Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 62 (2), 201-203, 2006

Medycyna Wet. 2006, 62 (2) 201

Praca oryginalna Original paper

Anaplazmoza granulocytarna to zoonoza odklesz-czowa, której czynnikiem etiologicznym jest Anaplas-ma phagocytophilum. Jest to Gram-ujemna bakteria bêd¹ca bezwzglêdnym paso¿ytem wewn¹trzkomórko-wym (5). A. phagocytophilum wystêpuje powszech-nie w Europie i Ameryce Pó³nocnej. Liczne badania prowadzone na kontynencie amerykañskim wykaza³y, ¿e wektorem patogenu na tym terenie s¹ kleszcze z ga-tunków Ixodes scapularis i I. pacificus, a rezerwuarem – leœne gryzonie oraz prze¿uwacze (3). Rozwa¿a siê równie¿ udzia³ ptaków w utrzymywaniu A. phagocy-tophilum w œrodowisku (8). W Europie g³ównym wek-torem tego gatunku jest kleszcz pospolity I. ricinus (5, 16), jednak nadal ma³o jest danych dotycz¹cych rezer-wuaru anaplazmy. Badania prowadzone w Wielkiej Brytanii (6) oraz Szwajcarii (12) wykaza³y obecnoœæ DNA A. phagocytophilum u nornicy rudej (Clethrio-nomys glareolus), myszy zaroœlowej (Apodemus syl-vaticus), myszy leœnej (A. flavicollis), darniówki po-spolitej (Pitymys subterraneus) oraz u owado¿ernej ryjówki aksamitnej (Sorex araneus). Badania prowa-dzone w Wielkiej Brytanii (1) wskazuj¹, ¿e sarna (Ca-preolus ca(Ca-preolus) jest wa¿nym naturalnym rezerwu-arem dla A. phagocytophilum na terenie tego kraju. W Norwegii wykryto obecnoœæ przeciwcia³ przeciw-ko A. phagocytophilum u saren, jeleni (Cervus elaphus) i ³osi (Alces alces) (20). W S³owenii stwierdzono

obec-noœæ DNA A. phagocytophilum w izolatach z krwi i tkanek jeleni, saren oraz dzików (10, 15).

Celem badañ by³o okreœlenie roli sarny jako rezer-wuaru A. phagocytophilum oraz kleszcza pospolitego jako wektora tego patogenu na terenie województwa zachodniopomorskiego.

Materia³ i metody

W okresie od maja do czerwca 2004 r. oraz od wrzeœnia do grudnia 2004 r. pobrano próbki krwi (w objêtoœci 1 cm3₎ od 127 saren. Krew by³a pobierana do probówek zawiera-j¹cych 100 µl Na-EDTA. W okresie wiosennym (maj i czer-wiec 2004) odstrzelono 63 osobniki, a w okresie jesien-nym (od wrzeœnia 2004 do grudnia 2004) – 64. Zwierzêta pochodzi³y z terenów leœnych okolic miasta Szczecina, endemicznych dla A. phagocytophilum. Z od³owionych zwierz¹t zebrano ¿eruj¹ce na nich kleszcze, ³¹cznie 170 osobników I. ricinus.

DNA z próbek krwi izolowano gotowym zestawem MasterPureTM _{DNA Purification Kit (Epicentre, USA)} we-d³ug za³¹czonej instrukcji. Do izolacji DNA ca³kowitego z kleszczy zastosowano metodê amoniakaln¹ (9).

Do wykrycia obecnoœci DNA A. phagocytophilum w uzyskanych izolatach zastosowano metodê PCR. U¿yto zestawu starterów msp2-3f/msp2-3r, umo¿liwiaj¹cych am-plifikacjê fragmentu genu msp2 o d³ugoœci 334 pz (13). Jako próby dodatniej u¿yto DNA A. phagocytophilum

uzys-DNA Anaplasma phagocytophilum we krwi saren

oraz w pozyskanych z nich kleszczach

MA£GORZATA ADAMSKA

Katedra Genetyki Wydzia³u Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Szczeciñskiego, al. Piastów 40B, 71-065 Szczecin Adamska M.

