Praca oryginalna Original paper
Leczenie i zwalczanie grzybicy skórnej królików w systemie chowu halowego przy u¿yciu chemiotera-peutyków jest trudne, pracoch³onne i nie zawsze sku-teczne. Brak efektów jest zwi¹zany z du¿¹ opornoci¹ spor grzyba na czynniki rodowiska i rodki odka¿a-j¹ce oraz utrudnionym wnikaniem leków przeciwgrzy-bicznych w miejsce procesu chorobowego. Niektóre z tych leków s¹ przy tym wysoce toksyczne i wywie-raj¹ dzia³anie immunosupresyjne i teratogenne (16). Najbardziej efektywn¹ metod¹ zwalczania grzybicy skórnej królików w fermach, w których choroba ta wy-stêpuje stacjonarnie, jest swoista profilaktyka i tera-pia przy u¿yciu szczepionek (6, 7, 18). Racjonalne sto-sowanie immunoprofilaktyki i immunoterapii wyma-ga znajomoci mechanizmów, które warunkuj¹ odpor-noæ przeciwgrzybicz¹ królików (16).
Celem badañ by³a ocena cytometryczna subpopula-cji limfocytów zawieraj¹cych cz¹steczki CD3, CD4, CD8, CD19 i CD25 oraz aktywnoci fagocytarnej i metabolizmu tlenowego granulocytów krwi obwo-dowej królików zaka¿onych dowiadczalnie
Tricho-phyton mentagrophytes, u których zastosowano wak-cynoterapiê.
Materia³ i metody
Zwierzêta dowiadczalne. Badania wykonano na 24 królikach rasy nowozelandzkiej w wieku 10 tygodni, po-chodz¹cych z hodowli wolnej od grzybicy skórnej. Zwie-rzêta podzielono na dwie grupy dowiadczalne (Grupa I, II) i grupê kontroln¹ (Grupa III) po 8 królików w ka¿dej. Przed przyst¹pieniem do dowiadczenia od królików po-brano próbki w³osów z ró¿nych okolic cia³a do mikolo-gicznych badañ hodowlanych. W ¿adnej z próbek nie stwier-dzono wzrostu dermatofitów. Dodatkowo u zwierz¹t tych wykonano testy skórne, do których u¿ywano oczyszczonej frakcji glikoproteinowej (Tm-GP) otrzymanej ze szczepu T. mentagrophytes wed³ug metody Wo³oszyna i Umiñskie-go (17). U wszystkich królików testy skórne wypad³y ujemnie.
Do zaka¿enia eksperymentalnego u¿yto zjadliwego szczepu T. mentagrophytes var. granulosum (Tm-K), wy-izolowanego uprzednio od królików z naturaln¹
trychofi-Ocena subpopulacji limfocytów oraz aktywnoci
fagocytarnej i metabolizmu tlenowego granulocytów
u królików zaka¿onych Trichophyton mentagrophytes
i poddanych wakcynoterapii
KRZYSZTOF KOSTRO, KATARZYNA WOJCICKA-LORENOWICZ, BARBARA MAJER-DZIEDZIC*, ZBIGNIEW GR¥DZKI, £UKASZ JAROSZ
Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakanych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin *Zak³ad Mikrobiologii Weterynaryjnej Instytutu Biologicznych Podstaw Chorób Zwierz¹t
Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin
Kostro K., Wojcicka-Lorenowicz K., Majer-Dziedzic B., Gr¹dzki Z., Jarosz £.
Evaluation of lymphocyte subpopulations, phagocytic activity and oxygen metabolism of granulocytes of rabbits infected with Trichophyton mentagrophytes and immunized against trichophytosis
Summary
The aim of the study was to evaluate the CD3, CD4, CD8, CD19, CD25 T lymphocyte subpopulations and the state of granulocytes activity in the peripheral blood of rabbits infected with Trichophyton mentagrophytes and immunized against trichophytosis by using the flow cytometry method. Our study revealed significant suppression of non-specific cellular antimycotic immunity in rabbits during the development of fungal lesions, which manifested a significant decrease in the phagocytic activity and oxygen metabolism of granulo-cytes and the decrease of CD3, CD4 subpopulations and CD25 T lymphogranulo-cytes. Simultaneously, the increase of suppressor CD8 T cells and CD4/CD8 T-cells ratio were observed. The vaccine Alopevac can be used as an effective vaccine against rabbit trichophytosis. Alopevac restored non-specific cellular antimycotic immunity and proper CD4/CD8 T-cells ratio, which contributed to the effective elimination of fungal lesions.
toz¹ (6). Króliki zaka¿ano, wcieraj¹c uprzednio przygoto-wan¹ zawiesinê o gêstoci 104 cfu/ml w wystrzy¿on¹ i
lek-ko skaryfilek-kowan¹ skórê przez 2 lek-kolejne dni w olek-kolicy ³o-patki i uda po obu stronach cia³a oraz na grzbiecie (³¹cznie 5 pól). Dzienn¹ dawkê wynosz¹c¹ 5 ml zawiesiny grzyba podzielono na 5 czêci i wcierano w skórê ka¿demu króli-kowi.
