Widok Pobudzenie ekspresji genu c-fosjako jeden z możliwych warunków powstawania zmian plastycznych w ośrodkowym układzie nerwowym.

K

osmos

PROBLEMY NAUK BIOLOGICZNYCH

Ev g e n i Nik o l a e v

Pracownia Hodowli Komórek i Tkanek, Instytut im. M. Nenckiego PAN ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa

POBUDZENIE EKSPRESJI GENU c-fos JAKO JEDEN Z MOŻLIWYCH WARUNKÓW POWSTAWANIA ZMIAN PLASTYCZNYCH W OŚRODKOWYM UKŁADZIE NERWOWYM

E K S P R E S J A G E N Ó W A P R O C E S Y U C Z E N IA S IĘ

Zjawiska uczenia się i pamięci można roz­ patrywać na wielu poziomach organizacji

ośrodkowego układu nerwowego (OUN) (Zi e l i ń­

s k i 1993, Ko s s u t 1994). Nie ulega jednak wąt­

pliwości, że istotny w nich udział mają oddzia­ ływania między komórkami nerwowymi, a w szczególności siła ich połączeń synaptycznych. Jednym z podstawowych zagadnień poznaw­ czych jest zrozumienie molekularnego podłoża zmian zachodzących na synapsie. Ostatnio szczególnie wiele danych zgromadzono na te­ mat roli fosforylacji i innych potranslacyjnych zmian białek tworzących synapsy w czasie po­

wstawania śladów pamięciowych (Ba i l e y i Ka n-

d e l 1993). Jednakże można się spodziewać, że

trwałość ufosforylowanej postaci białka nie

przekracza kilku godzin (Ba r a ń s k a i współaut.

1994). Natomiast bardziej długotrwałe zmiany w wielu układach biologicznych wymagają

zwiększonej ekspresji genów i biosyntezy no­

wych białek (Ka c z m a r e k i Ka m i ń s k a 1989).

Istnieją liczne dane doświadczalne wskazu­ jące, z jednej strony hamujący wpływ inhibito­ rów syntezy białek i mRNA na tworzenie i utrzy­

manie się śladów pamięciowych (Ma t t h i e s

1989a, b, Ka c z m a r e k 1994), z drugiej zaś strony

wzmożoną syntezę nowych białek i RNA jako konsekwencję pobudzenia ekspresji pewnych

genów w procesach uczenia się (Ma t t h i e s

1989a, b). W odniesieniu do udziału genów w procesach uczenia się i pamięci najwięcej da­ nych zgromadzono do tej pory na temat tak zwanych genów odpowiedzi wczesnej IEG (im­ mediate early genes). Obecnie znanych jest już kilkadziesiąt genów z tej grupy, wśród których bardzo dużym zainteresowaniem cieszy się pro- toonkogen c-fos.

F U N K C J O N A L N E Z N A C Z E N IE G E N U c-fos Nazwa „fos” pochodzi od nazwiska jednego

z grupy badaczy angielskich (Finkel-Biskis-Jin- kins) oraz opisanego przez nich retrowirusa wywołującego mięsaka kości (ang. murine osteogenic sarcoma). Jak się okazało, jedną z przyczyn, doprowadzających do zachorowania,

jest onkogen wirusowy (v-fos, viral-fos) (Cu r r a n

i Te i c h 1982, Mo r g a n i Cu r r a n 1991a). W

materiale genetycznym komórek prawidłowych występuje gen bardzo podobny do genu ufos. Gen ten, określony jako protoonkogen c-fos (od ang. cellular — komórkowy), nie posiada cechy złośliwości.

Podstawowy poziom mRNA c-fos, jak i białka c-Fos jest niewysoki w większości typów komó­ rek. Ulega on jednak gwałtownemu, choć krót­ kotrwałemu zwiększeniu po różnorakim pobu­

dzeniu (Ka c z m a r e k i Ka m i ń s k a 1989). Ustalono,

że czas półtrwania mRNA c-fos wynosi około

12-15 minut (Mo r g a n i Cu r r a n 1991a, Ed­

w a r d s 1994). Białko c-Fos, powstające w wyni­

ku ekspresji protoonkogenu c-fos, jest rozpusz­ czalne i gromadzone w jądrze komórkowym. Czas półtrwania tego białka też nie jest długi i

wynosi około dwóch godzin (Mo r g a n i Cu r r a n

1991a). Nie do końca jest znany mechanizm regulacji ekspresji genu c-fos, choć warto zwró­ cić uwagę, że białko c-Fos może uczestniczyć w negatywnej autoregulacji aktywności własnego

genu (Ed w a r d s 1994, Ro b e r t s o n i współaut.

1995).

Zasadnicza funkcja białka c-Fos wyraża się przez jego udział w czynniku transkrypcyjnym AP-1 (activator protein 1). AP-1 jest dimerem

białkowym, składającym się z białek rodziny Fos (znanych jest przynajmniej czterech człon­ ków tej rodziny: c-Fos, Fos B, Fra-1 i Fra-2) oraz białek rodziny Jun (c-Jun, Jun B, Jun D). Czynniki transkrypcyjne łączą się ze swoistymi dla siebie sekwencjami różnych genów, wpływa­ jąc na ich ekspresję. Uważa się, że są w ten

sposób zdolne do koordynacji daleko idących zmian w komórce, zależnych od modulacji czyn­ ności genomu.

Można się więc spodziewać, że równie waż­ ną, regulatorową rolę spełnia w komórkach pro­

dukt ekspresji protoonkogenu c-fos. W istocie,

podwyższona jego ekspresja jest obserwowana w wielu sytuacjach fizjologicznych, na przykład w okresie pobudzenia komórek spoczynkowych do podziału komórkowego, indukcji procesu różnicowania, stymulacji komórek końcowo

zróżnicowanych (K a c z m a r e k i K am iń ska 1989).

Co więcej, wykazano również funkcjonalny udział białka c-Fos w niektórych z tych proce­ sów. Na przykład swoiste zahamowanie ekspre­ sji tego genu lub podanie przeciwciała anty-c- -Fos do komórek w okresie przejścia Go-S w

cyklu komórkowym blokuje ten proces (p. A n ­

g e l i K a r in 1991, K a c z m a r e k i K am iń ska 1989).

E KSPR ESJA C-fos W KOM ÓRKACH NERW OW YCH

E K S P R E S JA C-fos W K O M Ó R K A C H PC 12

W badaniach zależności ekspresji genów od czynników ją wywołujących, przeprowadzo­ nych na komórkach szczurzej linii nowotworu rdzenia nadnerczy (PC 12), zwrócono uwagę, że komórki potraktowane czynnikiem wzrostu nerwów (NGF) przestają się dzielić i różnicują

się w kierunku neuronów (G r e e n e i T i s c h l e r

1982). Stwierdzono, że procesowi temu towa­ rzyszy pobudzenie ekspresji różnych genów od­ powiedzi wczesnej, w tym i protoonkogenu c-fos

(C u r r a n i M o r g a n 1985, G r e e n b e r g i współaut.

1985, K r u i j e ri współaut. 1985). Wzór ekspresji

c-fos, odnotowany w przypadku różnicowania

się komórek PC 12, jest bardzo podobny do obserwowanego w innych procesach aktywacji komórek, cechując się raptownym wzrostem poziomu mRNA i szybkim jego spadkiem do wartości wyjściowych. Trzeba dodać, że w już zróżnicowanych komórkach PC 12 ekspresję

c-fos można pobudzić poprzez depolaryzację

błony komórkowej ( G r e e n b e r g i współaut.

1986, M o r g a n i C u r r a n 1986, K r u i j e r i współ­ aut. 1985) za pomocą agonistów receptorów

nikotynowych ( G r e e n b e r g i współaut. 1986),

analogów cAMP ( G r e e n b e r g i współaut. 1985,

K r u i j e r i współaut. 1985), a także innych czyn­ ników. Seria doświadczeń nad komórkami

P C 12 stanowiła wstęp i dobre uzasadnienie badań ekspresji genów w komórkach nerwo­ wych ośrodkowego układu nerwowego.

E K S PR E S JA C-fos W K O M Ó R K A C H H O D O W LI N E U R O N A LN E J

Podstawowym neuroprzekaźnikiem pobu­ dzającym w ośrodkowym układzie nerwowym kręgowców jest glutaminian lub jego analogi — aminokwasy pobudzające (excitatory amino

acids — E A A ) (G ła ż e w s k i 199 2). Wśród recep­

torów EAA szczególne znaczenie dla powstawa­ nia i utrzymania się zmian plastycznych w ukła­ dzie nerwowym mają zaś receptory NMDA (od nazwy ich agonisty — kwasu IV-metylo-D-aspa-

raginowego) (G ła ż e w s k i 1992, M a y e r i W e s t ­

b r o o k 1987, M a c D e r m o t t i D a l e 1987, N o w a k

i współaut. 1984, S ie r o c iń s k a i współaut.

1991). Wiadomo, że aktywacja receptorów dla glutaminianu wywołuje całą kaskadę zmian, zachodzących w komórce po jej stymulacji, któ­ ra może doprowadzić do pobudzenia ekspresji różnych genów, w tym i protoonkogenu c-fos. Podanie, na przykład, agonistów receptorów dla glutaminianu do hodowli astrocytów wywołuje

indukcję ekspresji c-fos ( C o n d o r e l l i i współaut.

