Praca oryginalna Original paper
Transplantacje s¹ obecnie rutynow¹ metod¹ w le-czeniu zaawansowanej niewydolnoci nerek u ludzi. Najwiêkszym problemem wspó³czesnej transplanto-logii medycznej jest brak narz¹dów do przeszczepów. Rozwi¹zaniem problemu bêd¹ w przysz³oci najpraw-dopodobniej przeszczepy obcogatunkowe, czyli hete-ro- lub ksenoprzeszczepy. Pierwsz¹ próbê transplan-tacji heterogenicznej wykona³ Emerich Ulmann, w 1902 r., przeszczepiaj¹c nerkê psa chorej w schy³-kowym stadium niewydolnoci nerek (8). Obecnie w 20 orodkach na wiecie prowadzone s¹ bardzo in-tensywne badania w tym zakresie (3). Mimo widocz-nych osi¹gniêæ i perspektyw ksenotransplantacji ist-niej¹ bardzo liczne, istotne problemy. Obejmuj¹ one aspekty kliniczne, odpowied immunologiczn¹ bior-cy na przeszczep, ryzyko infekcji i przenoszenia cho-rób zakanych od zwierz¹t oraz w¹tpliwoci etyczne. Najistotniejsze wydaj¹ siê ró¿nice miêdzygatunko-we. Odrzucanie przeszczepu obcogatunkowego nastê-puje w reakcji humoralnej przez naturalne przeciw-cia³a skierowane swoicie przeciwko epitopom galak-tozy-a1-3galaktozy (a Gal). Przeciwcia³a anty-a-gal powstaj¹ w pierwszych kilku tygodniach ¿ycia w na-turalnej odpowiedzi na kolonizacjê uk³adu pokarmo-wego przez mikroorganizmy, wykazuj¹ce ekspresjê struktur a-gal na b³onach komórkowych (9). Epitopy
(a Gal) wystêpuj¹ na powierzchni ródb³onka naczyñ u wiêkszoci gatunków z wyj¹tkiem ludzi, ma³p cz³e-kokszta³tnych i ma³p starego wiata (10). Wbudowa-ne s¹ w struktury komórkowych glikolipidów i gliko-protein (23). Powstaj¹ce przeciwcia³a skierowane prze-ciwko epitopom a Gal nale¿¹ do grup IgM, IgG i IgA (4). Na skutek wysokiego miana przeciwcia³ odrzuce-nie przeszczepu obcogatunkowego w nadostrej reak-cji odrzucania (Hyperacute Reaction HAR) rozpoczy-na siê w ci¹gu zaledwie kilkurozpoczy-nastu-kilkudziesiêciu minut, na drodze klasycznej aktywacji uk³adu dope³-niacza (3, 12). Gdy nie dojdzie do nadostrej reakcji, transplant mo¿e zostaæ odrzucony w ci¹gu kilku dni na drodze ostrego odrzucania naczyniowego (Acute Vascular Reaction AVR), w mieszanej odpowiedzi immunologicznej (22), trzeci¹ drog¹ odrzucenia prze-szczepu jest odpowied komórkowa, w której bior¹ udzia³ limfocyty NK, CD4+, CD8, makrofagi (11, 20). Celem badañ by³o okrelenie mo¿liwoci wykorzys-tania nerek transgenicznych wiñ do przeszczepów allogenicznych i heterogenicznych w aspekcie klinicz-nym z uwzglêdnieniem metodyki chirurgicznej. Ba-dania mia³y na celu opracowanie techniki przeszcze-piania nerek i okrelenie odpowiedzi immunologicz-nej biorczyñ na przeszczepion¹ nerkê. Niniejsza pub-likacja jest pierwsz¹ w Polsce dotycz¹c¹ tego tematu.
Wykorzystanie nerek transgenicznych wiñ
do przeszczepów allogenicznych i ksenogenicznych
JERZY SKUCIÑSKI, WOJCIECH NOWAK, JAROS£AW WIECZOREK*, RAFA£ SOLECKI I Katedra Chirurgii Ogólnej Collegium Medicum UJ, ul. Kopernika 40, 31-501 Kraków
*Dzia³ Biotechnologii Rozrodu Zwierz¹t Instytut Zootechniki w Balicach, ul. Krakowska 1, 32-883 Balice k. Krakowa
Skuciñski J., Nowak W., Wieczorek J., Solecki R.