W okresie nasilonych zmian klinicznych (14. dzieñ po zaka¿eniu) 8 królikom (grupa I) podano leczniczo handlo-w¹ szczepionkê Alopevac domiêniowo dwukrotnie w od-stêpach 10 dni w dawce 1 ml. Pozosta³e 8 królików zaka-¿onych eksperymentalnie, nie poddanych szczepieniu sta-nowi³o pozytywn¹ grupê kontroln¹ (grupa II). Negatywn¹ grupê kontroln¹ (grupa III) stanowi³o 8 królików zdrowych, nie zaka¿onych i nie immunizowanych.
Zwierzêta grup dowiadczalnych i grupy kontrolnej pod-dano obserwacji, w czasie której przeledzono dynamikê procesu chorobowego i okrelono profil odpowiedzi im-munologicznej w przebiegu eksperymentalnego zaka¿enia T. mentagrophytes oraz u zwierz¹t zaka¿onych i poddanych wakcynoterapii. Odpowied immunologiczn¹ okrelono za pomoc¹ wymienionych poni¿ej testów, które wykonywano w 0., 14., 24., 34. i 41. dniu po zaka¿eniu. Uzyskane wyni-ki badañ poddano analizie statystycznej stosuj¹c test t-Stu-denta.
Szczepionka. W badaniach u¿yto handlowej szczepion-ki inaktywowanej Alopevac produkcji Pu³awsszczepion-kich Zak³a-dów Przemys³u Bioweterynaryjnego, zawieraj¹cej wysoce immunogenny szczep T. mentagrophytes i T. verrucosum, stosowanej w leczeniu i zapobieganiu trychofitozie lisów. Biopreparat ten posiada równie¿ dobre w³aciwoci tera-peutyczne oraz ochronne przeciwko trychofitozie królików (6, 7).
Okrelenie cz¹steczek powierzchniowych CD3, CD4, CD8, CD19 i CD25 na limfocytach. Badania wykonano metod¹ cytometrii przep³ywowej, stosuj¹c dwustopniowe znakowanie komórek. W pierwszym etapie u¿yto mysich przeciwcia³ monoklonalnych skierowanych przeciwko cz¹-steczkom powierzchniowym CD3, CD4, CD8, CD19 i CD25 obecnym na limfocytach cz³owieka, za w drugim przeciwcia³ króliczych znakowanych FITC skierowanych przeciwko mysiej IgG (Serotec Immunological Excellence Oxford, England). Oznaczenia wykonano zgodnie z za³¹-czon¹ do zestawów przeciwcia³ procedur¹.
Okrelenie aktywnoci fagocytarnej granulocytów. Aktywnoæ fagocytarn¹ granulocytów okrelono metod¹ cy-tometrii przep³ywowej, u¿ywaj¹c komercyjnego zestawu Phagotest (Orpegon Pharma, Heidelberg, F.R.G.), zaadap-towanego do metody cytometrii przep³ywowej. Oznacze-nia wykonano wed³ug za³¹czonej instrukcji producenta testu.
Okrelenie aktywnoci metabolizmu tlenowego gra-nulocytów. Metabolizm tlenowy granulocytów okrelono przy u¿yciu komercyjnego zestawu Bursttest (Orpegon Pharma, Heidelberg, F.R.G.) zaadaptowanego do metody cytometrii przep³ywowej. Oznaczenia wykonano wed³ug za³¹czonej instrukcji producenta testu. Odsetek pobudzo-nych komórek zdolpobudzo-nych do produkcji metabolitów tleno-wych okrelono przy pomocy przekszta³conego modelu DHR (dihydrorhodamine) 123 w R 123.
Wyniki i omówienie
Wyniki obserwacji klinicznych i badañ mikolo-gicznych. Objawy kliniczne u królików zaka¿onych dowiadczalnie w postaci przekrwienia, obrzêku skó-ry oraz ³uszczenia siê naskórka w miejscu inokulacji T. mentagrophytes pojawia³y siê pomiêdzy 6.-8. dniem po zaka¿eniu. Dopiero w 12.-14. dniu tworzy³y siê pê-cherzyki i ró¿nej gruboci strupy koloru szaro¿ó³tego, póniej azbestowego, które pokrywa³y ca³e ogniska i by³y zawsze ograniczone do strefy zaka¿enia. Strupy te po kilku dniach samoistnie odkleja³y siê i odpada³y, ods³aniaj¹c zdrowy naskórek. U królików zaka¿onych T. mentagrophytes i poddanych wakcynoterapii zmia-ny chorobowe zanika³y miêdzy 24. a 34. dniem, nato-miast u zwierz¹t tylko zaka¿onych zanika³y one pó-niej, tj. pomiêdzy 34. a 41. dniem po infekcji, co ma-nifestowa³o siê ³uszczeniem i odpadaniem strupów. U królików grupy I dodatnie wyniki mikologicznych badañ hodowlanych uzyskano do 24. dnia w³¹cznie. W 34. i 41. dniu obserwacji wyniki posiewów od wszystkich królików by³y negatywne. Natomiast u kró-lików grupy II badaniem hodowlanym obecnoæ T. mentagrophytes w ogniskach chorobowych wyka-zano pomiêdzy 8. a 34. dniem od zaka¿enia i dopiero w ostatnim terminie badañ wyniki posiewów od wszystkich królików by³y negatywne. U zwierz¹t grupy kontrolnej nie obserwowano ¿adnych objawów chorobowych, a wyniki badañ hodowlanych wypad³y negatywnie we wszystkich terminach.