1989, 1993). Bardzo podobny efekt ma potra­ ktowanie glutaminianem lub NMDA neuronów

kory i prążkowia in vitro (M u rp h y i współaut.

1991a, V a c c a r in o i współaut. 1991, C o n d o r e l ­ l i i współaut. 1994). P r a w d o p o d o b n ie ró ż n e r e c e p t o r y d la g lu t a ­ m in ia n u m o g ą u c z e s tn ic z y ć w p o b u d z e n iu e k s ­ p r e s ji c-fos, n a c o w s k a z u ją w y n ik i V a c c a r in o i w s p ó ł a u t o r ó w (1 9 9 1 ) o r a z CONDORELLiego i w s p ó ła u to r ó w (1 9 9 4 ) o tr z y m a n e z h o d o w li n eu - r o n a ln y c h . M u r p h y i w s p ó łp r a c o w n ic y (1 9 9 l b ) w d o ś w ia d c z e n ia c h p r z e p r o w a d z o n y c h n a d łu ­ g o tr w a ły c h h o d o w la c h n e u r o n ó w s tw ie r d z ili, że z a a k ty w a c ję c-fos j e s t o d p o w ie d z ia ln a s p o n ta ­ n ic z n a d e p o la r y z a c ja b ło n y k o m ó r k o w e j, w k t ó ­ rej u c z e s t n ic z ą r e c e p t o r y t y p u K/A (o d n a z w a g o n is tó w : k a in ia n u i AMPA — a lfa -a m in o -3 - h y d r o k s y - 5 - m e t y lo - 4 - iz o k s a z o lo p r o p io n o w e g o ). J e s z c z e w c z e ś n ie j, S z e k e l y z e w s p ó łp r a c o w n i­ k a m i (1 9 8 7 , 1989), b a d a ją c p o b u d z e n ie e k s p r e ­ s ji c-fos w z ia r n is t y c h k o m ó r k a c h m ó ż d ż k u in vitro p o ic h s t y m u la c ji g lu t a m in ia n e m lu b NMDA, w y k a z a li w z r o s t in d u k c ji b a d a n e g o g e ­ n u . E k s p r e s ja t a m o ż e b y ć c a łk o w ic ie z a b lo k o ­ w a n a p o p r z e z d o d a n ie je d n e g o z a n t a g o n is t ó w r e c e p t o r ó w NMDA — APV (k w a s a m in o 5 fo s fo

-nowalerianowy). Ci sami autorzy (Sz e k e l y i

współaut. 1990) udowodnili, że w warunkach

opisanych powyżej równolegle z akumulacją

mRNA c-foswystępuje gromadzenie mRNA in­

nych genów, a mianowicie: c-junJun-Bi zif268.

Podanie CPP i PCP (antagonistów receptorów NMDA) całkowicie hamuje ekspresję wszy­ stkich tych genów. Natomiast dodanie CNQX (antagonisty receptorów dla glutaminianu z grupy nie NMDA) nie ma znaczącego wpływu na

gromadzenie mRNA c-fosi c-jun, spowodowane

glutaminianem (B a d in g i współaut. 1995).

E K S P R E S J A C-fos W M Ó Z G U IN VIVO

Jednocześnie z prowadzeniem badań nad ekspresją różnych genów odpowiedzi wczesnej w hodowlach neuronalnych zastanawiano się, czy podobne zjawisko występuje w mózgu żywe­ go zwierzęcia. Można było sądzić, że aktywacja genów w mózgu także może być związana z pobudzeniem receptorów dla glutaminianu. Istotnie wykazano, że podanie glutaminianu bezpośrednio do mózgu szczura, w okolice hi- pokampa, wywołuje bardzo wyraźny ale przej­

ściowy wzrost poziomu mRNA c-fosw tej stru­

kturze (Ka c z m a r e k i współaut. 1988). Trzeba

jednak dodać, że iniekcja soli fizjologicznej, przeprowadzona dokładnie w taki sam sposób i zastosowana jako kontrola dla glutaminianu, też doprowadza do pobudzenia ekspresji c-fos

tyle, że w mniejszym stopniu (Ka c z m a r e k i

współaut. 1988). Stwierdzono również, że ob­ wodowe podanie NMDA powoduje nagromadze­

nie mRNA c-fosw wielu regionach mózgu szczu­

ra z tym, że w zakręcie zębatym hipokampa i korze śródwęchowej wzrost ten jest największy

(Mo r g a n i Li n n o i l a 1991). Podobne dane o akty­

wacji ekspresji c-fos w hipokampie szczura, w

wyniku iniekcji NMDA, zostały otrzymane przez

So n n e n b e r g i współpracowników (1989b). Za­

stosowanie zaś antagonistów receptorów NMDA hamuje ekspresję mRNA i białka c-Fos, wystę­ pującą w mózgu na poziomie podstawowym

(W ORLEY i współaut. 1990). Dane te wskazują na istotny związek pomiędzy receptorami NMDA a ekspresją protoonkogenu c-fos.

Podanie szczurom i myszom innego agoni- sty receptorów dla glutaminianu-kainianu, wywołującego u zwierząt drgawki podobne do epileptycznych oraz neurodegenerację, powo­ duje bardzo silny wzrost poziomu mRNA c-fos

w mózgu tych zwierząt (So n n e n b e r g i współaut.

1989b, Mo r g a n i Cu r r a n 1991b). Podobnie jak

w przypadku podania NMDA, największą aku­

mulację mRNA c-fos obserwowano w hipokam­

pie i w korze śródwęchowej. Wykazano także, że

po wzroście ekspresji protoonkogenu c-fos, na­

stępuje wzmożona synteza jego białka (Le Ga l

La Sa l l e, 1988, Po p o v i c i i współaut. 1990, Pe n n y p a c k e r i współaut. 1993, Sa k u r a i-Ya m a s- h i t a i współaut. 1991). Zwrócono także uwagę

na zmiany w poziomie aktywności dimeru biał­ kowego AP-1 w mózgu zwierząt poddanych działaniu kwasu kainowego. Stwierdzono, że w ciągu kilku godzin po podaniu kainianu wystę­ puje pierwszy szczyt wzrostu poziomu wiązania

się AP-1 z DNA (So n n e r b e r g i współaut. 1989a,

Pe n n y p a c k e r i współaut. 1993). Następnie zaś

wykazano istnienie także drugiej fali wzrostu aktywności AP-1, która następuje po trzech dniach od chwili potraktowania zwierząt ka-

inianem (Ka m i ń s k a i współaut. 1994).

Sztuczne wywoływanie drgawek padaczko- podobnych u zwierząt jest często stosowane w badaniach nad zmianami plastycznymi zacho­ dzącymi w mózgu po takim wstrząsie. Drgawki te mogą być wywołane w różny sposób i różnymi środkami. Jednym z środków chemicznych wprowadzającym zwierzęta w stan drgawkowy jest pentylenetetrazol (metrazol) (antagonista receptorów GABAa). Podany dootrzewnowo me­ trazol bardzo szybko, w ciągu 5-10 minut, wy­ wołuje napady drgawkowe, które mogą trwać do

30 minut (Mo r g a n i współaut. 1987). Stwier­

dzono, że w wyniku tych napadów w mózgu zwierząt gromadzi się mRNA różnych genów,

również mRNA c-fos(Mo r g a n i współaut. 1987,

199la, b). Obserwowano kilkakrotny wzrost

poziomu ekspresji c-fosw porównaniu z pozio­

mem jego ekspresji u zwierząt kontrolnych (do­ otrzewnowe podanie soli fizjologicznej). Także i w tym przypadku wzór pobudzenia ekspresji

c-fos jest podobny do spowodowanego poda­

niem NMDA. Wiadomo, że wywołaną metrazo-

lem ekspresję c-fos można całkowicie lub czę­

ściowo zablokować, stosując znane środki prze- ciwdrgawkowe, takie jak diazepam i kwas wal- proinowy lub APV i MK-801, co dowodzi udziału

receptorów NMDA w tym procesie (So n n e n b e r g

i współaut. 1989b). Wykazano także zwiększo­ ną immunoreaktywność na białko c-Fos i wzrost poziomu AP-1 w różnych obszarach mózgu zwierząt w dwie godziny po napadach

drgawkowych (Cu r r a n i Mo r g a n 1987, So n n e n­

b e r g i współaut. 1989a, Sh e h a b i współaut.

1993, Lu k a s i u k i Ka c z m a r e k 1994). Znany jest

także fakt, że agonista kanałów wapniowych, wykorzystywany jako środek owadobójczy, gamma-heksachlorocykloheksan (lindane), po­ dany dootrzewnowo, także wywołuje drgawki padaczkopodobne, w wyniku których zanoto­

wano podwyższoną ekspresję c-fos w korze i

obszarze hipokampalnym szczurów (Ve n d r e l l

Stwierdzono także, że w przypadku rozsze­ rzającej się depresji (spreading depression), na skutek której występują u zwierząt drgawki padaczkopodobne, poziom ekspresji c-fos jest

podwyższony (He r r e r ai współaut. 1990a, Mo r­

g a n i Cu r r a n 199 lb, Ma g g i o i Ro b e r t s o n

1993). Dootrzewnowa iniekcja bikukuliny rów­ nież wywołuje u szczurów drgawki padaczkopo­ dobne, po których wykazano wzmożoną reakcję wiązania przeciwciał do białka c-Fos w mózgu

tych zwierząt (He r d e g e n i współaut. 1993).