Use of kidney transgenic pigs to allogenic and xenogenic transplantation Summary
In the conducted study the possibility of using the transgenic pig kidneys for allogenic and heterogenic transplantation was evaluated with regards to the clinical context. There were 3 nontransgenic and 6 transgenic pig donors with a human a1.3-fukosylotransferase gene. The recipient of the kidneys were 6 nontransgenic and 3 transgenic pigs. The kidneys were heterotopic transplantated to intraperitoneal space. The kidney was transplanted to the left side at the level of 4-5 lumbar vertebra with end-to-side anastomosis of the renal vein and artery with vena cava caudale and aorta, respectively. The proposed surgical model of homological transplantation of kidneys in pigs allows for rapid organ collection without disturbing the structure, with continuous and tight vessel. The immunological response on the base of the changed levels of IL-1, IL-4 IL-6 IL-10 TNF-a and INF-g in the serum were investigated. The acute immunological rejection of the graft was found on cell and humoral bases. There was a weaker immunological response after the transplantation of transgenic kidneys in comparison to nontransgenic ograns. Transgenesis has a positive effect on the immuno-logical response.
Materia³ i metody
Przeszczepianie nerek. W dowiadczeniu wykorzystano 9 transgenicznych i 9 nietransgenicznych loszek w wieku ok. 6 miesiêcy, masie cia³a 40-55 kg, bez widocznych objawów chorobowych. Zwierzêta podzielono na 3 grupy po 6 zwie-rz¹t w ka¿dej wed³ug uk³adu podanego w tab. 1.
Dodatkow¹ grupê stanowi³o 5 zwierz¹t nietransgenicznych trzymanych w warunkach hodowlanych przez ca³y czas trwa-nia dowiadczetrwa-nia. Taki uk³ad dowiadczetrwa-nia pozwala³ na ocenê reakcji operowanych zwierz¹t oraz porównanie miê-dzy zwierzêtami transgenicznymi i nietransgenicznymi.
Pobranie, perfuzjê i kwalifikacjê do przeszczepu pobranych nerek przeprowadzono wed³ug wczeniej opisanego schema-tu (19). Nerkê przed przeszczepieniem umieszczono w elas-tycznym opatrunku zapewniaj¹cym mo¿liwoæ swobodnego i bezurazowego manipulowania z zachowaniem sta³ej tempe-ratury 4°C do momentu zakoñczenia zespolenia naczyniowe-go i zwolnienia klemów naczyniowych.
Przygotowanie biorców do zabiegu, premedykacja, induk-cja i prowadzenie znieczulenia by³y analogiczne jak podczas operacji pobrania nerek (19). W trakcie zabiegu prowadzono ci¹g³y wlew p³ynów izotonicznych o sk³adzie 1/3 objêtoci 5% glukozy i 2/3 objêtoci 0,9% NaCl w iloci 15 ml/kg m.c./h.
Nerkê przeszczepiono lewostronnie do przestrzeni we-wn¹trzotrzewnowej na wysokoci 4.-5. krêgu lêdwiowego. Dostêp do jamy otrzewnej wykonano analogicznie jak pod-czas operacji pobrania. Wypreparowano aortê i jej rozwidle-nia, ¿y³ê czcz¹ tyln¹ oraz dno pêcherza moczowego. Wszcze-pienie pobranej uprzednio nerki wykonano przez zespolenie ¿y³y i têtnicy nerkowej odpowiednio z ¿y³¹ g³ówn¹ tyln¹ i aort¹ typu koniec do boku na ³acie naczyniowej, przy u¿yciu szwu ci¹g³ego typu Prolen 4.0 (J&J Inc.). Najpierw wykony-wano zespolenie ¿ylne, nastêpnie têtnicze. W przypadku nie-szczelnoci zespoleñ zak³adano pojedyncze dodatkowe szwy uszczelniaj¹ce. Na czas wykonywania zespoleñ na ¿y³ê czcz¹ i aortê w miejscu zespolenia zak³adano styczne klemy naczy-niowe Satyñskiego, w sposób nie upoledzaj¹cy ukrwienia koñczyn tylnych i pozwalaj¹cy na wykonanie zespoleñ w bez-krwawym polu operacyjnym. Naczynia nacinano na d³ugoci odpowiadaj¹cej d³ugoci wstawianej ³aty. Ostatnim etapem wszczepienia nerki by³o zespolenie moczowodowe polegaj¹-ce na swobodnym umieszczeniu moczowodu w otworze w dnie pêcherza i umocowaniu go szwami pojedynczymi przez ca³¹ gruboæ ciany pêcherza i moczowodu szwem Dexon 3.0 (J&J Inc.) (ryc. 1). Ranê pooperacyjn¹ zeszyto trzema piêt-rami szwów: pierwszym piêtrem otrzewn¹ trzewn¹, otrzew-n¹ cienotrzew-n¹ z powiêzi¹ i miêniami, w drugim zak³adaj¹c na miênie szew ci¹g³y Vicryl 2, w trzecim skórê szwem ci¹g-³ym Prolen 2. Bezporednio po zabiegu podano furosemid (Furosemidum Polpharma S.A.) w dawce 1 mg/kg i.v., któr¹ powtórzono po 2 i 4 godzinach, chlorowodorek tramadolu (Tramal Grunenthal GmbH) w dawce 2 mg/kg i.m., ketopro-fen (Ketonal®, Lek) w dawce 2 mg/kg i.m., enrofloksacynê (Enroxl 5%, Krka) w dawce 5 mg/kg i.m., kontynuowano wlew p³ynów izotonicznych do ogólnej iloci 3500 ml przez na-stêpne 5 godzin.