Wyniki badañ immunologicznych. Przed zaka¿e-niem (dzieñ 0.) aktywnoæ fagocytarna granulocytów we wszystkich grupach zwierz¹t by³a zbli¿ona (ryc. 2). W 14. dniu w grupach zwierz¹t zaka¿onych ekspery-mentalnie T. mentagrophytes (grupa I i II) odsetek ko-mórek fagocytuj¹cych ulega³ statystycznie istotnemu spadkowi tak w odniesieniu do wartoci wyjciowych, jak i grupy kontrolnej i by³y to najni¿sze jego rednie wartoci w toku ca³ego dowiadczenia. Po tym czasie odsetek komórek fagocytuj¹cych u królików grupy I i II ulega³ stopniowemu i statystycznie istotnemu wzro-stowi i w 41. dniu obserwacji stwierdzono najwy¿sze
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Stosunek CD4 :CD8 Grupa I Grupa II Grupa III 0. 14. 24. 34. 41. dzieñ
Ryc. 1. Stosunek limfocytów CD4 : CD8 we krwi obwodowej u królików zaka¿onych dowiadczalnie T. mentagrophytes i poddanych wakcynoterapii (x ± SD)
jego rednie wartoci. W tym czasie ust¹pi³y ju¿ obja-wy kliniczne trichofitozy, a obja-wyniki badañ mikologicz-nych by³y ujemne.
Podobnie w dniu rozpoczêcia badañ rednie war-toci kana³u fluorescencji w grupie dowiadczalnej by³y zbli¿one do kontroli (ryc. 3). rednie wartoci kana³u fluorescencji w grupie I i II oznaczone w 14. dniu po zaka¿eniu dowiadczalnym T. mentagrophy-tes by³y najni¿sze (p £ 0,01) w toku ca³ego dowiad-czenia tak w stosunku do wartoci wyjciowych, jak i grupy kontrolnej. W kolejnych terminach oznaczeñ redni kana³ fluorescencji w grupach zwierz¹t dowiad-czalnych ulega³ stopniowemu i istotnemu wzrostowi i w ostatnim terminie oznaczeñ stwierdzono najwy¿-sze jego rednie wartoci. U królików w grupie
kon-trolnej rednie wartoci odsetka komórek fagocytuj¹-cych oraz redni kana³ fluorescencji utrzymywa³y siê na poziomie zbli¿onym do wyjciowego przez ca³y okres obserwacji.
Z danych na ryc. 4 wynika, ¿e w dniu rozpoczêcia badañ odsetek komórek pobudzonych po aktywacji E. coli by³ zbli¿ony we wszystkich trzech grupach kró-lików. U królików zaka¿onych dowiadczalnie T. men-tagrophytes (grupa I i II) istotny (p £ 0,01) wzrost odsetka komórek pobudzonych nast¹pi³ w 14. dniu, tj. w okresie w pe³ni rozwiniêtych objawów klinicznych trychofitozy. W przypadku królików grupy II by³y to maksymalne wskaniki komórek pobudzonych w toku ca³ego dowiadczenia. Po tym czasie w grupie króli-ków tylko zaka¿onych dowiadczalnie T. mentagro-phytes (grupa II) nastêpowa³ stopniowy spadek odset-ka komórek pobudzonych, lecz do koñca badañ jego rednie wartoci by³y istotnie wy¿sze w porównaniu z grup¹ kontroln¹ (p £ 0,05). Natomiast u królików zaka¿onych T. mentagrophytes i poddanych wakcyno-terapii (grupa I) w 24. dniu stwierdzono dalszy wzrost odsetka komórek pobudzonych i w kolejnym terminie
% komórek fagocytuj¹cych 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Grupa I Grupa II Grupa III 0. 14. 24. 34. 41. dzieñ A C A CBCBC ACAC BCBC CAAC CBCB CCAA BCBC
Ryc. 2. Cytometryczna analiza aktywnoci fagocytarnej gra-nulocytów (% komórek fagocytuj¹cych) w krwi obwodowej u królików zaka¿onych dowiadczalnie T. mentagrophytes i poddanych wakcynoterapii (x ± SD)
Objanienia: A ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy grup¹ dowiadczaln¹ (I) a kontrol¹ (III) (a £ 0,01); a ró¿nice statys-tycznie istotne pomiêdzy grup¹ dowiadczaln¹ (I) a kontrol¹ (III) (a £ 0,05); B ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy grup¹ dowiadczaln¹ (II) a kontrol¹ (III) (a £ 0,01); b ró¿nice statys-tycznie istotne pomiêdzy grup¹ dowiadczaln¹ (II) a kontrol¹ (III) (a £ 0,05); C ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy kolejny-mi pobraniakolejny-mi a dniem 0 (a £ 0,01); c ró¿nice statystycznie istotne pomiêdzy kolejnymi pobraniami a dniem 0 (a £ 0,05)
Ryc. 3. Cytometryczna analiza aktywnoci fagocytarnej gra-nulocytów (redni kana³ fluorescencji) w krwi obwodowej u królików zaka¿onych dowiadczalnie T. mentagrophytes i poddanych wakcynoterapii (x ± SD)
Objanienia: jak na ryc. 2.