Także po drgawkach spowodowanych zastoso­ waniem elektrowstrząsu (40 mA, 1 s), obserwu­ je się zwiększoną immunoreaktywność na biał­

ko Fos (Sh e h a b i współaut. 1993).

Mechanizmów fizjologicznych doprowadza­ jących do powstawania drgawek padaczkopo-

dobnych może być kilka, ale ich wspólną cechą jest zmiana (w różny sposób) przenikliwości błony komórkowej neuronów dla jonów wapnia. Uczestniczą w tym różne receptory i kanały wapniowe. Wapń, wchodząc do komórki, dopro­ wadza do depolaryzacji błony neuronu i gene­ racji na niej potencjałów czynnościowych. Og­

nisko padaczkowe powstaje jednocześnie w wie­ lu neuronach i bardzo szybko może się rozpo­ wszechnić na cały mózg. Po takim zajściu w obszarach mózgu objętych stanem padaczko­ wym obserwuje się podwyższoną ekspresję pro- toonkogenu c-fos.

Także w innych, zupełnie odmiennych sytu­ acjach doświadczalnych, takich jak ogólne lub

miejscowe niedotlenienie mózgu (He r r e r a i Ro­

b e r t s o n 1989, No w a k i współaut. 1990, We l s h

i współaut. 1992, Ki e s s l i n g i współaut. 1993)

podanie niektórych neuropeptydów (Gi r i i

współaut. 1990, Im a k ii współaut. 1993), stymu­

lacja bólowa (Bi r d e ri De- Gr o a t 1993), unieru­

chomienie zwierząt (Se n b a i współaut. 1993),

podanie agonistów dla receptorów dopamino-

wych (Ro b e r t s o n i współaut. 1991), uszkodze­

nia nerwów, szlaków nerwowych lub struktur

mózgu (He r r e r a i Ro b e r t s o n 1990b, Ch e n i

Hi l l m a n 1992, Mo l a n d e r i współaut. 1992, He r d e g e n i współaut. 1993) a także w wyniku

stymulacji sensorycznej (Hu n t i współaut.

1987) stwierdza się wzrost ekspresji protoonko- genu c-fos w OUN.

E KSPR ESJA C -fo s W PROCESACH PLASTYCZNOŚCI NE URO NALNEJ

PLA S T YC ZN O Ś Ć N E U R O N A L N A JA K O C E C H A U KŁA D U N E R W O W E G O

Plastyczność jest cechą układu nerwowego, która określa jego zdolność do ulegania względ­ nie trwałym zmianom strukturalnym pod wpły­ wem przetwarzanych informacji. Pojęcie to po raz pierwszy tak ściśle zdefiniował i wprowadził

w życie polski neurofizjolog, J. Ko n o r s k i (1948).

Według Konorskiego własność, dzięki której

w określonych układach neuronów powstają trwałe przekształcenia funkcjonalne w wyniku określonych bodźców lub ich kombinacji, bę­ dziemy nazywać plastycznością, a odpowiada­ jące im zmiany, zmianami plastycznymi...” (cyt. za Że r n ic k im 1994). W istocie, pod zmianami

strukturalnymi powstającymi w układzie ner­ wowym po działaniu bodźców zewnętrznych ro­ zumiemy zmiany w przewodnictwie synaptycz­ nym neuronów OUN, spowodowane przekształ­ ceniami samych synaps lub reorganizacji ich liczby.

E K S PR E S JA C-fos SP O W O D O W A N A KIN D LIN G IE M

Mechanizmy różnych form plastyczności neuronalnej u zwierząt próbuje się poznać już od kilkudziesięciu lat, wykorzystując różne sy­ tuacje modelowe. Jednym z tych modeli jest

zjawisko kindlingu (nazywanego inaczej roznie­ caniem), które można określić jako postępujący wzrost odpowiedzi neuronalnych w następstwie słabego, przerywanego drażnienia niewielkiego obszaru mózgu. Bodźcem inicjującym może być drażnienie elektryczne, chemiczne, metabo­ liczne lub czuciowe. W większości doświadczeń stosuje się drażnienie elektryczne, które najła­ twiej można kontrolować. W praktyce technika kindlingu polega na codziennym drażnieniu określonej struktury mózgu słabym bodźcem elektrycznym, który nie wywołuje widocznych zmian w zachowaniu się zwierząt a tylko ślado­ we bioelektryczne wyładowania następcze w mózgu. Po kilkunastu podobnych drażnieniach wyładowania następcze robią się coraz dłuższe i zaczynają promieniować do coraz większych obszarów mózgu, obejmując je w końcowej fazie kindlingu bioelektrycznymi wyładowaniami padaczkowymi. Wyładowaniom tym towarzyszą toniczno-kloniczne napady padaczkowe. Trze­ ba dodać, że po dostatecznie długim stosowaniu cyklicznego drażnienia mózgu napady padacz­ kowe mogą występować „samoistnie”, bez po­ przedzającego drażnienia elektrycznego.

Istotną cechą kindlingu jest to, że zmiany plastyczne, zachodzące w mózgu w wyniku drażnienia, utrzymują się przez bardzo długi czas. Możliwe, że podstawą tak długo utrzymu­ jących się zmian w plastyczności neuronalnej

ośrodkowego układu nerwowego jest zaangażo­ wanie w kindlingu aparatu genetycznego komó­ rek nerwowych. W istocie, w doświadczeniach

przeprowadzonych przez D r ą g u n o w a i R o b e r ­

t s o n a (1 9 8 7 ), jak również S im o n a tu i współpra­

cowników (1 9 9 1 ) stwierdzono istotny wzrost

poziomu mRNA c-fos w hipokampie szczurów po kindlingu. Podobne wyniki, wykazujące wzmo­ żoną ekspresję protoonkogenu c-fos po drga­ wkach spowodowanych kindlingiem, otrzymał

T e s k e y i współpracownicy (1 9 9 1 ), wykorzystu­ jąc do powstawania kindlingu elektryczne draż­ nienie ciała migdałowatego. W półkuli nie pod­ danej drażnieniu i, wobec tego, pozbawionej wyładowań następczych, poziom pobudzenia ekspresji c-fos był podobny do poziomu c-fos w półkuli drażnionej, co mogłoby świadczyć o nie­ zależności występowania ekspresji genu c-fos od lokalizacji pojawienia się wyładowań nastę­ pczych. Wykazano także, iż poziom ekspresji c-fos podniesiony w wyniku kindlingu spadał do wartości wyjściowych w ciągu trzech tygodni od

zaprzestania drażnienia (T e s k e y i współaut.

1991).

C l a r k i współautorzy (1 9 9 1 ) stwierdzili, że

pobudzenie genu c-fos w różnych obszarach obu półkul mózgu szczurów jest zależne od stadiów powstawania kindlingu. W szczególno­ ści podwyższona ekspresja c-fos występowała w początkowym okresie wytwarzania reakcji. Zbadali ponadto ekspresję genu c-fos w mózgu szczurów w kilku odmiennych sytuacjach do­ świadczalnych, a mianowicie: po jednorazowym podaniu drgawkogennej dawki kokainy, po pierwszym wystąpieniu drgawek padaczkopo- dobnych spowodowanych kindlingiem kokai- nowym i u zwierząt poddanych procesowi kind­ lingu przed wystąpieniem pierwszych drgawek padaczkopodobnych. Stwierdzono, że istotny wzrost poziomu c-fos mRNA był obserwowany tylko u szczurów po jednorazowym podaniu drgawkogennej dawki kokainy i po pierwszym wystąpieniu drgawek spowodowanych kindlin­ giem kokainowym.

Zastosowanie antagonistów receptorów NMDA poprzedzające występowanie drgawek spowodowanych kindlingiem istotnie zmniej­ szało wzrost poziomu mRNA c-fos w ziarnistych komórkach zakrętu zębatego hipokampa szczu­ rów (La b in e r i współaut. 199 3), co wskazuje na udział receptorów NMDA w tym procesie.

Ostatnio W a t a n a b e i współautorzy (1 9 9 6 )

zwrócili uwagę na funkcjonalny udział c-fos w kindlingu, wykazując, że u myszy pozbawio­ nych czynnego genu w wyniku homologicznej rekombinacji (knock-out) kindling jest poważ­ nie zaburzony.