Postêpowanie pooperacyjne w zale¿noci od stanu ogól-nego biorczyñ obejmowa³o: wlew p³ynów izotonicznych w iloci 3000 ml/dobê przez 3-5 dni po zabiegu, podanie chlo-rowodorku tramadolu (Tramal Grunenthal GmbH) 2-4 mg/kg i.m., w trzech dawkach podzielonych, ketoprofenu (Ketonal®, Lek) 2-4 mg/kg i.m., w dwóch dawkach podzielonych, azape-ronu (Stresnil, Janssen Animal Health BVBA) 3 mg/kg i.m., w trzech dawkach podzielonych. przez 5-6 dni po zabiegu, enrofloksacyny (Enroxil 5%, Krka) 5 mg/kg i.m. przez pierw-sze 5 dni po zabiegu i 2,5 mg/kg i.m. przez kolejne 12 dni.
U biorczyñ narz¹dów 7-krotnie pobierano 20 ml krwi ¿yl-nej: tu¿ przed zabiegiem, bezporednio po zabiegu, po 24, 48 i 72 godzinach oraz w 7. i 14. dniu po przeszczepie. Z krwi pe³nej pozyskiwano surowicê, któr¹ przechowywano do dal-szych badañ w temp. pocz¹tkowo 20°C, a nastêpnie 70°C. W surowicy badano poziom cytokin: IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a i INF-g. IL-1, IL-4 IL-6 IL-10 TNF-a oznacza-no metod¹ elisa testami: porcine IL-1b/IL-1F2 (nr kat. DY681), porcine IL-4 (nr kat. DY654), porcine IL-6 (nr kat. DY686),porcine IL-10 (nr kat. DY693), porcine TNF-a/ TNFSF1A (nr kat. DY690) firym R&D. Interferon gamma oznaczono testem elisa: swIFN-gamma Elisa (nr kat. 45--IFNGS-4021) firmy IBL. Oznaczenie wykonano aparatem Tecan IDEXX Spectra Classic, Austria.
Analizê statystyczn¹ wyników wykonano programem Sta-tistica 6.0 Pl. Sprawdzenie zgodnoci rozk³adu zmiennej lo-sowej z rozk³adem normalnym wykonano testem Shapiro--Wilka, analizê danych pod k¹tem jednorodnoci wariancji testem Levena i analizê wariancji dla powtarzanych pomia-rów z uwzglêdnieniem zmian w czasie i najni¿szych istotnych ró¿nic testem NIR.
Ryc. 1. Schemat wszczepienia nerki
Objanienia: 1 zespolenie têtnicze; 2 wszczepiona nerka; 3 zespolenie ¿ylne; 4 zespolenie moczowodowe
. p L Grupa Dawca Biorca 1 N-N niertansgeniczny niertansgeniczny 2 T-N rtansgeniczny niertansgeniczny 3 T-T rtansgeniczny rtansgeniczny
Tab. 1. Uk³ad dowiadczenia. Podzia³ na grupy w zale¿noci od statusu genetycznego dawców i biorców nerek
Wyniki i omówienie
Podobnie jak operacja pobrania nerek, zaproponowa-na metoda przeszczepienia nerki u wini wywodzi³a siê z metodyki stosowanej w medycynie cz³owieka.