Œredni kana³ fluorescencji 0 20 40 60 80 100 120 Grupa I Grupa II Grupa III 0. 14. 24. 34. 41. dzieñ A C A CBCBC ACAC BCBC CAAC CBCB CCAA BCBC
Ryc. 5. Ocena metabolizmu tlenowego granulocytów (redni kana³ fluorescencji) we krwi obwodowej po aktywacji E. coli u królików zaka¿onych dowiadczalnie T. mentagrophytes i poddanych wakcynoterapii (x ± SD)
Objanienia: jak na ryc. 2. Ryc. 4. Ocena metabolizmu tlenowego granulocytów (%
ko-mórek pobudzonych) w krwi obwodowej po aktywacji E. coli u królików zaka¿onych dowiadczalnie T. mentagrophytes i poddanych wakcynoterapii (x ± SD)
Objanienia: jak na ryc. 2.
% komórek pobudzonych 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Grupa I Grupa II Grupa III 0. 14. 24. 34. 41. dzieñ A C A CBCBC ACAC BCBC CAAC BBcc ACAC bb Œredni kana³ fluorescencji 0 20 40 60 80 100 120 Grupa I Grupa II Grupa III 0. 14. 24. 34. 41. dzieñ A C A CBCBC ACAC BCBC CAAC BBcc CCAA BCBC
oznaczeñ obserwowano jego najwy¿sze wartoci w toku ca³ego dowiadczenia. W ostatnim dniu badañ odsetek komórek pobudzonych uleg³ wyranemu spad-kowi, lecz jego rednie wartoci by³y istotnie wy¿sze w porównaniu do wartoci pocz¹tkowej (p £ 0,01) oraz grupy kontrolnej (p £ 0,01).
Przed zaka¿eniem równie¿ redni kana³ fluorescen-cji we wszystkich badanych grupach zwierz¹t by³ zbli-¿ony (ryc. 5). W grupach królików zakazbli-¿onych do-wiadczalnie T. mentagrophytes (grupa I i II) najni¿-sze i statystycznie istotne rednie wartoci kana³u fluo-rescencji w ci¹gu ca³ego dowiadczenia stwierdzono w 14. dniu. Od 24. dnia w grupach dowiadczalnych (grupa I i II) notowano stopniowy i statystycznie istot-ny wzrost redniego kana³u fluorescencji i w 41. dniu stwierdzono najwy¿sze jego wartoci tak w odniesie-niu do wartoci wyjciowej, jak i grupy kontrolnej. Jednak¿e rednie wartoci kana³u fluorescencji u kró-lików zaka¿onych i poddanych wakcynoterapii by³y wyranie wy¿sze w porównaniu do zwierz¹t tylko za-ka¿onych T. mentagrophytes. U królików w grupie kontrolnej zarówno odsetek komórek pobudzonych, jak i rednie wartoci kana³u fluorescencji utrzymy-wa³y siê na poziomie zbli¿onym do wyjciowego przez ca³y okres obserwacji.
Cytometryczn¹ analizê subpopulacji limfocytów CD3, CD4, CD8, CD19 i CD25 oraz stosunek limfo-cytów CD4 do CD8 ilustruje tab. 1 oraz ryc. 1. U kró-lików grupy I i II w 14. dniu po dowiadczalnym zaka-¿eniu T. mentagrophytes nast¹pi³ istotny spadek od-setka limfocytów CD3 w porównaniu do wartoci wyjciowej oraz grupy kontrolnej, a jego rednie war-toci by³y najni¿sze w toku ca³ego dowiadczenia. W kolejnym dniu badañ w obu grupach dowiadczal-nych nastêpowa³ wzrost odsetka limfocytów CD3, a jego rednie wartoci by³y zbli¿one do wartoci wyj-ciowych oraz grupy kontrolnej. U królików tylko za-ka¿onych T. mentagrophytes (grupa II) odsetek limfo-cytów CD3 na zbli¿onym do poprzedniego poziomie utrzymywa³ siê do 34. dnia obserwacji i dopiero w ostatnim terminie oznaczeñ osi¹ga³ najwy¿sze war-toci w toku ca³ego dowiadczenia. Natomiast u kró-lików zaka¿onych i poddanych wakcynoterapii (gru-pa I) maksymalne rednie wartoci odsetka limfocy-tów CD3 notowano w 34. dniu badañ (10. dzieñ po II dawce szczepionki) i mniej wiêcej na tym poziomie utrzymywa³y siê one do koñca obserwacji. W grupie kontrolnej odsetek limfocytów CD3 utrzymywa³ siê z niewielkimi odchyleniami na tym samym poziomie przez ca³y okres obserwacji.