D ŁU G O TR W A ŁE w z m o c n i e n i e s y n a p t y c z n e a e k s p r e s j a c-fos

LTP ja k o m odel plastyczności neuronalnej

Jedną z najlepiej poznanych form plastycz­ ności, bardzo często wykorzystywaną w bada­ niach nad istotą tej cechy układu nerwowego i traktowaną jako model procesu uczenia się

(Ba il e yi Ka n d e l 199 3), jest zjawisko długotrwa­ łego wzmocnienia synaptycznego (ang. long

term potentiation — LTP) (Bl is s i Lo m o 1973,

Bl is s i Ga r d n e r-Me d w in 197 3). Zjawisko LTP, które może być wywoływane w różnych obsza­ rach mózgu, w tym i w hipokampie, jest oparte o różne mechanizmy. Szczególnie wiele danych zgromadzono na temat wytwarzania LTP w za­ kręcie zębatym i polu CA1 hipokampa gryzoni. Powstawanie LTP w zakręcie zębatym hipokam­ pa zachodzi w rezultacie krótkiego, wysoko- częstotliwościowego drażnienia (tzw. tetaniza- cji) wiązki przeszywającej (ang. perforant path). Przyjmuje się, że drażnienie takie doprowadza do zmian plastycznych w połączeniach między neuronami piramidowymi kory śródwęchowej a komórkami ziarnistymi zakrętu zębatego. Sto­ sując ten model badawczy wykazano, że u zwie­ rząt swobodnie się poruszających, nie podda­ nych znieczuleniu w czasie tetanizacji, zjawisko LTP może się utrzymywać przez bardzo długi okres (nawet do kilku miesięcy). Trzeba podkre­ ślić, że nawet w takich warunkach można uzy­ skać LTP o różnej trwałości w zależności od sposobu drażnienia. Jedynie powtarzanie serii tetanizacji prowadzi do efektu naprawdę długo­

trwałego (Kr u g i współaut. 1989, Dr a g u n o w i współaut. 1989, Je f f e r yi współaut. 1990, Ka­ c z m a r e k 1 992 Wo r l e y i współaut. 1993, De- m m e r i współaut. 1993, Ab r a h a m i współaut. 1993, Nh u y e ni współaut. 1994, Hu a n gi współ­ aut. 1994). Ekspresja genów a LTP

Wiadomo, że wzmożone przewodnictwo sy­ naptyczne jest w stanie utrzymywać się przez bardzo długi okres. Możliwe, że u podstaw ta­ kich długotrwałych zmian plastyczności neuro­ nalnej spowodowanych tetanizacją, znajduje się zmieniona ekspresja określonych genów.

Istotnie, Dr a g u n o w i współautorzy (1 9 8 9 ) wy­

kazali wzrost ekspresji białka protoonkogenu c-fos w zakręcie zębatym hipokampa po wywo­ łaniu LTP. Badając wpływ sposobu tetanizacji autorzy ci stwierdzili, że podwyższenie poziomu białka c-Fos w ziarnistych komórkach hipo­ kampa występuje w wyniku zastosowania draż­

grup impulsów o częstotliwości 400 Hz prze­ dzielonych 20-sekundowymi przerwami. Nato­ miast zastosowanie tetanizacji o tej samej czę­ stotliwości ale skumulowanej w jednym zesta­ wie drażnień, mimo iż prowadzi do LTP, nie wywołuje jednak wzrostu ekspresji c-Fos. Nie wykazano immunoreaktywności do c-Fos także u zwierząt kontrolnych, u których stosowano drażnienie o niskiej częstotliwości, jak też i w przypadku drażnienia wysokoczęstotliwego przy zablokowanych receptorach NMDA oraz tetanizacji prowadzonej w warunkach ostrych, to jest u zwierząt znajdujących się pod wpływem

środków znieczulających. Co l e i współautorzy

(1989) obserwowali u około połowy badanych zwierząt wzrost poziomu mRNA c-fos w ziarnis­ tych komórkach zakrętu zębatego hipokampa towarzyszący LTP. Trzeba dodać, że i w tym przypadku tetanizację zastosowano u zwierząt

swobodnie się poruszających. Podobnie Je f f e­

r y i współpracownicy (1990) badając LTP u

zwierząt swobodnie się poruszających wykazali zwiększoną obecność białka c-Fos w komór­ kach ziarnistych hipokampa. Trzeba podkre­ ślić, że obecność białka c-Fos lub mRNA c-fos wykrywano jedynie po takim drażnieniu, które prowadziło do wzmocnienia synaptycznego, trwającego co najmniej kilka tygodni, (patrz

także: De m m e r i współaut. 1993, Ab r a h a m i

współaut. 1993, Wo r l e y i współaut. 1993, Wis-

d e n i współaut. 1990, Sc h r e i b e r i współaut.

1991). Wydaje się, że wyniki większości donie­ sień z ostatnich lat dowodzą, że długotrwałe wzmocnienie synaptyczne, w zależności od spo­ sobu drażnienia, można podzielić na trzy rodza­ je różniące się między sobą czasem trwania: LTP1 trwające nie więcej niż kilka godzin, LTP2 utrzymujące się do kilku dni i LTP3, które da się wykryć nawet po kilku tygodniach. Ekspre­ sja genu c-fos towarzyszy w sposób powtarzalny tylko LTP3 (p. Bl i s s i Co l l i n g r i d g e 1993).

Można zatem sądzić, że mechanizmy odpo­ wiadające zarówno za powstawanie kolejnych faz LTP, jak i za ich utrzymanie, są różne. Ponieważ wykazano, że tylko w okresie powsta­ wania LTP3 zachodzi wzmożona biosynteza bia­ łek (Fr e y i współaut. 1988, Kr u g i współaut.

1984, Ma t t h i e s 1989b, Ot a n i i Ab r a h a m 1989),

można przypuszczać, że podstawą tego najdłu­ żej utrzymującego się rodzaju wzmocnienia przewodnictwa synaptycznego (LTP3) jest po­ budzenie genomu. Dlatego też celem naszego doświadczenia, które zostało wykonane w pra­ cowni H. Matthies’a w Akademii Medycznej w Magdeburgu, było zbadanie, czy wywoływanie długotrwałego wzmocnienia synaptycznego (ściślej LTP3) doprowadza do zwiększonej eks­ presji genu c-fos w mózgu szczurów. Istotną rolę

w wyborze miejsca przeprowadzenia doświad­ czenia odegrał fakt, że w tej pracowni w sposób powtarzalny otrzymywano LTP o najdłuższym

czasie trwania (Kr u g i współaut. 1984). Warun­

kiem uzyskiwania tak długiego LTP było zasto­ sowanie czterech serii drażnień wiązki przeszy­ wającej u zwierząt swobodnie się poruszają­ cych.

W wyniku doświadczenia wykazano, że je ­ dynie w odstępie 45 min od rozpoczęcia tetani­ zacji dochodzi do ekspresji genu c-fos w hipo- kampie szczurów. Co więcej, wykryto wzrost pobudzenia tego genu w korze śródwęchowej w 45 min i 90 min po tetanizacji. Natomiast w 6 godz. i 24 godz. po tetanizacji, jak i po stymu­ lacji niskoczęstotliwej (kontrolnej) nie stwier­ dzono wzrostu poziomu c-fos mRNA tak w hipo-

kampie, jak i w korze śródwęchowej (Ni k o l a e v

i współaut. 1991).

E K S P R E S J A C-fos W PR O C E SA C H PLA S T YC ZN O Ś C I K O R Y

M Ó ZG O W E J — P LA S T YC Z N O Ś Ć R O ZW O JO W A , O K R E S Y K R Y T Y C ZN E

Dobrym modelem badawczym zmian plasty­ cznych OUN wydają się być procesy postnatal - nego rozwoju kory mózgowej, w szczególności w tak zwanych okresach krytycznych. Szczegól­ nie dobrze są poznane zmiany plastyczne w korze czuciowej, zwłaszcza w korze wzrokowej. U kota okres krytyczny rozwoju kory wzrokowej jest obserwowany od 4 do 10 tygodni życia

(Hu b e l i współaut. 1977). U szczura podobny

okres występuje około 20-40 dnia po urodzeniu

(Fa g g i o l i n i i współaut. 1994). W tym czasie

połączenia międzyneuronalne są szczególnie podatne na zmiany plastyczne, które mogą ulec utrwaleniu aż do końca życia zwierzęcia. Szereg danych wskazuje, że podłoże komórkowe i mo­ lekularne tych zmian jest zbliżone do podłoża

procesów uczenia się i pamięci (Ka n d e l i

O ’De l l, 1992, Ka c z m a r e k 1993). O podobnym

podłożu rozwojowych zmian plastycznych oraz procesów uczenia się i pamięci świadczy między innymi fakt, że jedne i drugie zależą od aktywa­

cji receptorów NMDA (Co l l i n r i d g e i Si n g e r

1990, Kl e i n s c h m i d t i współaut. 1987). Ponadto

zarówno w procesach rozwojowych, jak i w cza­ sie uczenia się jest wymagane pobudzenie eks­

presji genów (Ka n d e l i O ’De l l 1992).

Wykazano, że okresom krytycznym towa­ rzyszy podwyższona ekspresja określonych ge­ nów kodujących czynniki transkiypcyjne, mię­

dzy innymi genu c-fos (Mo w e r 1994, Ka m i ń s k a

i współaut. 1995, Ka p l a n i współaut. 1996.

