96,0 ab 90,5 ab 92,1 A Sig 171,7 ab 170,2 ab 151,2 abc 164,3 A 91,8 b 97,3 b 91,3 ab 92,8A Vax 170,3 ab 159,0 abc 51,7 c 127,0 A 93,4 ab 95,5 ab 86,4 b 91,1 A Średnio
Average 200,2 B 194,76B 126,6 A 92,3 B 95,6 B 90,3A
Wyjaśnienia jak w tabeli 1. – Explanations as in Table 1
C – kontrola – control; Ap (S) – Aureobasidium pullulans (doglebowo soil); Aureobasidium pullulans (liść leaves); Sig Signum 33 WG; Vax Vaxiplant SL
I, II, III terminy zbiorów harvest dates
277 4
Biological and biotechnological control of B. cinerea / Biologiczne i biotechniczne zwalczanie B. cinerea
278
Tabela 3. Procent owoców truskawki porażonych przez Botrytis cinerea Table 3. Percent of strawberry fruit infected with Botrytis cinerea
Zabiegi – Treatments
Termin zbioru owoców – Harvest fruit date
I II III średnio average I–III C 9,1 ab 6,3 ab 8,1 ab 7,9 A Ap (S) 6,4 ab 4,0 ab 10,7 ab 6,6 A Ap (L) 8,1 ab 4,0 b 9,5 a 7,9 A Sig 8,2 ab 2,7 b 8,7 ab 7,2 A Vax 6,6 ab 4,5 b 13,6 ab 8,9 A Średnio – Average 7,7 B 4,4 B 9,7 A –
Wyjaśnienia jak w tabeli 2. – Explanations as in Table 2
Rys. 1. Rozwój Aureobasidium pullulans w różnych tempera-turach na podłożu glukozowo-ziemniacznym
Fig. 1. Development of Aureobasidium pullulans at different temperatures on the PDA medium
W badaniach polowych wykazano, że żaden z zastoso-wanych preparatów nie wpłynął istotnie na zwiększenie plonowania roślin truskawek (tab. 2). Także liczba zdro-wych owoców była podobna do tych z roślin kontrolnych (tab. 2). Nie stwierdzono istotnie mniejszej liczby porażonych owoców po zastosowaniu środków Signum 33 WG i Vaxiplant SL oraz zwiesiny A. pullulans (tab. 3). Jedynie w czasie I i II zbioru porażenie owoców na roś-linach chronionych badanymi preparatami było nieznacz-nie mnieznacz-niejsze niż na kontrolnych. W przedstawionych ba-daniach skuteczność nalistnej aplikacji zawiesiny A. pullu-lans była większa w ograniczeniu porażenia kwiatów niż liści. Można przypuszczać, że w tym przypadku dominu jącym mechanizmem działania antagonisty była konku-
C – kontrola (nieinokulowana) – control (not inoculated); Bc – kontrola inokulowana przez Botrytis cinerea – control inoculated by Botrytis cinerea; Ap (S) – Aureobasidium pullulans (doglebowo – soil); Ap (L) – Aureobasi-dium pullulans (liście – leaves); Sig – Signum 33 WG; Vax – Vaxiplant SL
Rys. 2. Procent zainfekowanej powierzchni kwiatów Fig. 2. The percentage of infected area of flowers
rencja o składniki odżywcze z B. cinerea, czego dowiodły także wcześniejsze badania (Castoria i wsp. 2001; Elad i Stewar 2007).
Wnioski / Conclusions
1. Signum 33 WG, Vaxiplant SL oraz grzyb A. pullulans stosowany dolistnie ograniczyły porażenie kwiatów truskawki przez B. cinerea.
2. Vaxiplant SL ograniczał również porażenie liści przez B. cinerea.
3. Żaden z zastosowanych preparatów nie ograniczył istotnie porażenia owoców truskawki i nie zwiększył plonowania roślin.
Literatura / References
Abbott W.S. 1925. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology 18: 265–267.
Castoria R., de Curtis F., Lima G., Caputo L., Pacifico S., de Cicco V. 2001. Aureobasidium pullulans (LS-30) an antagonist of postharvest pathogens of fruits: study on its modes of action. Postharvest Biology and Technology 22: 7–17.
Diánez F., Santos M., Blanco R., Tello J.C. 2002. Fungicide resistance in Botrytis cinerea isolates from strawberry crops in Huelva (Soutwestern Spain). Phytoparasitica 30 (5): 529–534.
DrobyS.,VinokurV.,WeissB.,CohenL.,DausA.,GoldschmidtE.E.,PoratR. 2002. Induction of resistance to Penicillium digitatum in grapefruit by the yeast biocontrol agent Candida oleophila. Phythopathology 92 (4): 393–399.
Dz.U. 2013, poz. 455. Ustawa z dnia 8 marca 2013 r. o środkach ochrony roślin. Dyrektywa 2009/128 WE.
Elad Y., Stewar A. 2007. Microbial control of Botrytis spp. p. 223–241. In: ”Botrytis: Biology, Pathology and Control” (Y. Elad, B. Williamson, P. Tudzynski, F. Delen, eds.). Springer, 393 pp.
Helbig J. 2002. Ability of the antagonistic yeast Cryptococcus albidus to control Botrytis cinerea in strawberry. BioControl 47: 85–99. Ippolito A.,El GhaouthA.,WilsonC.L.,WisniewskiM. 2000. Control of postharvest decay of apple fruit by Aureobasidium pullulans
and induction of defense responses. Postharvest Biology and Technology 19: 265–272.
Matysiak K., Adamczewski K. 2009. Regulatory wzrostu i rozwoju roślin – kierunki badań w Polsce i na świecie. [Plant growth regulators application – studies in Poland and in the world]. Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 49 (4): 1810–1816.
Wang W., Chi Z., Liu G., Buzdar M.A., Chi Z., Gu Q. 2009. Chemical and biological characterization of siderophore produced by the marine-derived Aureobasidium pullulans HN6.2 and its antibacterial activity. Biometals 22 (6): 965–972.
Yao H.J., Tian S.P. 2005. Effects of a biocontrol agent and methyl jasmonate on postharvest diseases of peach fruit and the possible mechanisms involved. Journal of Applied Microbiology 98: 941–950.
279 4