Detecting Anaplasma phagocytophilum DNA in blood of roe deer and in ticks

Summary

The aim of the study was to establish the role of roe deer (Capreolus capreolus) as reservoirs of Anaplasma phagocytophilum and the role of Ixodes ricinus ticks as vectors of this pathogen in North–West Poland. Blood samples of 127 roe deer were collected between May and June 2004 and between September and December 2004. 51 of the 63 roe deer caught between May and June 2004 and 7 of the 64 roe deer caught between September and December 2004 were infested by I. ricinus ticks. 170 individuals of the common tick were collected from 45.7% of roe deer. PCR amplification of a fragment of the msp2 gene was used for detecting A. phagocytophilum DNA. Pathogen DNA was detected in 30 of the blood samples (23.6%) and in 10 ticks collected from the animals (5.9%). 28.6% of the roe deer caught between May and June 2004 and 18.75% of the roe deer caught between September and December 2004 were infected, but this difference was not significant. 5.3% of I. racinus ticks were infected by A. phagocytophilum. It is clear that C. capreolus is a significant reservoir of A. phagocytophilum in North–West Poland. In addition, I. ricinus is a significant vector in this area.

Medycyna Wet. 2006, 62 (2) 202

kanego z hodowli na komórkach HL60, MRL Diagnostics (19). Profil czasowo-temperaturowy PCR obejmowa³: de-naturacjê wstêpn¹ w 94°C – 2 minuty; 8 cykli: denaturacja w³aœciwa 94°C – 30 sekund, przy³¹czanie starterów 62°C – 56°C (spadek temperatury o 2°C co 2 cykle) – 45 sekund, elongacja 72°C – 30 sekund; 28 cykli: denaturacja w³aœci-wa 94°C – 30 sekund, przy³¹czanie starterów 54°C – 45 sekund, elongacja 72°C – 30 sekund oraz wyd³u¿anie koñ-cowe 72°C – 5 minut. Polimeraza i bufor u¿yte do reakcji pochodzi³y z firmy Qiagen (Germany). Nukleotydy wypro-dukowa³a firma Polgen S.C. (Polska), a startery – firma Bionovo (Polska). Uzyskane produkty poddano elektrofo-rezie w 2,5% ¿elu agarozowym wybarwionym bromkiem etydyny.

Analizy statystycznej porównañ czêstoœci wystêpowa-nia DNA A. phagocytophilum w izolatach z krwi C. capre-olus od³owionych w dwóch kolejnych sezonach dokonano stosuj¹c nieparametryczny test istotnoœci chi kwadrat (c2_, 14).

Wyniki i omówienie

Wœród 170 zebranych I. ricinus wiêkszoœæ stano-wi³y samice (144/84,7%); 137 z nich (95,1%) by³o opitych krwi¹. Z jednego osobnika zbierano od 1 do 8 kleszczy. Z przeprowadzonej analizy statystycznej stopnia zaka¿enia C. capreolus przez A. phagocyto-philum wynika, ¿e ró¿nice w stopniu zaka¿enia w dwóch kolejnych sezonach by³y nieistotne statystycz-nie. W izolatach z kleszczy DNA anaplazmy wykryto u 8 samic i 1 samca zebranych w okresie wiosennym, oraz u jednej samicy z okresu jesiennego. Wszystkie PCR+ samice by³y opite krwi¹; tylko jeden osobnik PCR+ (samica zebrana wiosn¹) zosta³ zdjêty z sarny, w której krwi nie stwierdzono obecnoœci DNA pato-genu. Wyniki zbioru kleszczy ze zwierz¹t oraz wyniki PCR przedstawia tab. 1.