Czas operacji transplantacji nerki wynosi³ 90-120 minut. W operacji przeszczepienia nerki wprowadzono zasadnicze modyfikacje. Przeszczep heterotropowy z pozostawieniem nerek biorczyñ wykonano do prze-strzeni wewn¹trzotrzewnowej z zespoleniem naczyñ ner-kowych z g³ównymi pniami naczyniowymi i lunym umieszczeniem transplantu w jamie brzusznej. Zespo-lenie naczyñ wykonano na wysokoci 4.-5. krêgu lêdwiowego, mo¿liwie blisko odejcia têtnicy krezko-wej doogonokrezko-wej i odga³êzieñ koñcowych aorty. Za-proponowana technika wszczepienia nerki zapewnia³a swobodny dostêp do miejsca operacji, prosty dostêp do g³ównych pni naczyniowych i ich izolacjê, wykonanie zespolenia ¿ylnego i têtniczego przy zachowanym ukrwieniu po³o¿onych ni¿ej zespolenia czêci cia³a oraz prost¹ anastomozê moczowodu. Zespolenie naczyñ krwiononych wykonano technik¹ koniec do boku z za-chowaniem 3-4 mm ³aty na têtnicy i ¿yle nerkowej a przyjêto j¹ jako metodê z wyboru ze wzglêdu na licz-ne odmiany anatomiczlicz-ne naczyñ, które obserwowano u 6 z 18 pobranych nerek (19). Bezporednio po uwol-nieniu klemy naczyniowej obserwowano prawid³owe wype³nianie nerki, ze zmian¹ jêdrnoci i barwy narz¹-du. W dwóch przypadkach za³o¿ono po jednym dodat-kowym szwie pojedynczym na zespolenie ¿ylne i têtni-cze, jedno zespolenie ¿ylne pozostawiono do samousz-czelnienia. Z 9 operacji przeszczepienia 8 zakoñczy³o siê powodzeniem. U zwierz¹t obserwowano obni¿enie pragnienia trwaj¹ce 24-36 godzin po zabiegu, stopnio-wy powrót apetytu w ci¹gu 4-12 dni po zabiegu i nis-kiego stopnia objawy bólowe, ustêpuj¹ce stopniowo w ci¹gu 4-6 dni po operacji. Iloæ oddawanego moczu wynosi³a 1-2 l/dobê. U jednej lochy od 12. dnia wyst¹-pi³o szybkie pogorszenie stanu zdrowia z objawami utra-ty pragnienia i apeutra-tytu, bladoci¹ b³on luzowych natu-ralnych otworów cia³a, niewydolnoci¹ sercowo-odde-chow¹, powiêkszeniem, napiêciem i wzmo¿on¹ tkliwo-ci¹ pow³ok brzusznych i oliguri¹. Sekcyjnie stwierdzo-no ropne zapalenie nerek, ropne zapalenie pêcherza mo-czowego, znaczn¹ iloæ p³ynu w jamie brzusznej, zapa-lenie otrzewnej i nieszczelnoæ zespolenia moczowo-dowego. Pozosta³e zwierzêta by³y obserwowane do 60. dnia po operacji, nie wykazywa³y w tym czasie widocz-nych objawów chorobowych. Nie obserwowano ró¿nic
stanu klinicznego w okresie 60 dni po operacji miêdzy zwierzêtami nietransgenicznymi i transgenicznymi.
W niniejszych badaniach uzyskano lepsze rezultaty w porównaniu z ró¿nymi stosowanymi wczeniej spo-sobami postêpowania. Uzyskano znacznie wy¿sz¹ prze-¿ywalnoæ zwierz¹t w porównaniu do transplantacji heterotropowej do przestrzeni wewn¹trzotrzewnowej z przeszczepieniem obu nerek w bloku z zespoleniem g³ównych pni naczyniowych koniec do boku lub zespo-leniem ¿y³y czczej tylnej przeszczepu z ¿y³¹ wrotn¹ bior-czyni (13, 14). Wykazano tak¿e wy¿sz¹ prze¿ywalnoæ biorczyñ w porównaniu z transplantacj¹ do przestrzeni wewn¹trzotrzewnowej z zespoleniem naczyñ nerkowych z têtnic¹ i ¿y³¹ biodrow¹ wspóln¹ (24). Uzyskano po-równywalne wyniki z technik¹ ortotopow¹, w której przeszczep en block wstawiono w miejsce nerek w³as-nych biorczyni (21). Oceniono, ¿e osi¹gniêto prawid³o-w¹ pracê przeszczepionej nerki do momentu odrzuce-nia transplantu przez organizm biorcy.
Ró¿nice genetyczne miêdzy dawc¹ a biorc¹ prowa-dz¹ do rozpoznania przeszczepu niezgodnego antyge-nowo i do odrzucenia go na drodze humoralnej i ko-mórkowej. W niniejszym dowiadczeniu reakcjê immu-nologiczn¹ okrelono na podstawie wybranych cytokin.
Uzyskane wyniki przedstawiono w tab. 2-7.
U wszystkich biorców stwierdzono znaczny wzrost poziomu cytokin w pierwszych 48-72 godzinach po za-biegu, ze spadkiem ich wartoci w ci¹gu kolejnych 11 dni, tj. do 14. dnia po transplantacji. Pomimo spadku wartoci cytokin utrzymywa³y siê na wysokim pozio-mie i 14. dnia po przeszczepie by³y znacznie wy¿sze w porównaniu z wartociami wyjciowymi. U wiñ bior-ców stwierdzono tak¿e przez ca³y okres dowiadczenia znacznie wy¿sze wartoci w porównaniu z grup¹ kon-troln¹ zwierz¹t hodowlanych.