Poziom mRNA c-fos w korze wzrokowej kota znacząco wzrasta pomiędzy pierwszym a pią­ tym tygodniem życia, po czym utrzymuje się na

bardzo wysokim poziomie do dwudziestego tygodnia życia i następnie spada po przejściu

tego okresu (McCo r m a c k i współaut. 1992). Co

więcej, wzór ekspresji białka c-Fos w warstwach kory wzrokowej kotów pięciotygodniowych róż­ ni się od podobnego wzoru w korze wzrokowej

kotów dorosłych ( Mo w e r 1994). U zwierząt

znajdujących się w okresie krytycznym stymu­ lacja wzrokowa pobudza wzrost immunore- aktywności c-Fos we wszystkich warstwach ko­ ry wzrokowej, a u starszych kotów jedynie w warstwie IV. Wskazuje to na szczególny chara­ kter aktywności genu c-fos w okresie krytycz­ nym. Efekty plastyczności rozwojowej często są badane techniką deprywacji czuciowej, która polega na pozbawieniu zwierząt dopływu okre­ ślonej modalności sensorycznej. W doświadcze­ niach z deprywacją wzrokową przeprowadzoną na kotach w wieku 5 tygodni stwierdzono wyraźny wzrost ekspresji genu c-fos, jak rów­

nież i innych genów po wystawieniu zwierząt na

światło (Ro s e n i współaut. 1992). Wynik ten

wskazuje na zależność ekspresji genów od

bodźca wzrokowego. Wo r l e yi współpracownicy

(1991) wykazali z kolei, że w korze wzrokowej dorosłych szczurów na ekspresję niektórych genów, w tym i c-fos, ma wpływ aktywacja

receptora NMDA. Ka m i ń s k a i współautorzy

(1996) wykazali, że wzrostowi białka c-Fos, wy­ wołanemu przez bodziec czuciowy w korze wzrokowej dorosłych szczurów, towarzyszy na­ gromadzenie się czynnika AP-1. W podsumowa­ niu danych dotyczących poziomu i wzoru eks­ presji c-fos z jednej strony a rozwojem koiy wzrokowej oraz dopływem informacji czuciowej z drugiej strony, można stwierdzić, że istnieje interesująca, choć ciągle nie wyjaśniona, kore­

lacja między tymi zjawiskami (Ka c z m a r e k i

Hh a u d h u r i 1997).

EKSPR ESJA c-fos W YW O ŁAN A TRE NIN G IEM BEHAW IORALNYM

W badaniach ekspresji c-fos w procesach

uczenia się An o k h i n i współpracownicy (1991)

wykorzystali naturalną skłonność kurcząt do dziobania. W teście biernego unikania, w któ­ rym pierwszy kontakt z przedmiotem o gorzkim smaku powoduje unikanie dziobania podobne­ go przedmiotu w przyszłości, autorzy ci zbadali nabywanie reakcji biernego unikania u jedno­ dniowych kurcząt, wykazując przy tym, że pro­ cesowi temu towarzyszy podwyższona ekspre­ sja genu c-fos w mózgu ptaków.

W innym eksperymencie, przeprowadzonym

przez ten sam zespół badawczy (An o k h i n i Ro s e

1991) również na kurczętach jednodniowych, wykorzystano test różnicowania wzrokowego. Doświadczenie to składało się z dwóch faz: uczenia się i testu. Uczenie się polegało na umieszczeniu kurcząt w nowym środowisku, cechującym się podłogą pokrytą żwirem. W jed­ nej z grup zwierząt żwir ten był pomieszany z pokarmem. Test, zastosowany następnego dnia po treningu, polegał na tym, że część kurcząt traktowano dokładnie tak samo jak dnia pier­ wszego, a w przypadku niektórych zmieniono warunki doświadczenia dodając pokarm do żwiru tym osobnikom, które poprzednio pokar­ mu nie miały. Analiza poziomu mRNA wykazała znaczący wzrost poziomu mRNA genów c-fos i c-fun w mózgach zwierząt w okresie pierwszego kontaktu z nowym środowiskiem, ale nie po ponownym eksponowaniu na to samo środowi­ sko.

W następnym doświadczeniu wykorzystano całkowitą lateralizacię drogi wzrokowej ptaków.

Stwierdzono, że w wyniku uczenia się kurcząt reakcji biernego unikania z zamkniętym lewym lub prawym okiem dochodzi do podwyższonej ekspresji genu c-fos w przodomózgowiu półkuli przeciwległej do otwartego oka, czyli odbierają­ cej z niego informację. Natomiast nie stwierdzo­ no żadnego wzrostu poziomu c-fos mRNA w półkuli połączonej funkcjonalnie z okiem za­

mkniętym (An o k h i n i współaut. 1991).

Ti s c h m e y e ri współpracownicy (1990, 1994)

w celu sprawdzenia indukcji genów odpowiedzi wczesnej w uczeniu się wykorzystali test różni­ cowania jasności światła u szczurów. Test prze­ prowadzono w aparacie w kształcie litery Y. Sesja treningowa trwała około 30 min. i składa­ ła się z kilkudziesięciu prób. Zadaniem szczura było wykonanie 20 reakcji prawidłowych, to jest ucieczki do oświetlonego ramienia aparatu po włączeniu się łagodnego szoku elektrycznego podanego przez metalowe pręty podłogi. Stwier­ dzono wzrost ekspresji mRNA genów c-fos i jun B w hipokampie szczurów po nauczeniu się tej reakcji. Podobny poziom mRNA c-fos został wy­ kryty w hipokampie szczurów po pseudo trenin­ gu.

Ca s t r o- Al a m a n c o s i w spółpracow nicy

(1992) badali u szczura nabywanie instrumen­ talnej reakcji obronnej naciskania na dźwignię. W toku doświadczenia zwierzęta w ciągu kolej­ nych sześciu sesji treningowych (jedna sesja dziennie), z których każda składała się z 30 prób, uczyły się reakcji unikania bodźca bólo­ wego. Test, przeprowadzony siódmego dnia (24 godziny po ostatniej sesji treningowej), składał

się z pięćdziesięciu takich samych prób. Kon­ trolę stanowiły dwie grupy zwierząt: (i) kontrola pasywna, w której szczury były poddawane tyl­ ko ręcznej manipulacji (handlingowi) i (ii) kon­ trola aktywna, w której zwierzęta były trakto­ wane tak samo jak w grupie doświadczalnej z tą różnicą, że nie miały możliwości uniknięcia bodźca bólowego. Interesujące, że w grupie zwierząt uczących się reakcji unikania i grupie zwierząt kontroli aktywnej wykazano wzrost ekspresji białka c-Fos w korze ruchowej, nato­ miast w hipokampie tych zwierząt nie wykryto żadnych zmian w ekspresji tego białka.

Podobne wyniki otrzymali He s s i współpra­

cownicy (1995), którzy badali ekspresję genu c-fos w mózgu szczurów w teście wyuczonego węszenia (ang. nose poke task). W teście tym zwierzęta, które poprzednio były poddane de- prywacji wodnej, uczyły się wsadzać swój pysk do niewielkich, około 2 cm średnicy, dziurek, znajdujących się w ścianie aparatu doświad­ czalnego. Nagrodą za udane wsadzenie nosa do dziurki była kropla wody. Zbadano trzy grupy szczurów: (i) grupę zwierząt kontrolnych, prze­ bywający eh jedynie w klatce domowej; (ii) grupę zwierząt dobrze wyuczonych reakcji wyuczone­ go węszenia i, wreszcie, (iii) grupę szczurów, których na podstawie dobrze już znanej reakcji wyuczonego węszenia dodatkowo uczono od­ różniania zapachów w ciągu jednej sesji trenin­ gowej. Wykazano wzrost ekspresji tego genu w korze wzrokowej w obu grupach treningowych, co było dla autorów pewnym zaskoczeniem, bowiem oczekiwano tego tylko w grupie szczu­ rów uczących się odróżnienia zapachów. Porów­ nanie jednak sesji treningowych z sesją testową w grupie zwierząt, w której zastosowano tylko test wyuczonego węszenia wykazuje istotne róż­ nice. Po pierwsze, sesja testowa była prawie dwa razy dłuższa niż sesja treningowa; po drugie, zwierzęta wykonywały zadanie aż do chwili peł­ nego nasycenia, osiągając przez to inny stan fizjologiczny, nie osiągalny w sesjach treningo­ wych. Zmiany te wskazują na wprowadzenie elementu nowości w porównaniu z sesjami tre­ ningowymi.

W innym doświadczeniu (Zh u i współaut.

1995) stwierdzono wzrost immunoreaktywno- ści do c-Fos w korze czuciowej szczura po po­ kazaniu nowych obiektów.

He u r t e a u xi współpracownicy (1993) badali

pobudzenie genów c-fos i c-jun u myszy w teście nabywania pokarmowej reakcji instrumental­ nej w klatce skinnerowskiej. W doświadczeniu tym myszy początkowo uczyły się naciskania na dźwignię — 15 przypadkowych prób naciśnięcia na dźwignię w ciągu jednej dziesięciominutowej sesji treningowej były wzmocnione pokarmem.

Następnie w dniu testu myszy miały za zadanie wykonanie czterdziestu takich samych prób. W wyniku tego doświadczenia stwierdzono wzrost ekspresji badanych genów w hipokampie. Trze­ ba dodać, że w hipokampach myszy z grupy kontrolnej, które zostały poddane procedurze pseudotreningu, także wykryto indukcję tych genów ale w stopniu istotnie mniejszym niż w grupie zwierząt normalnie trenowanych.