Zagro¿enie ludnoœci chorobami odkleszczowymi w ostatnich latach gwa³townie wzros³o, gdy¿ zmiany klimatyczne ostatnich kilku lat sprzyja³y rozwojowi kleszczy oraz rozpowszechni³a siê forma rekreacji zwi¹zana z obszarami leœnymi. Jedn¹ z zoonoz od-kleszczowych jest ludzka anaplazmoza granulocytar-na, wywo³ywana przez A. phagocytophilum. W Euro-pie rolê wektora tego patogenu spe³nia I. ricinus (kleszcz pospolity). Zbadanie rezerwuaru A. phagocy-tophilum pozwoli na dok³adniejsze poznanie ekologii tego patogenu, a tak¿e na okreœlenie ryzyka zaka¿enia anaplazm¹ ludzi przebywaj¹cych na terenach bytowa-nia kleszczy. Ryzyko zaka¿ebytowa-nia cz³owieka zale¿y bo-wiem od wystêpowania na danym terenie nie tylko

za-ka¿onych kleszczy, ale tak¿e poœrednio od ich ¿ywi-cieli utrzymuj¹cych kr¹¿enie patogenów w œrodowis-ku. Istniej¹ tak¿e doniesienia o zaka¿eniach patoge-nami przenoszonymi przez kleszcze ludzi, którzy nie zauwa¿yli kleszcza na swoim ciele, a mieli kontakt z zaka¿on¹ krwi¹ zwierz¹t ³ownych (7). Leœnicy, myœ-liwi i pracownicy punktów skupu dziczyzny s¹ wiêc grup¹ szczególnie nara¿on¹ na zaka¿enie patogenami, których wektorem s¹ kleszcze, nie tylko ze wzglêdu na wysokie ryzyko kontaktu z kleszczami, ale tak¿e ze wzglêdu na stycznoœæ z materia³em zakaŸnym, ja-kim jest krew zwierz¹t bêd¹cych rezerwuarem tych pa-togenów.

Prze¿uwacze wydaj¹ siê grup¹ zwierz¹t, która pe³ni najwa¿niejsz¹ rolê jako rezerwuar A. phagocytophi-lum. Wprawdzie liczne badania wykaza³y obecnoœæ tego patogenu u ró¿nych gatunków gryzoni, jednak¿e prawdopodobnie nie s¹ one w stanie utrzymaæ ana-plazmy w œrodowisku ze wzglêdu na stosunkowo ma³¹ efektywnoœæ transmisji (11). Badania prowadzone w Wielkiej Brytanii (6) wykaza³y sezonowoœæ zaka-¿eñ u C. glareolus i A. sylvaticus. Obecnoœci A. pha-gocytophilum nie stwierdzono u osobników od³awia-nych w okresie od stycznia do kwietnia, natomiast naj-wy¿szy poziom zaka¿enia mia³ miejsce póŸnym latem i jesieni¹. Wyniki te wskazuj¹ na krótkotrwa³¹ bakte-riemiê szacowan¹ zaledwie na kilka tygodni. Stosun-kowo ma³o jest poznany rezerwuar ptasi dla A. phago-cytophilum. Alekseev i wsp. (2) wykryli obecnoœæ A. phagocytophilum w kleszczach I. ricinus zebranych z 5 gatunków wróblowatych od³owionych w okolicach Kaliningradu; podobne badania prowadzili w Szwecji Bjöersdorff i wsp. (4). Ostatnie badania gryzoni A. fla-vicollis oraz 9 ró¿nych gatunków ptaków leœnych od³o-wionych na terenie Wielkopolskiego Parku Narodo-wego, przeprowadzone przez zespó³ Katedry Genetyki US, nie wykaza³y obecnoœci DNA A. phagocytophi-lum we krwi tych zwierz¹t, aczkolwiek wykryto jego obecnoœæ w kleszczach zebranych zarówno z gryzoni i ptaków, jak i z roœlinnoœci na terenach ich od³owu (17, 18). Stwierdzone zaka¿enie kleszczy musia³o wiêc pochodziæ od innej grupy ¿ywicieli ni¿ badane zwie-rzêta, byæ mo¿e w³aœnie od prze¿uwaczy.