W dniu rozpoczêcia badañ odsetek limfocytów CD4 we wszystkich badanych grupach zwierz¹t by³ podob-ny (tab. 1). W kolejpodob-nym terminie oznaczeñ u królików zaka¿onych T. mentagrophytes (grupa I i II) notowano najwy¿szy i statystycznie istotny (p £ 0,01) spadek odsetka limfocytów CD4 tak w odniesieniu do war-toci wyjciowych, jak i grupy kontrolnej. W kolej-nych terminach oznaczeñ w obu grupach
dowiadczal-nych odsetek limfocytów CD4 ulega³ stopniowemu wzrostowi i w ostatnim dniu badañ obserwowano jego najwy¿sze rednie wartoci w toku ca³ej obserwacji. W grupie królików zaka¿onych i poddanych wakcy-noterapii ró¿nice te by³y istotne tak w odniesieniu do wartoci pocz¹tkowej (p £ 0,01), jak i grupy kontrol-nej (p £ 0,05). Natomiast rednie wartoci limfocy-tów CD8 u królików dowiadczalnych grupa I i II) w 14. dniu po zaka¿eniu by³y najwy¿sze w toku ca³ej obserwacji i istotnie (p £ 0,01) wy¿sze w porównaniu do wartoci wyjciowych oraz grupy kontrolnej. Od 24. dnia odsetek limfocytów CD8 u zwierz¹t grup do-wiadczalnych ulega³ stopniowemu spadkowi i w ostat-nim dniu oznaczeñ jego rednie wartoci u królików grupy I by³y istotnie (p £ 0,05) ni¿sze od wyjcio-wych, natomiast u królików grupy II zbli¿one do wyj-ciowych i grupy kontrolnej.
Stosunek limfocytów CD4 do CD8 u królików grup dowiadczalnych by³ najni¿szy w toku ca³ego dowiad-czenia w 14. dniu po zaka¿eniu T. mentagrophytes i wynosi³ kolejno 1,5 i 1,4. Natomiast w grupie kon-trolnej w tym samym terminie oznaczeñ stosunek ten
ñ e iz D Grupa CD3 CD4 CD8 CD19 CD25 0 I a p u r G (±592,,65) (±382,,21) (±151,,75) (±42,7,5) (±483,,73) II a p u r G (±583,,95) (±372,,41) (±141,,33) (±52,2,6) (±472,,89) II I a p u r G (±574,,41) (±381,,48) (±141,,97) (±52,9,8) (±491,,49) 4 1 I a p u r G 4(±7,16,A5,)C 3(±0,19,A1,C) 1(±9,19,A5,)C (1±,10A,,7C) 2(±4,13,A2,C) II a p u r G 4(±6,29,B1,)C 2(±9,11B,9,C) 2(0±,71B,3,C) (1±,50B,,2C) 1(±6,18,B8,C) II I a p u r G (±592,,12) (±393,,14) (±141,,22) (±51,3,3) (±482,,14) 4 2 I a p u r G (±583,,92) (±391,,39) (±141,,55) (8±,81A,,4C) 5(±8,43,A4,C) II a p u r G (±572,,42) (±352,,31) 1(±6,18,b3,C) (2±,91B,,1C) (±501,,18) II I a p u r G (±582,,45) (±383,,19) (±142,,34) (±41,9,2) (±472,,84) 4 3 I a p u r G 6(±4,25,A5,)C (±403,,89) (±141,,15) (6±,70a,,9C) 6(±8,28,A6,C) II a p u r G (±592,,12) (±372,,99) (±151,,83) (2±,51B,,1C) (5±82,1,7B) II I a p u r G (±573,,94) (±372,,96) (±152,,47) (±50,6,9) (±493,,32) 1 4 I a p u r G 6(±3,25,A5,)c 4(±3,38,a9,C) (1±31,9,5c) (6±,70A,,9C) 6(±8,28,A6,C) II a p u r G (6±22,,12b) (±402,,29) (±141,,33) (±41,5,1) 6(±2,21,B7,C) II I a p u r G (±582,,29) (±382,,85) (±153,,52) (±40,9,6) (±482,,55)
Tab. 1. Odsetek limfocytów CD3, CD4, CD8, CD19 i CD25 w krwi obwodowej u królików zaka¿onych dowiadczalnie T. mentagrophytes i poddanych wakcynoterapii (x ± SD)
wynosi³ 2,7 (ryc. 1). Po tym czasie w grupach zwie-rz¹t dowiadczalnych stosunek limfocytów CD4 do CD8 stopniowo wzrasta³, osi¹gaj¹c najwy¿sze warto-ci (3,2 grupa I i 2,8 grupa II) w ostatnim dniu badañ. U królików grupy kontrolnej zarówno odsetek limfo-cytów CD4 i CD8, jak i stosunek CD4 do CD8 utrzy-mywa³ siê w toku ca³ego dowiadczenia na zbli¿onym do wyjciowego poziomie.