Interesującym modelem badania procesów uczenia się i pamięci jest nabywanie doświad­ czeń seksualnych przez naiwne pod tym wzglę­

dem samce szczurów. Ro b e r t s o n i współpra­

cownicy (1991) zastosowali następującą meto­ dę uczenia się kopulacji u naiwnych samców. W ciągu jednej sesji doświadczalnej, trwającej trzydzieści minut naiwny szczur znajdował się w klatce razem z jedną samicą w rui. Po sześciu takich sesjach treningowych, po jednej dzien­ nie, w których szczur mógł kopulować do eja- kulacji, siódmego dnia zwierzęta były testowa­ ne. Test polegał na tym, że szczury w ciągu godziny mogły wykonywać akty kopulacyjne z kilkoma samicami po kolei. W rezultacie analizy immunocytochemicznej wykazano wzrost eks­ presji białka c-Fos w różnych strukturach przo- domózgowia i kory mózgowej szczurów.

W innym doświadczeniu nabywania przez

szczury zachowania seksualnego Bi a ł y i współ­

pracownicy (1992) badali wpływ kolejnych sesji treningowych (każda sesja trwała do pierwszej ejakulacji) na poziom ekspresji mRNA c-fos. Wykryto nikły poziom ekspresji genu po pier­ wszej sesji, istotny zaś wzrost w korze czuciowej po trzech sesjach i powrót do wartości wyjścio­ wych po siedmiu sesjach.

Br e n n a n i współpracownicy (1992) badali

pamięć zapachową u samic myszy wykorzystu­

jąc zjawisko Br u c e’a (1961). Przejawia się ono

w ten sposób, że jeżeli samicę określonego ga­ tunku myszy, znajdującą się w stanie ciąży, w okresie do czterech-pięciu dni po kryciu ekspo­ nować na innego samca, to ciąża u tej samicy zostanie przerwana. W celu wyjaśnienia, czy w okresie formowania się tego rodzaju pamięci zachodzi indukcja genów odpowiedzi wczesnej, przeprowadzono kilka eksperymentów. W pier­ wszym eksperymencie samice umieszczano w klatce z samcami. W różnych odstępach po kopulacji samice wyjmowano z klatki, zabijano a ich mózgi poddawano analizie. W drugim eksperymencie sprawdzono wpływ samych fe­ romonów samców myszy wkładając samice do pustej domowej klatki samców. W trzecim eks­ perymencie przed kontaktem z samcem zakle­ jano samicom jedno nozdrze. Nie wykryto istot­ nych różnic w ekspresji białek c-Fos i Egr-1 (inna nazwa Zif/268) w opuszce węchowej sa­

mic myszy w sytuacjach, w których nie docho­ dziło do krycia samic. Tylko ekspozycja na fero­ mony samca, która była połączona z kryciem samic, doprowadzała do istotnego wzrostu in­ dukcji c-Fos i Egr-1 w opuszce węchowej. Po­ ziom ekspresji tych białek u samic eksponowa­ nych na działanie feromonów samców połączo­ ne z kryciem samic także był istotnie większy w tej części opuszki węchowej, która nie została pozbawiona działania feromonów.

Na złożony charakter ekspresji genu c-fos w trakcie doświadczeń behawioralnych mogą wskazywać wyniki uwzględniające udział stre­ su, v/ tym i tak łagodnego, jak towarzyszącego tak zwanemu handlingowi w pobudzeniu eks­

presji tego genu (Ca m p e a u i współaut. 1991,

Me l i a i współaut. 1994).

E K S P R E S JA C-fos W ZA LE ŻN O Ś C I OD R Ó ŻN Y C H ST A D IÓ W

T R E N IN G U B E H A W IO R A LN E G O

Czynnikiem utrudniającym interpretację opisanych powyżej doświadczeń nad ekspresją c-fos, wywołaną treningiem behawioralnym, jest częsty brak rozróżnienia pomiędzy okresem nabywania reakcji (ang. acquisition), czyli ucze­ nia się a samą zdolnością do wykonywania reakcji (ang. performance). Testem behawioral­ nym, który pozwala na takie rozróżnienie jest nabywanie dwukierunkowej reakcji unikania w skrzynce wahadłowej w wersji zaproponowanej

przez Zi e l i ń s k i eg o i współautorów (1991).

Dwukierunkową reakcję unikania wytwarza się w klatce wahadłowej zbudowanej z dwóch przedziałów o podłodze składającej się z prętów metalowych oraz źródeł bodźców sygnalizacyj­ nych, na przykład światła i dźwięku. Zadaniem zwierzęcia jest uniknięcie bodźca bólowego US (bodziec bezwarunkowy, ang. unconditioned stimulus), najczęściej podawanego w postaci łagodnego szoku elektrycznego poprzez pręty podłogi aparatu treningowego. Aby uniknąć US, zwierzę musi przejść do drugiej części aparatu. Bodziec warunkowy CS (ang. conditioned sti­ mulus), zwykle wzrokowy lub słuchowy, jest podawany kilka sekund przed zastosowaniem US. Mogą być obserwowane dwa rodzaje reakcji — reakcje unikania (ang. avoidance), wykonane pod wpływem CS przed włączeniem się US i reakcje ucieczki (ang. escape) wykonane pod wpływem działania bodźca bezwarunkowego.

Sesja treningowa składa się zwykle z kilku­ dziesięciu prób. Poddanie zwierzęcia przez kilka dni codziennemu (jedna sesja dziennie) trenin­ gowi prowadzi do stopniowego wyuczenia się reakcji unikania, której poziom wykonania po kilku sesjach osiąga plateau. W tym okresie można uznać, że zwierzę nauczyło się reakcji

unikania i dalszy trening nie ma charakteru uczenia się.

Wiadomo także, że duży wpływ na poziom wykonania dwukierunkowej reakcji unikania ma modalność bodźca warunkowego. Bodziec słuchowy z reguły wywołuje wyższy poziom wy­ konania reakcji unikania w porównaniu z bodźcem wzrokowym. Jeśli zwierzętom, które przez kilka kolejnych dni były poddawane tre­ ningowi reakcji unikania na bodziec wzrokowy i osiągnęły stały poziom wykonania tej reakcji, dodać do bodźca wzrokowego bodziec słuchowy lub w ogóle zamienić go na bodziec słuchowy, to poziom wykonania reakcji unikania istotnie

się podwyższy (Zi e l i ń s k i i współaut. 1991).

Korzystając z takiego testu można zbadać i porównać ze sobą zmiany biochemiczne i mole­ kularne zachodzące w komórkach nerwowych mózgu zwierząt i towarzyszące uczeniu się (okres od pierwszej sesji treningowej do osiąg­ nięcia plateau), wykonywaniu już wyuczonej reakcji (kolejne sesje charakteryzujące się sta­ łym poziomem wykonania reakcji) i ponowne­ mu uczeniu się w obecności nowego (słuchowe­ go) bodźca na tle już wyuczonej poprzednio reakcji na bodziec wzrokowy.

W tym celu zostało wykonanych kilka do­ świadczeń. W dwóch z nich, które były przepro­ wadzone w nieco innych warunkach, zbadano wpływ jednodniowej sesji treningowej w skrzyn­ ce wahadłowej na pobudzenie ekspresji genu c-fos w mózgu szczurów. W rezultacie tych doświadczeń wykazano istotny wzrost poziomu mRNA c-fos w hipokampie i korze wzrokowej zwierząt, zabitych w zakresie od 30 do 90 min od chwili rozpoczęcia treningu i całkowity brak wzrostu ekspresji tego genu w 6 i 24 godziny po

treningu (Ni k o l a e v i współaut. 1992a).

W n a s tę p n y m d o ś w ia d c z e n iu p o d ję to p r ó b ę o k re ś le n ia , j a k i w p ły w n a e k s p r e s ję g e n ó w m a w y k o n a n ie w y u c z o n e j j u ż r e a k c ji u n ik a n ia , w o d r ó ż n ie n iu o d n a b y w a n ia (u c z e n ia się) tej r e ­ a k c ji. C e le m w y k lu c z e n ia m o ż liw e g o e fe k tu z a ­ n ik u z d o ln o ś c i d a ls z e g o p o b u d z e n ia e k s p r e s ji c-fos w k o n s e k w e n c ji u p r z e d n ie g o tr e n in g u (c -F o s j e s t n e g a t y w n y m a u to r e g u la to r e m w ła s ­ n e g o g e n u , p a t r z w y ż e j) z a s t o s o w a n o u k ła d d o ­ ś w ia d c z a ln y w p r o w a d z o n y p r z e z ZiELiŃSKiego i w s p ó ł p r a c o w n ik ó w (1991) a p o le g a ją c y n a z m ia n ie s y tu a c ji b o d ź c o w e j p o o s ią g n ię c iu s ta ­ łe g o p o z io m u w y k o n a n ia r e a k c ji u n ik a n ia . Z b a ­ d a n o e k s p r e s ję c-fos w tr z e c h s y tu a c ja c h d o ­ ś w ia d c z a ln y c h : (i) u s z c z u r ó w p r z e b y w a ją c y c h je d y n ie w k la tk a c h d o m o w y c h ; (ii) u s z c z u r ó w p o d z ie w ią te j s e s ji t r e n in g o w e j, p o d c z a s k tó re j z w ie r z ę w w y n ik u z m ia n y b o d ź c a w a r u n k o w e g o (d o d a n ie s z u m u d o c ie m n o ś c i) d o d a tk o w o u c z y s ię s p r a w n e g o w y k o n y w a n ia r e a k c ji in s t r u m e n ­

talnej, (iii) po dziewiątej sesji treningowej, w której nie następuje żadna zmiana bodźca wa­ runkowego i zwierzę wykonuje jedynie dobrze wyuczoną reakcję. W wyniku tego doświadcze­ nia stwierdzono znaczny wzrost ekspresji c-fos w korze czuciowej zwierząt w grupach (ii). Wy­

kryto także podwyższony poziom mRNA c-fosw

móżdżku zwierząt pochodzących z tych samych grup. Nie obserwowano wzrostu ekspresji genu

c-fos w mózgu szczurów w grupach (i) i (iii)

(Ni k o l a e v i współaut. 1992b).