Poziom zaka¿enia A. phagocytophilum saren od-strzelonych na terenach leœnych okolic Szczecina (23,6%) sugeruje, ¿e zwierzêta te s¹ naturalnym re-zerwuarem tego patogenu, co zosta³o ju¿ potwierdzo-ne przez innych autorów (1, 10, 15, 20). Podobnie jak w przypadku gryzoni (6) wystêpowa³a wyraŸna sezo-nowoœæ zaka¿enia. Jednak¿e w przy-padku saren po-ziom zaka¿enia by³ wy¿szy w okresie w i o s e n n y m (28,6%) ni¿ jesien-nym (17,75%). Ró¿nica zaka¿eñ n o z e S u w o ³ d o Licszabraen(%) zakaL¿iocznbyach(%sa)ren infestLoiwczabnayc(%h)saren Lzicezbbraan(y%c)hz.Isiracriennus zaka¿Loincyzcbha(.I%ir)cinus a n s o i W 63(49,6) 18(28,60) 51(80,90) 155(91,2) 19(5,80) ñ e i s e J 64(50,4) 12(18,75) 17(10,90) 15(8,8) 11(0,64) m e z a R 127(100) 30(23,60) 58(45,70) 170(100) 10(5,30)

Tab. 1. Liczba i procent (%) od³owionych i zaka¿onych oraz infestowanych przez kleszcze saren oraz infestuj¹cych i zaka¿onych kleszczy I. ricinus wiosn¹ i zim¹

Medycyna Wet. 2006, 62 (2) 203

by³a ni¿sza ni¿ u gryzoni, a test chi kwadrat wykaza³, ¿e jest ona nieistotna. U saren okres bakteriemii jest wiêc d³u¿szy ni¿ u gryzoni, a co za tym idzie, s¹ one zdolne do zaka¿enia anaplazm¹ ¿eruj¹cych na nich kleszczy przez znacznie d³u¿szy czas. Wynika z tego, ¿e sarny s¹ lepszym ni¿ gryzonie rezerwuarem dla A. phagocytophilum. Du¿a iloœæ zwierz¹t na których ¿erowa³y kleszcze, odstrzelonych wiosn¹, kiedy poziom zaka¿enia jest najwy¿szy, zwiêksza szansê zaka¿enia kleszczy tym patogenem. Wprawdzie wœród 48 kleszczy ¿eruj¹cych na 16 zaka¿onych sarnach wykryto zaka¿enie anaplazm¹ jedynie u 9 osobników zebranych z 5 zwierz¹t, jednak¿e pozosta³e osobniki mog³y ¿erowaæ zbyt krótko, aby dosz³o do ich zaka¿e-nia. Obecnoœæ DNA A. phagocytophilum w kleszczu ¿eruj¹cym na sarnie nie zaka¿onej tym patogenem œwiadczy o tym, ¿e jego zaka¿enie nast¹pi³o podczas ¿erowania na innym ¿ywicielu, a w przypadku d³u¿-szego ¿erowania na sarnie mog³oby dojœæ do jej zaka-¿enia. Planowana jest kontynuacja badañ przez kolej-ny sezon w celu stwierdzenia, czy zaka¿enie saren utrzymuje siê na sta³ym poziomie, czy te¿ ulega wa-haniom w kolejnych latach.

Piœmniennictwo

1.Alberdi M. P., Walker A. R., Urquhart K. A.: Field evidence that roe deer (Capreolus capreolus) are a natural host for Ehrlichia phagocytophila. Epi-demiol. Infect. 2000, 124, 315-323.

2.Alekseev A. N., Dubinina H. V., van de Pol I., Schouls L. M.: Identification of Ehrlichia spp. and Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks in the Baltic regions of Russia. J. Clin. Microbiol. 2001, 39, 2237-2242.

3.Bakken J. S., Dumler J. S.: Human granulocytic ehrlichiosis. Clin. Infect. Dis. 2000, 31, 554-560.

4.Bjöersdorff A., Bergstrom S., Massung R. F., Haeming P. D., Olsen B.: Ehrlichia-infected ticks on migrating birds. Emerg. Infect. Dis. 2001, 7, 877--879.

5.Blanco J. R., Oteo J. A.: Human granulocytic ehrlichiosis in Europe. Clin. Microbiol. Infect. 2002, 8, 763-772.