Wyniki odsetka limfocytów CD19 ilustruje tab. 1. Stwierdzono, ¿e najni¿szy odsetek limfocytów CD19 u królików dowiadczalnych wystêpowa³ w 14. dniu po zaka¿eniu tak w odniesieniu do wartoci pocz¹tko-wych, jak i grupy kontrolnej. Po tym czasie obserwo-wano istotny wzrost odsetka limfocytów CD19 w obu grupach dowiadczalnych, z tym, ¿e w grupie I jego rednie wartoci by³y do koñca obserwacji istotnie wy¿sze od wartoci pocz¹tkowej oraz grupy kontrol-nej. Natomiast w grupie kontrolnej odsetek limfo-cytów CD19 utrzymywa³ siê z niewielkimi odchyle-niami na tym samym poziomie przez ca³y okres ob-serwacji.
Z danych tab. 1 wynika, ¿e odsetek limfocytów CD25 u zwierz¹t dowiadczalnych osi¹ga³ najni¿sze rednie wartoci w okresie w pe³ni rozwiniêtych zmian grzybiczych (14. dzieñ po zaka¿eniu) i ró¿nice te by³y istotne w porównaniu do wartoci wyjciowej i grupy kontrolnej. Po tym czasie w obu grupach dowiadczal-nych nastêpowa³ istotny wzrost odsetka limfocytów CD25 i w 41. dniu osi¹ga³ on wartoci maksymalne, z tym, ¿e w grupie I wartoci te by³y wyranie wy¿sze w porównaniu do grupy II. Natomiast w grupie kon-trolnej odsetek limfocytów CD25 utrzymywa³ siê na zbli¿onym poziomie w ci¹gu ca³ego dowiadczenia.
W profilaktyce i terapii grzybic skórnych najlepsze efekty uzyskuje siê po zastosowaniu swoistych bio-preparatów, co potwierdzaj¹ prezentowane wyniki ba-dañ w³asnych, które dotycz¹ leczenia trychofitozy u m³odych królików zaka¿onych dowiadczalnie T. mentagrophytes przy u¿yciu szczepionki Alopevac (6, 7, 12, 13, 15, 18). Do oceny stanu czynnociowego granulocytów oraz zachowania siê subpopulacji lim-focytów T i B u królików zaka¿onych dowiadczalnie T. mentagrophytes i poddanych wakcynoterapii zosta-³a u¿yta metoda cytometrii przep³ywowej (3, 16). Stwierdzono, ¿e kinetyka kszta³towania siê odpowie-dzi immunologicznej u królików zaka¿onych T. men-tagrophytes by³a zwi¹zana z obecnoci¹ klinicznych objawów choroby. Statystycznie istotny spadek aktyw-noci fagocytarnej i bójczej granulocytów oraz odset-ka limfocytów o fenotypie CD3, CD4 i CD25 u króli-ków w okresie w pe³ni rozwiniêtych objawów klinicz-nych wiadczy o supresji odpornoci komórkowej wy-wo³anej wzrostem odsetka limfocytów supresorowych TCD8+, przesuniêciem profilu immunologicznego na
korzyæ komórek Th2 oraz niew³aciwym stosunkiem limfocytów CD4 : CD8, a tak¿e obecnoci¹ grzyba w zmienionej chorobowo skórze i jego bezporednim hamuj¹cym wp³ywem na limfocyty pomocnicze Th1
wytwarzaj¹ce cytokiny bior¹ce udzia³ we wspomaga-niu swoistej odpornoci komórkowej (1, 2, 5, 8).
W okresie samoistnego ustêpowania zmian grzybi-czych w grupie królików tylko zaka¿onych T. menta-grophytes wystêpowa³a doæ cis³a korelacja pomiê-dzy wielkoci¹ odsetka i wzajemnej proporcji limfo-cytów TCD4+ i CD8 oraz odsetka limfocytów TCD4+
posiadaj¹cych cz¹steczkê powierzchniow¹ CD25+.