ZM IANY EKSPRESJI C-fos W YW O ŁAN E TRE NIN G IEM BEHAW IORALNYM — PODSUM OW ANIE

Najważniejszym wynikiem uzyskanym w badaniach behawioralnych opisanych powyżej jest wykazanie, że przejściowe nagromadzanie

się mRNA c-fos w różnych strukturach mózgu

szczura towarzyszy nabywaniu, a nie wykony­ waniu dwukierunkowej reakcji unikania. W szczególności stwierdzono, że pojedyncza sesja treningowa prowadzi do wzrostu ekspresji c-fos w mózgu zwierząt. Z kolei prowadzenie treningu do osiągnięcia plateau poziomu wykonania re­

akcji unikania i badanie ekspresji c-fospo sesji

treningowej w tym okresie nie pozwoliło na wykrycie mRNA tego genu. Nie było to jednak spowodowane niezdolnością genu do ulegania ekspresji, ponieważ zmiana warunków do­ świadczenia (dodanie bodźca słuchowego do wzrokowego CS) wywołała nagromadzenie się badanego mRNA. Co więcej, zmiana jakości CS prowadziła także do wzrostu poziomu wykona­ nia reakcji. Wiadomo również, że produkt biał­ kowy c-Fos hamuje własną ekspresję na pozio­

mie transkrypcji (Ed w a r d s 1994, Ro b e r t s o n i

współaut. 1995), dlatego nie można było wyklu­

czyć niezdolności c-fosdo ulegania pobudzeniu

w wyniku długotrwałego treningu.

Powyżej podano kilka przykładów badań różnych autorów, wykazujących podobny

wzrost poziomu białka lub mRNA c-fosw róż­

niących się między sobą sytuacjach doświad­ czalnych opartych o zjawisko uczenia się. Mimo że niektórzy badacze podkreślali, że ekspresja tego genu wzrasta w wyniku wykonywania re­ akcji, to rezultaty wspomnianych doświadczeń nie wydają się być sprzeczne ze sobą. W szcze­

gólności trzeba podkreślić, że w pracach Ca-

STRO-ALAMANCOSa i współautorów (1992), Ro-

BERTSONa i współautorów (1991) oraz HESSa i współautautorów (1995) sesja testowa różniła się znacząco schematem doświadczenia od sesji treningowych, a zatem trudno określić ją mia­ nem testu sprawdzającego jedynie wykonanie reakcji bez elementów nowości (ang. novelty).

Można znaleźć w piśmiennictwie przykłady badań, w których nie udało się stwierdzić zmian

ekspresji genu c-fos w wyniku treningu, na

przykład, wyniki doświadczeń Wi s d e n a i współ­

autorów (1990), w których używano basenu Morrisa. W badaniach tych nie wykryto zmian

ekspresji zarówno c-fos,jak i innego czynnika

transkrypcyjnego zif/268. Co ciekawe, nowsze

prace wykorzystujące ten test wskazują jednak na towarzyszące treningowi zmiany poziomu

mRNA zif/268(Fo r d y c e i współaut. 1994). Nie

jest jednak jasne, czyzmiany te nie były efektem

wzmożonej aktywności ruchowej (wymuszone pływanie).

Podsumowując te rozważania oparte o wy­ niki własne oraz innych autorów można stwier­ dzić, że w trakcie uczenia się występują zmiany

ekspresji c-fos. Nie wiadomo jednak, jakie ele­

menty treningu są za te zmiany odpowiedzialne. W szczególności znaczącą rolę może odgrywać stres towarzyszący treningowi. Warto pamiętać, że również pseudowarunkowanie (podawanie CS i US w sposób przypadkowy, uniemożliwia­ jący kojarzenia ich ze sobą) powodował wzrost

ekspresji badanego genu (Ti s c h m e y e r i współ­

aut. 1990).

Zagadnienie roli stresu w pobudzeniu cfos

było ostatnio intensywnie badane. Me l i a i

współpracownicy (1994) wykazali, że ostry stres polegający na pozbawieniu zwierząt swobody ruchu wywołuje bardzo wyraźny wzrost ekspre­ sji genów odpowiedzi wczesnej, między innymi

i c-fos, w różnych obszarach mózgu szczurów.

Najbardziej wyraźny wzrost był obserwowany w hipokampie, a najmniejszy w ciele migdałowa­ tym i w pniu mózgu, co było dla autorów pew­ nym zaskoczeniem. Stwierdzono również, że powtarzające się sesje unieruchomienia zwie­ rząt doprowadzały do przyzwyczajenia zwierzę­ cia do sytuacji stresowej i przez to do zmniej­ szenia się stresu. Wyrażało się to w istotnym zmniejszeniu poziomu kortykosteronu w oso­ czu krwi po czwartej sesji i całkowitym powrocie poziomu hormonu do kontrolnego po dziewiątej sesji. Podobny charakter zmian wykazała eks­

presja genu c-foswe wszystkich badanych stru­

kturach. Co ciekawe, próba poddania szczurów już przyzwyczajonych do określonego rodzaju stresu (unieruchomienie) działaniu innego stre­ su (pływanie) doprowadzało do ponownego na­

gromadzenia się mRNA c-fosw każdej z bada­

nych struktur mózgu. Warto jednak zwrócić uwagę, że w sytuacji poddawania zwierząt ko­ lejnym zabiegom stresującym występował także

element uczenia się nowej sytuacji doświad­ czalnej. Stąd nie można z całą pewnością stwierdzić, że pobudzenie ekspresji c-fos jest spowodowane tylko i wyłącznie odpowiedzią or­ ganizmu zwierząt na działanie stresogenne.

Nieco inne wyniki otrzymali Ch e n i He r b e r t

(1995) badając wpływ unieruchomienia zwie­ rząt na ekspresję mRNA c-fos w warunkach doświadczenia pojedynczego i powtarzającego się. Wykazano, w przeciwieństwie do danych

uzyskanych przez Me l ię i współpracowników

(1994), że poziom kortykosteronu u szczurów poddanych unieruchomieniu nie wracał całko­ wicie do wartości kontrolnych po dziesięciu ko­ lejnych sesjach stresu i był istotnie wyższy od obserwowanego u szczurów kontrolnych (jedy­ nie codzienne przeniesienia z pokoju domowego do doświadczalnego i z powrotem). Natomiast podtwierdzono spadek ekspresji c-fos po stresie powtarzającym się w porównaniu ze stresem pojedynczym.

Podobne wyniki uzyskali w innym doświad­

czeniu Be c k i Fi b ig e r (1995). W eksperymencie

tych badaczy szczury przez kilka kolejnych co­ dziennych sesji treningowych przeprowadzo­ nych w tym samym pokoju i w tej samej klatce doświadczalnej były poddawane działaniu bodźca bólowego (prąd elektryczny). W dniu testowym, który następował po dwudniowej przerwie, cała ta procedura doświadczalna zo­ stała zachowana z tym, że bodziec bólowy nie był już zastosowany. W wyniku doświadczenia wykryto ekspresję białka c-Fos w wielu obsza­ rach mózgu szczurów. Autorzy twierdzą, że zo­ stało to spowodowano stresem wywołanym strachem na sytuację doświadczalną. Znowu jednak nie można wykluczyć uczenia się zwie­

rząt sytuacji nowej, bo pozbawionej groźnego, dobrze znanego bodźca bólowego. I w tym przy­ padku można więc sugerować, że czynnikiem wywołującym wzrost ekspresji c-Fos w mózgu zwierząt było uczenie się.

Również Cu l l in a n i współapracownicy

(1995) obserwowali wzrost ekspresji mRNA c- fos w wielu obszarach mózgu szczura po zmu­

szeniu zwierząt do pływania w basenie i po

pozbawieniu ich swobody ruchu w doświadcze­ niu pojedynczego stresu.

Na podstawie przedstawionych wyników ba­ dań można by sądzić o dominującej roli proce­ sów związanych ze stresem w aktywacji c-fos towarzyszącej treningowi behawioralnemu. Warto jednak przytoczyć wyniki innych badaczy

(An o k h in i Ro s e 1991, An o k h in i współaut.