Wyst¹pi³y istotne ró¿nice miêdzy grupami biorców. W grupie 1 (biorcy po transplantacji nietransgeniczny nietransgeniczny) w porównaniu z grup¹ 2 i 3 stwier-dzono znacznie wy¿sze wartoci cytokin: IL-1, IL-10, TNF i INF-g utrzymuj¹ce siê przez ca³y okres dowiad-czenia, a w przypadku IL-6 od 72 godziny po zabiegu. Jedynie IL-4 w grupie 1 wykaza³a wartoci ni¿sze w porównaniu z grup¹ 3 (transgenicznytransgeniczny) i porównywalne z grup¹ 2 (transgenicznynietransge-niczny). Wyniki uzyskane w grupach 2 i 3 w wiêkszoci badanych cytokin s¹ porównywalne, z wyj¹tkiem IL-4 i czêciowo IL-6, gdzie obserwowano wy¿sze wartoci w grupie 3 (transgenicznytransgeniczny). Uzyskane
Tab. 2. Zmiana zawartoci interleukiny 1 (IL-1) w surowicy wiñ (ng/ml) w zale¿noci od grupy i czasu po przeszczepie
Objanienia: rednie wartoci oznaczone ró¿nymi literami ró¿ni¹ siê istotnie przy: a, b p £ 0,001; c p £ 0,003; d, e p £ 0,05
a p u r G Pobranie 0 3h 24h 48h 72h 7dni 14dni a l o rt n o K 20,18±2,64 23,74±2,63 27,32abc±2,34 25,40abc±3,61 24,25abc±4,37 30,73abc±5,42 28,41abc±3,66 ) 1 ( N -N 21,53±1,95 24,83±2,88 50,95cde±7,03 63,09cde±4,30 59,99cde±6,00 63,04cde±7,57 48,15cde±5,54 ) 2 ( N -T 22,03±1,62 27,18±2,37 44,11ad±3,00 57,39ad±3,84 50,20ad±4,70 53,12ad±3,98 42,17ad±2,83 ) 3 ( T -T 21,93±1,14 23,69±4,27 45,53be±3,56 53,36be±3,95 50,91be±3,63 46,20be±4,67 39,64be±4,36
Tab. 3. Zmiana zawartoci interleukiny 4 (IL-4) w surowicy wiñ (ng/ml) w zale¿noci od grupy i czasu po przeszczepie
Objanienia: rednie wartoci oznaczone ró¿nymi literami ró¿ni¹ siê istotnie przy: a p £ 0,001; b p £ 0,003; c p £ 0,005; d, e p £ 0,05 a p u r G Pobranie 0 3h 24h 48h 72h 7dni 14dni a l o rt n o K 55,86±4,29 59,22abc±9,32 46,873abc±8,57 44,02abc±6,15 58,99abc±4,22 69,51abc±5,93 61,88abc±7,61 ) 1 ( N -N 68,45±11,66 81,93c±8,37 122,88cd±9,20 122,38cde±19,71 96,20cde±7,49 88,22cde±6,57 101,12cde±13,05 ) 2 ( N -T 69,03±4,03 92,37b±2,97 117,55bd±9,48 114,22bd±7,23 100,33bd±3,73 91,83bd±6,93 94,53bd±5,33 ) 3 ( T -T 70,83±4,20 85,67a±8,71 125,82a±8,02 137,58ae±10,09 115,10ae±3,81 104,12ae±11,29 107,75ae±12,13
Tab. 4. Zmiana zawartoci interleukiny 6 (IL-6) w surowicy wiñ (ng/ml) w zale¿noci od grupy i czasu po przeszczepie