Mo¿na s¹dziæ, ¿e aktywacja limfocytów przez swo-isty antygen jest bezporednim dowodem, ¿e samoist-ne ustêpowanie zmian grzybiczych u królików zwi¹-zane jest z nasileniem siê swoistej odpowiedzi komór-kowej, która jest stymulowana przez immunologicz-ne mechanizmy systemowe. Stymulowaimmunologicz-ne przez T. mentagrophytes mechanizmy obronne typu komór-kowego przyczyniaj¹ siê do eliminacji zdolnych do na-mna¿ania elementów grzybiczych ze skóry i w efek-cie do wyganiêcia czynnego procesu chorobowego (5, 10, 19).
U królików zaka¿onych dowiadczalnie T. menta-grophytes zastosowanie wakcynoterapii w okresie naj-bardziej nasilonych zmian grzybiczych spowodowa³o szybsze zanikanie klinicznych objawów i wygasanie trychofitozy w porównaniu do zwierz¹t tylko zaka¿o-nych T. mentagrophytes (grupa II). Aplikacja szcze-pionki Alopevac królikom grupy I spowodowa³a istot-ny wzrost wskaników aktywnoci fagocytarnej i me-tabolizmu tlenowego granulocytów w porównaniu do zwierz¹t grupy II oraz kontroli, co wiadczy o silnej stymulacji komórkowych mechanizmów odpornoci nieswoistej. Procent komórek fagocytuj¹cych lub po-budzonych oraz wartoci redniego kana³u fluorescen-cji u królików zaka¿onych i poddanych wakcynotera-pii utrzymywa³y siê na wy¿szym w porównaniu do królików tylko zaka¿onych T. mentagrophytes pozio-mie w ka¿dym terminie badañ, co wskazuje na induk-cjê odpowiedzi uk³adowej. W ostatnim dniu badañ stwierdzono najwy¿sze wskaniki aktywnoci fago-cytarnej i metabolizmu tlenowego w toku ca³ego do-wiadczenia. W tym samym terminie oznaczeñ zano-towano natomiast najni¿szy i istotny spadek odsetka limfocytów TCD8+. Mo¿na przypuszczaæ, ¿e okres
wygasania procesu chorobowego jest zwi¹zany z roz-wojem swoistej odpornoci komórkowej uwarunko-wanej dominacj¹ limfocytów typu CD4+ (Th1) i
zwiêk-szonego stosunku limfocytów CD4 : CD8 (9, 11, 14, 16).
U¿yta w badaniach w³asnych inaktywowana szcze-pionka Alopevac uruchamia³a g³ównie komórkow¹ odpowied immunologiczn¹ typu Th1, o czym wiad-czy istotny wzrost w grupie królików zaka¿onych i poddanych wakcynoterapii odsetka limfocytów T po-siadaj¹cych cz¹steczkê CD3, CD4 i CD25 oraz sto-sunku limfocytów TCD4+ do TCD8+ w porównaniu
do królików tylko zaka¿onych T. mentagrophytes. Dane te stanowi¹ potwierdzenie opinii wielu autorów, i¿ po¿¹dan¹ cech¹ szczepionki przeciwgrzybiczej po jej zastosowaniu jest uruchomienie g³ównie odpornoci
komórkowej zwi¹zanej z rozwojem profilu Th1, w s³a-bym natomiast stopniu indukowanie odpowiedzi hu-moralnej (4, 14, 16).
Wzrost wskaników odpornoci komórkowej u kró-lików grupy I nastêpowa³ ju¿ w trakcie stosowania wakcynoterapii, z tym ¿e uzyskane w tym czasie war-toci by³y istotnie ni¿sze ni¿ w okresie zdrowienia i w pierwszych dniach po wyleczeniu trychofitozy. Mo¿-na s¹dziæ, ¿e aplikacja szczepionki Alopevac zawie-raj¹cej wysoce immunogenne szczepy T. mentagrophy-tes i T. verucosum spowodowa³a zniesienie stanu im-munosupresji u królików z dowiadczaln¹ trychofito-z¹ w wyniku aktywacji limfocytów Th1 warunkuj¹-cych rozwój protekcyjnej odpornoci przeciwgrzybi-czej. W momencie zanikania klinicznych objawów choroby oraz ca³kowitego wyleczenia rednie toci limfocytów CD4 i CD25 osi¹ga³y najwy¿sze war-toci przez ca³y okres prowadzonej obserwacji. Fakt ten mo¿na t³umaczyæ eliminacj¹ z ognisk chorobowych grzyba wywieraj¹cego hamuj¹cy wp³yw na swoist¹ ko-mórkow¹ odpowied immunologiczn¹ oraz domina-cj¹ w tym czasie profilu immunologicznego typu Th1 (najwy¿szy odsetek limfocytów CD4+).