6.Bown K. J., Begon M., Bennett M., Woldehlwet Z., Ogden N. H.: Seasonal dynamics of Anaplasma phagocytophila in rodent-tick (Ixodes trianguliceps) system, United Kingdom. Emerg. Infect. Dis. 2003, 9, 63-70.

7.Comer J. A., Nicholson W. I., Sumner J. W., Olson J. G., Childs J. E.: Diag-nosis of human ehrlichiosis by PCR assay acute-phase serum. J. Clin. Micro-biol. 1999, 37, 31-34.

8.Daniels T. J., Battaly G. R., Liveris D., Falco R. C., Schwartz I.: Avian reser-voirs of the agent of human granulocytic ehrlichiosis? Emerg. Infect. Dis. 2002, 8, 1524-1525.

9.Guy E. C., Stanek G.: Detection of Borrelia burgdorferi in patient with Lyme disease by the polymerase chain reaction. J. Clin. Pathol. 1991, 44, 610-611. 10.Hulinska D., Votypka J., Plch J., Vlcek E., Valesova M., Bojar M., Hulinsky V., Smetana K.: Molecular and microscopial evidence of Ehrlichia spp. and Bor-relia burgdorferi sensu lato in patients, animals and ticks in the Czech Repu-blic. New Microbiol. 2002, 5, 437-448.

11.Levin M. L., des Vignes F., Fish D.: Disparity in the natural cycles of Borrelia burgdorferi and the agent of human granulocytic ehrlichiosis. Emerg. Infect. Dis. 1999, 5, 204-208.

12.Liz J. S., Anderes L., Sumner J. W., Massung R. F., Gern L., Rutti B., Bros-sard M.: PCR detection of granulocytic Ehrlichiae in Ixodes ricinus ticks and wild small mammals in Western Switzerland. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 1002-1007.

13.Massung R. F., Slater K.: Comparision of PCR assays for detection of the agent of human granulocytic ehrlichiosis, Anaplasma phagocytophilum. J. Clin. Microbiol. 2003, 41, 717-722.

14.Mikulski T.: Statystyka medyczna. PAM, Szczecin 1994, 94-95.

15.Petrovec M., Bidovec A., Sumner J. W., Nicholson W. L., Childs J. E., Avsinc--Zupanc T.: Infection with Anaplasma phagocytophila in cervids from Slo-venia: evidence of two genotypic lineages. Wien. Klin. Wochenschr. 2002, 114, 641-647.

16.Skotarczak B., Rymaszewska A.: Wstêpne badania czynnika etiologicznego ludzkiej ehrlichiozy (HGE) w kleszczach z zachodniopó³nocnej Polski. Wiad. Parazytol. 2001, 47, 95-101.

17.Skotarczak B., Rymaszewska A., Sawczuk M., Adamska M., Suproñ M., Jerszyñska-Mazur J.: PCR detection of granulocytic Anaplasma and Babe-sia in Ixodes ricinus ticks and yellow-necked mice (Apodemus flavicollis) in West-Central Poland. A Parazytol, in press.

18.Skotarczak B., Rymaszewska A., Wodecka B., Sawczuk M., Adamska M., Suproñ M., Maciejewska A.: PCR detection of granulocytic Anaplasma and Babesia in Ixodes ricinus ticks and birds in West-Central Poland. Ann. Agric. Environ. Med, in press.

19.Stañczak J., Racewicz M., Kruminis-£ozowska W., Kubica-Biernat B.: Coin-fection of Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae) in northern Poland with the agents of Lyme borreliosis (LB) and human granulocytic ehrliosis (HGE). Int. J. Med. Microbiol. 2002, 33, 198-201.

20.Stuen S., Akerstedt J. K., Bergström K., Handeland K.: Antibodies to granu-locytic Ehrlichia in moose, red deer, and roe deer in Norway. J. Wildl. Dis. 2002, 38, 1-6.

Adres autora: mgr Ma³gorzata Adamska, al. Piastów 40B, 71-065 Szczecin; e-mail: adamska@univ.szczecin.pl