Objanienia: rednie wartoci oznaczone ró¿nymi literami ró¿ni¹ siê istotnie przy: a p £ 0,00005; b p £ 0,0002; c p £ 0,0005; d p £ 0,02 a p u r G Pobranie 0 3h 24h 48h 72h 7dni 14dni a l o rt n o K 10,82±4,19 11,45ac±3,81 12,88abc±2,08 11,36abc±1,23 11,41abc±3,58 14,80abc±2,61 14,21abc±1,87 ) 1 ( N -N 12,01±0,86 15,77a±0,80 17,56a±1,26 20,26a±0,99 25,04ad±1,27 22,42ad±1,93 19,70a±1,22 ) 2 ( N -T 11,39±0,49 15,54c±0,99 18,03c±1,08 19,17c±1,16 20,47cd±1,20 19,87cd±1,44 18,69c±0,83 ) 3 ( T -T 12,28±0,68 14,17±1,10 20,84b±1,51 22,91b±2,64 22,16b±1,62 19,07b±1,35 16,60b±1,25
Objanienia: rednie wartoci oznaczone ró¿nymi literami ró¿ni¹ siê istotnie przy: a p £ 0,002; b, c p £ 0,02; d p £ 0,05 Tab. 5. Zmiana zawartoci interleukiny 10 (IL-10) w surowicy wiñ (ng/ml) w zale¿noci od grupy i czasu po przeszczepie
a p u r G Pobranie 0 3h 24h 48h 72h 7dni 14dni a l o rt n o K 13,47±1,26 13,32abd±0,47 14,69abd±0,67 13,62abd±1,62 13,94abd±1,54 15,07abd±0,98 14,12abd±0,63 ) 1 ( N -N 11,16±1,37 17,78ac±3,16 22,96ac±3,70 26,29ac±1,53 25,64ac±2,85 22,39ac±2,74 21,60ac±1,94 ) 2 ( N -T 11,65±1,12 15,60cd±0,63 20,11cd±1,19 22,77cd±1,40 22,42cd±1,83 18,79cd±1,47 17,30cd±0,82 ) 3 ( T -T 11,09±1,23 19,60b±1,90 21,32b±1,67 23,21b±2,52 21,91b±2,68 20,43b±3,80 18,74b±1,20
Objanienia: rednie wartoci oznaczone ró¿nymi literami ró¿ni¹ siê istotnie przy: a p £ 0,0001; b, c p £ 0,0002; d p £ 0,003; e p £ 0,005
Tab. 6. Zmiana zawartoci TNF-a w surowicy wiñ (ng/ml) w zale¿noci od grupy i czasu po przeszczepie
a p u r G Pobranie 0 3h 24h 48h 72h 7dni 14dni a l o rt n o K 13,02±1,49 14,56±1,74 16,82abc±1,13 15,35abc±1,32 18,63abc±1,47 18,37abc±1,28 15,72abc±1,45 ) 1 ( N -N 10,66±1,08 13,12±2,05 31,33ade±3,97 40,35ade±4,70 50,48ade±4,54 45,16ade±3,96 36,20ad±3,50 ) 2 ( N -T 11,64±0,94 14,32±0,94 20,40bd±1,14 35,99bd±2,28 43,35bd±2,20 36,53bd±2,04 28,29bd±2,21 ) 3 ( T -T 11,95±1,47 13,89±2,28 23,73ce±4,24 35,54ce±3,11 43,11±3,49 35,49ce±2,54 31,00c±3,10
Objanienia: rednie wartoci oznaczone ró¿nymi literami ró¿ni¹ siê istotnie przy: a p £ 0,0001; b, c p £ 0,001; d p £ 0,05 Tab. 7. Zmiana zawartoci interferonu gamma (IFN-g) w surowicy wiñ (pg/ml) w zale¿noci od grupy i czasu po przeszczepie
a p u r G Pobranie 0 3h 24h 48h 72h 7dni 14dni a l o rt n o K 82,03±7,46 80,15abc±13,14 94,05abc±9,06 79,97abc±10,24 97,69abc±8,43 117,46abc±13,10 141,00abc±10,11 ) 1 ( N -N 128,33±21,29 177,83ad±44,91 252,00ad±45,14 315,00ad±59,91 448,33ad±72,07 386,33a±87,79 365,83a±79,83 ) 2 ( N -T 88,00±2,76 113,17bd±7,31 158,83bd±20,20 256,50±21,27 375,00bd±20,71 351,67b±13,52 325,67b±17,90 ) 3 ( T -T 82,50±10,37 105,3c±21,43 176,7c±18,86 247,3c±47,91 388,3c±45,94 369,7c±71,23 342,3c±38,17
wyniki wskazuj¹ na ostr¹ reakcje komórkow¹ i humo-raln¹ biorców z ostrym odrzuceniem graftu.