Reasumuj¹c nale¿y stwierdziæ, ¿e w przebiegu do-wiadczalnej trychofitozy królików dochodzi do su-presji komórkowych mechanizmów odpornoci nie-swoistej i nie-swoistej, na co wskazuje spadek aktywno-ci fagocytarnej i metabolizmu tlenowego granulocy-tów, limfocytów CD3, CD4 i CD25 przy jednoczesnym wzrocie odsetka limfocytów supresorowych CD8 w okresie w pe³ni rozwiniêtych objawów klinicznych. W terapii trychofitozy królików celem przywrócenia zaburzonych mechanizmów odpornoci przeciwgrzy-biczej i przyspieszenia ustêpowania zmian grzybiczych z powodzeniem mo¿e byæ stosowana szczepionka Alo-pevac.
Pimiennictwo
1.Calderon R. A., Hay R. J.: Cell-mediated immunity in experimental murine dermatophytosis. II. Adoptive transfer of immunity to dermatophyte infection by lymphoid cells from donors with acute or chronic infections. Immunology 1984, 53, 465.
2.Dahl M. V.: Suppression of immunity and inflammation by products produced by dermatophytes. J. Am. Acad. Dermatol. 1993, 28, 19-23.
3.Deptu³a W., Kostrzewa A., Stosik M., Tokarz-Deptu³a B., Wiktorowicz K.: Sub-populacje limfocytów krwi obwodowej u królików. Nowiny Lekarskie 1998, 67, 377-382.
4.Grappel S. F., Bishop C. T., Blank F.: Immunology of dermatophytes and dermatophytosis. Bacteriol. Rev. 1974, 38, 222-250.
5.Kostro K., Gliñski Z., Wojcicka-Lorenowicz K.: Odczyny immunologiczne w grzybicach skórnych zwierz¹t. Medycyna Wet. 2001, 57, 709-714. 6.Kostro K., Gliñski Z., Wojcicka-Lorenowicz K., Gacek L., Krakowski M.:
Szcze-pionka Alopevac w profilaktyce i terapii trychofitozy królików. Medycyna Wet. 2000, 56, 816-820.
7.Kostro K., Gliñski Z., Wojcicka-Lorenowicz K., Gacek L., Krakowski M.: Wp³yw wczesnego uodporniania osesków królików na wystêpowanie trychofitozy w fermie zapowietrzonej. Medycyna Wet. 2001, 57, 819-823.
8.Kostro K., Gliñski Z., Wojcicka-Lorenowicz K., Nozdryn-P³otnicki Z.: Odpor-noæ przeciwzakana skóry. Medycyna Wet. 2002, 58, 655-660.
9.Kostro K., Wojcicka-Lorenowicz K., Leniewska K., Madany J., Majer--Dziedzic B.: Cytometryczna ocena aktywnoci fagocytarnej i metabolizmu tlenowego granulocytów krwi obwodowej królików z przewlek³¹ trychofitoz¹. Medycyna Wet. 2006, 62, 423-426.
10.Pier A. C., Ellis J. A., Mills K. W.: Development of immune response to experi-mental bovine Trichophyton verrucosum infection. Vet. Dermatol. 1993, 3, 131--136.
11.Romagnani S.: Type 1 T helper and type 2 T helper cells: functions, regulation and role in protection and disease. Int. J. Clin. Lab. Res. 1991, 21, 152-159. 12.Rybnikar A., Chumela J., Vrzal V., Nepereny J.: Vaccination of rabbits against
trichophytosis An experimental study. Acta Vet. Brno 1998, 67, 121-125. 13.Sarkisow A. H., Nikiforow L. I.: Specyficzeskaja profilaktika trichofitii
pusz-nych zwerej. Veterinarija 1981, 7, 37-38.
14.Smith J. M. B., Griffin J. F. T.: Strategies for the development of a vaccine against ringworm. J. Med. Vet. Mycology 1995, 33, 87-91.
15.Wawrzkiewicz J., Wawrzkiewicz K., Sadzikowski Z.: Monowalentna i skojarzo-na szczepionka iskojarzo-naktywowaskojarzo-na w profilaktyce trychofitozy lisów hodowlanych. Medycyna Wet. 1991, 47, 317-322.
16.Wojcicka-Lorenowicz K.: Profil odpowiedzi immunologicznej królików zaka-¿onych Trichophyton mentagrophytes i u królików szczepionych. Praca doktor-ska. Lublin 2006.
17.Wo³oszyn S., Umiñski M.: Aktywnoæ serologiczna i alergiczna trychofityn natywnych oraz oczyszczonych. Medycyna Wet. 1985, 41, 394-398. 18.Wo³oszyn S., Andrychiewicz J., Kostro K., Winiarczyk S., Gr¹dzki Z.:
Skutecz-noæ szczepionek w zwalczaniu grzybic skórnych królików. Medycyna Wet. 1996, 52, 518-524.
19.Woodfolk J. A., Platts-Mills T. A. E.: The immune response to dermatophytes. Res. Immunol. 1998, 149, 436-445.
Adres autora: prof. dr hab. Krzysztof Kostro, ul. Sikorskiego 3/81, 20-814 Lublin