1991), którzy uzyskali efekt lateralizacji ekspre­ sji c-fos u kurcząt trenowanych w teście bierne­ go unikania. Można by się spodziewać, że efekt stresu powinien dotyczyć obu półkul mózgu i nie być zakłócony poprzez zamknięcie jednego oka. Wynik tego doświadczenia przemawia za­ tem przeciwko prostemu „stresowemu” wyjaś­ nieniu mechanizmów wzbudzonej ekspresji c-fos w wyniki treningu behawioralnego.

Podobne wątpliwości co do roli stresu nasu­

wają wyniki Bia ł e g o i współautorów (1992). W

badaniach tych stwierdzono nagromadzenie mRNA c-fos w korze czuciowej mózgu szczura w okresie nabywania zdolności kopulacyjnych przez samce. Co ciekawe, zjawisko wzrostu eks­ presji genu nie wystąpiło po pierwszej sesji treningowej, kiedy można by było oczekiwać najwyższego poziomu pobudzenia nieswoistego (stresu). Efekt ten ujawnił się dopiero po 3-5 sesjach treningowych i następnie zanikał.

W doświadczeniach różnych autorów bada­ jących rolę stresu w pobudzeniu ekspresji c-fos

dają się zauważyć elementy uczenia się, a przy­ najmniej odpowiedzi na nowość sytuacji do­ świadczalnej (ang. response to novelty). W żad­ nej bowiem z opisanych powyżej sytuacji tego zjawiska nie da się wykluczyć.

Podsumowując rozważania nad możliwymi czynnikami behawioralnymi odpowiedzialnymi za zwiększoną ekspresję c-fos w mózgu szczura w okresie uczenia się, można jedynie stwierdzić, że brak jest dotąd jednoznacznego wyjaśnienia tego zjawiska. Warto jednak podkreślić, że odpowiedź na nowość sytuacji doświadczalnej i dostęp do nowych bodźców czuciowych są jedy­ nymi niekwestionowanymi wspólnymi elemen­ tami opisywanych doświadczeń.

C-Fos A PLASTYCZNOŚĆ NEURO NALNA

Na koniec warto zadać pytanie o biologiczne znaczenie zwiększonej ekspresji c-fos w proce­ sach plastyczności neuronalnej, w tym między innymi LTP i uczeniu się. Jedna możliwość to istnienie przypadkowej korelacji. Wiadomo, że procesom plastycznym towarzyszy zwiększona aktywność neuronalna i wiadomo też, że wiele form zwiększonej aktywności komórkowej kore­

luje z aktywacją genu c-fos. Znaczenie funkcjo­ nalne tej korelacji nie jest dobrze wyjaśnione, choć trzeba pamiętać, że istnieją przykłady ha­ mowania procesów fizjologicznych w wyniku

selektywnego blokowania c-Fos (Wa t a n a b e i

współaut. 1996).

Kolejne możliwe wyjaśnienie to konieczność uzupełnienia (replenishment) zawartości syna­

psy zużytej pod wpływem silnej stymulacji. Szczególnie wyraźne jest to w LTP (tetanizacja), ale podobnego zjawiska można także oczekiwać

w trakcie warunkowania obronnego (Ka c z m a­

r e k 1995). Inną zaś możliwością zaproponowa­

ną przez Ka c z m a r k a (1993) jest udział białka

c-Fos, jako składnika czynnika transkrypcyjne­ go AP-1, w integracji informacji w procesach uczenia się. Zgodnie z tą propożycją powstawa­ nie trwałej zmiany plastycznej (np. utworzenia długotrwałego śladu pamięciowego) wymaga pobudzonej ekspresji genów. Można by wśród nich wyróżnić także te, które kodują składniki synaptyczne, na przykład białka pęcherzyków

(Sm ir n o v a i współaut. 1993, Ly n c h i współaut.

1994) lub też białka cytoszkieletu (Wo o l f i

współaut. 1994). Ich zwiększona obecność by­ łaby w myśl tej hipotezy warunkiem zwiększo­ nej siły przekaźnictwa synaptycznego. Geny te,

według Ka c z m a r k a (1993), można by nazwać

genami efektorowymi w procesie uczenia się. Ekspresja zaś genów efektorowych byłaby za­ leżna od dostępności czynników transkiypcyj- nych. Jeśli zaś poszczególne czynniki transkry­ pcyj ne byłyby aktywowane w miarę specyficznie w następstwie pobudzenia swoistych układów neuroprzekaźnikowych, jednoczesna obecność czynników transkrypcyjnych byłaby informacją o w miarę jednoczesnym pobudzeniu określo­ nych receptorów. W rezultacie jedynie współ- obecność wielu czynników transkrypcyjnych umożliwiałaby pobudzenie ekspresji genów efe­ ktorowych. Inaczej mówiąc, obszary regulatoro­ we tych ostatnich (miejsca oddziaływania z czynnikami transkrypcyjnymi) stanowiłyby materialne podłoże procesu integracji informa­ cji dostarczonej komórce nerwowej poprzez po­ budzenie receptorów błonowych.

C-fos GENE ACTIVATIO N AS A PRE D ISPO SAL FO R PLASTIC CHANGES IN TH E C E N TRA L N E RV­

OUS SYSTEM S u m m a r y

Understanding of molecular basis of long term memory formation poses a major challenge for the present-day neurobiological research. Recent advances in molecular biology offer, however, a clue about molecular mechanisms of learning processes. Significant progress in this regard can be linked to studies on transcription factors including A P -1, and its component c-Fos. This protein by its virtue to affect expression of a variety of genes is recognized as a third messenger in the biochemical cascade transducing infor­ mation from extracellular environment to genomic respon­ ses. This function, well described for non-neuronal cells, has been found to be pivotal in brain cells as well. Express­ ion of c-fos mRNA and c-Fos protein remains very low under basal conditions. Stimulation of neurons with a variety of

agents, especially involving receptors for excitatory amino acids, results in a rapid and transient increase in c-fos expression. A similar increase has been observed to corre­ late with different forms of neuronal plasticity, such as kindling, longterm potentiation, postnatal cortical develop­ ment, sensory stimulation, etc. The most intriguing are findings that behavioral training resulting in long term memory formation also coincides with elevated c-fos ex­ pression at mRNA and protein levels. The available data suggest that this increase can not be solely explained by such phenomena as locomotor activity, pain, stress, etc., but rather correlates with acquisition of behavioral experi­ ence and/or response to novelty.

LITERATU RA

Ab r a h a m W. C., Ma s o n S. E., De m m e r J., Wi l l ia m s J. M., Ric h a r d s o n C. L ., Ta t e W. P., La w l o r P. A ., Dr a g u n o w M., 1993. Correlations between immediate early gene

induction and the persistence o f long-term potentiation.

Neuroscience 56, 717-727.

An g e l P., Ka r in M „ 1 9 9 1 . The role ofJun, Fos and the AP-1 com plex in ce ll-p rolifera tion and transform ation.

Biochem. Biophys. Acta 1072, 129-157.

An o k h in K. V., Ro s e S. P. R., 1991. Learning-induced in­

crease o f immediate early gene messenger RNA in the chick forebrain. Eur. J. Neurosci. 3, 162-167.

An o k h in K. V., Mil e u s n ic R., Sh a m a k in a I. Y., Ro s e S. P. R., 1991. Effects o f early experience on c-fos gene express­

ion in the chick forebrain. Brain Res. 544, 101-107.

Ba d in g H., Se g a l M. M., Su c h e r N. J., Du d e k H., Lip t o n S. A., Gr e e n b e r g M. E. 1995. N-methyl-D-aspartate recep­

tors are critical fo r mediating the effects o f glutamate on intracellular calcium concentration and immediate early gene expression in cultured hipocampal neurons. Neu­

roscience 64, 653-664.

Ba il e y C . H., Ka n d e l E. R., 1993. Structural changes accom­

panying memory storage. Annu. Rev. Physiol. 55, 397-

426.

Ba r a ń s k a J., Ka c z m a r e k L., Sk a n g i e l- Kr a m s k a L., 1994. Kas­

kada procesów biochemicznych po pobudzeniu neur­ onu. [W:] Mechanizmy plastyczności mózgu. Ko s s u t M. red. PWN Warszawa. 148-158.

Be c k C. H. M., Fi b ig e r H. C., 1995. Conditioned Fear-in­

duced Changes in Behavior and in the Expression o f the Immediate Early Gene c-fos, With and Without Diaze­ pam Pretreatment. J. Neurosci. 15, 709-720.

Bia ł y M., Nik o l a e v E., Be c k J., Ka c z m a r e k L., 1992. Delayed

c-fos expression in sensory cortex follow ing sexual learning in male rats. Mol. Brain. Res. 14, 352-356.

Bir d e r L. A., De- Gr o a t W. C., 1993. Induction o f c-fos

expression in spin.al neurons by nociceptive and nonno­ ciceptive stimulation ofLU T. Am. J. Physiol. 265, 326-

333.

Bl is s T. V. P., Co l l in g r id g e G. L „ 1993. A synaptic model o f

memory, long-term potentiation in the hipokampus. Na­

ture 361, 31-39.

Bl is s T. V. P., Ga r d n e r- Me d w in A. R., 1973. Long-lasting

potentiation o f synaptic transmission in the dentate area o f the unanaesthetized rabbit follow ing stimulation o f the perforant path. J. Physiol., London, 232, 357-374.