Cytokiny s¹ g³ównym mediatorem odrzucenia prze-szczepu, przenosz¹ informacjê miêdzy komórkami, a ich istotn¹ cech¹ jest wywo³ywanie ró¿nych efektów na ró¿-nych komórkach. Stwierdzono, ¿e w odrzucaniu prze-szczepu uczestnicz¹ IL-1, -2, -4, -5, -6, -7, -12, -15, -18, IFN-g, TNF-a na ró¿nych poziomach odpowiedzi. Cy-tokiny s¹ bardzo czu³ym wskanikiem procesów zapal-nych. U wiñ w badaniach in vitro stwierdzono bardzo wysoki, kilkunastokrotny wzrost poziomu IFN-g, IL-10 i IL-4 na antygenty wirusowe PCV2 w ci¹gu 48-72 go-dzin po ekspozycji wirusa (5). Wyniki szeregu badañ wykaza³y znaczne zmiany poziomu cytokin u wiñ po transplantacji nerek. Odnotowano znaczny wzrost po-ziomu IL-6 od 4. do 10. dnia po transplantacji z towa-rzysz¹cym naciekiem makrofagów i znacznym wzrostem IgM i IgG skierowanym przeciwko b³onom komórko-wym przeszczepu (1). Zwraca siê uwagê na wzrost po-ziomu IL-4, której przypisuje siê rolê ochronn¹ prze-szczepu przez neutralizuj¹cy wp³yw na TNF-a (17). In-teresuj¹ce wyniki uzyskali Blanco i wsp., wskazali na bardzo wysoki wzrost INF-g w ci¹gu pierwszych 4 dni po zabiegu bez zmian poziomu IL-10 u biorców, u któ-rych dosz³o do odrzutu przeszczepu. Wskazali tak¿e nie-wielkie zmiany poziomu INF i wysoki wzrost poziomu IL-10 od 8. dnia po transplantacji u biorców, u których nie dosz³o do odrzucenia (2). Najistotniejszymi wydaj¹ siê cytokiny zwi¹zane z limfocytami pomocniczymi Th1 i Th2, z których pierwsze wspomagaj¹ reakcje komór-kowe, drugie humoralne. G³ówn¹ cytokin¹ produkowa-n¹ przez Th1 jest IFN-g aktywuj¹cy makrofagi, komór-ki cytotoksyczne NK, zwiêkszaj¹cy ekspresjê antyge-nów, ale uczestnicz¹cy tak¿e w ró¿nicowaniu limfocy-tów B i hamowaniu Th2 (6, 16). Aktywowane makro-fagi wytwarzaj¹ mediatory stanu zapalnego IL-1 i TNF--alfa. Te ostatnie za powoduj¹ pojawienie siê w limfo-cytów, neutrofili i monocytów powoduj¹cych destruk-cje tkanki (15, 18), w konsekwencji proliferacjê fibro-blastów, wytwarzanie kolagenu i zw³óknienie tkanki.
Limfocyty subpopulacji Th2 produkuj¹ wiêksz¹ iloæ cytokin, do których nale¿¹: IL-4 stymuluj¹ca limfocyty B do proliferacji i wytwarzania przeciwcia³, aktywacji makrofagów i komórek tucznych, IL-6 stymuluj¹c¹ lim-focyty B do produkcji przeciwcia³, IL-10 hamuj¹ca wytwarzanie cytokin przez Th1, monocyty i makrofagi (2, 6, 7, 24).
W niniejszej pracy stwierdzono wyrane ró¿nice miê-dzy grupami. U biorców transgenicznych i nietransge-nicznych wyst¹pi³a podobna reakcja immunologiczna po transplantacji nerek transgenicznych. Na tej podsta-wie mo¿na s¹dziæ, ¿e status genetyczny biorcy nie od-grywa³ tak istotnego znaczenia. Istotne znaczenie wy-daje siê mieæ status genetyczny dawcy, bowiem po trans-plantacji nerek transgenicznych stwierdzono mniejsze zmiany wartoci cytokin ni¿ po transplantacji nerek po-chodz¹cych od zwierz¹t nietransgenicznych. Wykaza-no s³absz¹ reakcjê immuWykaza-nologiczn¹ w porównaniu z przeszczepami niemodyfikowanymi genetycznie, prze-prowadzona transgeneza wp³ynê³a zatem korzystnie na
immunogennoæ przeszczepu. Dodatkowo bior¹c pod uwagê, ¿e badania prowadzono bez immunosupresji, uzyskane wyniki pozwalaj¹ na wysuniecie hipotezy o zmniejszonej immunogennoci transplantu tak¿e w warunkach klinicznych z zastosowaniem pe³nej im-munosupresji analogicznej jak w transplantologii cz³o-wieka.
Pimiennictwo
1.Benda B., Korsgern O.: Interleukin-6 in islet xenograft rejection. Transpl. Int. 2001, 14, 63-71.
2.Blancho G., Gianello P., Germana S., Baetschert M., Sachs D. H., Leguern C.: Molecular identification of porcine interleukin 10: Regulation of expression in a kidney allograft model. Proc. Natl Acad. Sci. 1995, 92, 2800-2804. 3.Bühler L., Friedman T., Iacomini J., Cooper D. K. C.: Xenotransplantation
state of the hear update 1999. Frontiers Biosci. 1999, 4, 416-432.
4.Cooper D. K., Koren E., Oriol R.: Oligosaccharides and discordant xeno-transplantation. Immunol Rev. 1994, 141, 31-58.
5.Darwich L., Balasch M., Plana-Durán J., Segalés J., Domingo M., Mateu E.: Cytokine profiles of peripheral blood mononuclear cells from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome in response to mitogen, superantigen or recall viral antigens. J. Gen. Virol. 2003, 84, 3453-3457.
6.De Groot J., Kruijt L., Scholten J. W., Boersma W. J. A., Buist W. G., Engel B., van Reenen C. G.: Age, gender and litter-related variation in T-lymphocyte cytokine production in young pigs. Immunology 2005, 115, 495 505. 7.Deol H. S., Tuch B. E.: Effect of interleukin-10 on human anti-porcine
xeno-geneic cellular response in vitro. Transplantation 2000, 69, 112-119. 8.Deschamps J. Y., Roux J. Y., Sai P., Gouin E.: History of xenotransplantation.
Xenotransplantation 2005, 12, 91-109.
9.Galili U., Mandrell R. E., Hamadeh R. M., Shohet R. B., Griffiss J. M.: The interaction between the human natural anti-a galactosyl IgG (anti-Gal) and bacteria of the human flora. Infect. Immun. 1988, 57, 1730-1737.
10.Hammerman M. R.: Xenotransplantation of developing kidneys. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2002, 283, 601-606.
11.Karlson-Parra A., Ridderstad A., Wallgren A. C., Moller E., Ljunggren H. G., Korsgren O.: Xenograft rejection of porcine islet-like cell clusters in normal and natural killer cell-depleted mice. Transplantation 1996, 61, 1313-1320. 12.Lambrigts D., Sachs D. H., Cooper D. K. C.: Discordant organ
xenotransplan-tation in primates world experience and current status. Transplanxenotransplan-tation 1998, 66, 547-561.
13.Mazzoni G., Di Martino C., Demofonti A., Valli A., Pellegrini S., Genili B., Melis M.: Simultaneous allografts of both kidneys in pigs with different portal and caval venous drainage. Am. J. Surg. 1972, 124, 39-42.
14.Mazzoni G., Di Martino C., demofonti A., Valli A., Pellegrini S., Gentili B., Melis M.: A comparison of portal and systemic venous drainage in porcine renal allografts. Br. J. Surg. 1972, 59, 541-544.
15.Noronha I. L., Oliveira S. G., Tavares T. S., Di Petta A., Dominguez W. V., Perosa M., Genzini T., Romao J. E. Jr., Abensur H., Moura L. A., Filho D. M.: Apoptosis in kidney and pancreas allograft biopsies. Transplantation 2005, 79, 1231-1235.
16.Olack B., Jaramillo A., Benshoff N. D., Kaleem Z., Swanson C. J., Lowell J. A., Mohanakumar T.: Rejection of porcine islet xenografts mediated by CD4+ T cells activated through the indirect antigen recognition pathway. Xeno-transplantation 2002, 9, 393-401.
17.Olack B., Manna P., Jaramillo A., Steward N., Swanson C., Kaesberg K., Poindexter N., Howard T., Mohanakumar T.: Indirect recognition of porcine swine leukocyte Ag class I molecules expressed on islets by human CD4+
T lymphocytes. J. Immunol. 2000, 165, 1294-1299.
18.Shimizu A., Yamada K., Meehan S. M., Sachs D. H., Colvin R. B.: Acceptance reaction: intragraft events associated with tolerance to renal allografts in miniature swine. J. Am. Soc. Nephrol. 2000, 11, 2371-2380.
19.Skuciñski J., Nowak W., Wieczorek J., Solecki R.: Chirurgiczne aspekty pobiera-nia nerek u wiñ dla celów ksenotransplantacji. Medycyna Wet. (w druku). 20.Wallgren A. C., Karlsson-Parra A., Korsgren O.: The main infiltrating cell in
xenograft rejection is a CD4+ macrophage and not a T lymphocyte.
Transplan-tation 1995, 60, 594-601.
21.Wang K., Li Y., Jiang H., Shen J., Zhang L.: Pig orthotopic renal allotransplan-tation model. Transplant Proc. 2003, 35, 191.
22.Williams J. M., Holzknecht Z. E., Plummer T. B., Lin S. S., Brun G. J., Platt J. L.: Acute vascular rejection and accommodation: divergent outcomes of the humoral response to organ transplantation. Transplantation 2004, 78, 1471-1478. 23.Xu X. C., Naziruddin B., Sasaki H., Smith D. M., Mohanakumar T.: Allele--specific and peptide-dependent recognition of swine leukocyte antigen class I by human cytotoxic T-cell clones. Transplantation 1999, 68, 473-479. 24.Yanaga K., Makowka L., Shimada M., Lebeau G., Kahn D., Mieles L. A.,
Sher L., Chapchap P., Podesta L. G., Starzl T. E.: Improved method of porcine renal allografting for transplantation research. J. Invest. Surg. 1991, 4, 231-236.
Adres autora: dr n. med. Jerzy Skuciñski, ul. Kopernika 40, 31-501 Kra-ków; e-mail: msskucin@cyf-kr.edu.pl
