Influence of Chlorhexidine in vitro on the Ability of Biofilm Formation of Candida albicans Isolates from Oral Cavity

prace oryginalne

agnieszka Wójtowicz, anna Malm

Wpływ chlorheksydyny in vitro na tworzenie biofilmu

przez drożdżaki Candida albicans kolonizujące

ontocenozę jamy ustnej

Influence of Chlorhexidine in vitro on the Ability of Biofilm Formation

of Candida albicans Isolates from Oral Cavity

Katedra i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej z pracownią Diagnostyki Mikrobiologicznej Uniwersytetu Medycznego w lublinie

Streszczenie

Wprowadzenie. Biofilm jest czynnikiem patogenności wielu drobnoustrojów, w tym również mikroflory

koloni-zującej jamę ustną, która może być czynnikiem etiologicznym tzw. zakażeń stomatologicznych. Zakażenia te mają charakter endogenny, przewlekły i często nawracający ze względu na naturalną oporność drobnoustrojów two-rzących biofilm na antyseptyki, chemioterapeutyki czy antybiotyki. Jednym z czynników etiologicznych zakażeń stomatologicznych mogą być drożdżaki z rodzaju Candida, głównie Candida albicans.

Cel pracy. ocena wpływu chlorheksydyny in vitro na fazę adhezji szczepów C. albicans kolonizujących ontocenozę

jamy ustnej; faza ta jest niezbędnym etapem dla wytworzenia biofilmu.

Materiał i metody. ocenie poddano 50 szczepów C. albicans mających zdolność tworzenia biofilmu,

wyizolowa-nych z ontocenozy jamy ustnej zdrowych osób. oznaczano Mic chlorheksydyny (najmniejsze stężenie hamują-ce) dla komórek planktoidalnych C. albicans mikrometodą podwójnych rozcieńczeń oraz MBic chlorheksydyny (minimalne stężenie hamujące powstanie biofilmu), z użyciem MTT oraz menadionu; w obu metodach stosowano polistyrenowe 96-dołkowe płytki titracyjne.

Wyniki. Zakres wartości Mic chlorheksydyny dla komórek C. albicans w formie planktoidalnej wynosił 0,00075–

–0,006%, a zakres wartości MBic chlorheksydyny dla komórek tworzących biofilm wynosił 0,00075–0,0048%.

Wnioski. potwierdzono skuteczność obecnie stosowanych w profilaktyce stomatologicznej preparatów

zawierają-cych chlorheksydynę w stężeniach (0,1–2%), obejmujązawierają-cych swoim spektrum zarówno komórki C. albicans w for-mie planktoidalnej, jak i tworzące biofilm (Dent. Med. Probl. 2010, 47, 10, 177–181).

Słowa kluczowe: chlorheksydyna, biofilm, zakażenia stomatologiczne, Candida albicans.

Abstract

Background. Biofilm is an important factor responsible for pathogenicity of many microorganisms, including the

microflora colonizing oral cavity, which can be regarded as potential etiological agent of dental infections. These infections are endogenous, chronic and frequently recurrent due to the natural resistance of microorganisms form-ing a biofilm to antiseptics, chemiotherapeutics or antibiotics. one of the etiological agents of dental infections may be the yeasts from the genus Candida, mainly C. albicans.

Objectives. The aim of this study was to assess the influence of chlorhexidine in vitro on adhesion of C. albicans

isolates from oral cavity, adhesion phase being a necessary step of biofilm production.

Material and Methods. a total of 50 C. albicans strains with the ability to form a biofilm were isolated from the

oral cavity of healthy people. Determination of chlorhexidine Mic (minimum inhibitory concentration) for C. albicans planktonic cells were performed by microdilution method, while that of chlorhexidine MBic (minimal biofilm inhibitory concentration) was performed using MTT and menadione; in both methods the polystyrene 96-well titration plates were used.

Results. Mic of chlorhexidine for C. albicans cells in the planktonic form ranged from 0.00037–0.006%, while

MBic of chlorhexidine for biofilm forming cells ranged from 0.00075–0.048%.

Conclusions. The results confirm the efficacy of dental preparations containing chlorhexidine in concentrations

(0.1–2%) active against either planktonic or biofilm forming cells of C. albicans (Dent. Med. Probl. 2010, 47, 10,

177–181).

Key words: chlorhexidine, biofilm, dental infections, Candida albicans.

Dent. Med. probl. 2010, 47, 2, 177–181

Biofilm jest czynnikiem patogenności wielu drobnoustrojów, w tym również mikroflory kolo-nizującej jamę ustną, która może być czynnikiem etiologicznym tzw. zakażeń stomatologicznych [1]. Zakażenia te mają charakter endogenny, przewle-kły i często nawracający ze względu na naturalną oporność drobnoustrojów tworzących biofilm na antyseptyki, chemioterapeutyki czy antybiotyki. Jednym z czynników etiologicznych tych zakażeń mogą być drożdżaki z rodzaju Candida, głównie

Candida albicans. Szacuje się, iż w

ontoceno-zie jamy ustnej osób zdrowych nosicielstwo tych drożdżaków wynosi 40–75% [2]. W sprzyjających warunkach mogą być czynnikiem etiologicznym stanów zapalnych błony śluzowej jamy ustnej oraz periodontopatii.

Biofilm Candida spp. jest strukturą zbudo-waną z różnych form morfologicznych komórek drożdżaków (blastospor, pseudostrzępek, strzę-pek), przylegających do powierzchni ożywionej lub nieożywionej oraz do siebie nawzajem. Struk-tura ta jest otoczona polisacharydową substancją pozakomórkową [3, 4]. Tworzenie się biofilmu jest procesem złożonym i wielostopniowym. pierwsza faza – adhezja – jest związana z niespecyficznymi oddziaływaniami fizycznymi, a następnie specy-ficznymi oddziaływaniami chemicznymi między strukturami powierzchniowymi komórek droż-dżaków a ligandami obecnymi na kolonizowanym podłożu. Jest to niezbędny etap dla powstania bio-filmu [5].

chlorheksydyna jest wykorzystywana w prak-tyce lekarskiej już od 1957 roku, jako jeden z naj-częściej używanych antyseptyków w stomatologii. Wyniki wielu prac potwierdzają jej najszerszy za-kres działania przeciwgrzybiczego w porównaniu do innych antyseptyków stosowanych w stomato-logii; wyróżnia się szczególnie dużą skutecznością w stosunku do C. albicans [6]. Udowodniono rów-nież jej właściwości przeciwbakteryjne w stosunku do większości bakterii bytujących w jamie ustnej [6–8]. chlorheksydyna, należąca do grupy bisgu-andiów, ma silny ładunek dodatni, co powoduje łą-czenie się tego antyseptyku z ujemnie naładowaną błoną komórkową drożdżaków, prowadząc do za-burzeń osmotycznych i lizy komórki. Związek ten ma również zdolność do łączenia się z powierzch-nią błony śluzowej jamy ustnej i pelikulą na po-wierzchni zębów, stopniowo ulegając uwalnianiu, przedłużając swoje działanie antyseptyczne nawet do 24 godzin [6, 9–11]. chlorheksydyna występuje w postaci płynnej, jako wodny roztwór dwuglu-konianu chlorheksydyny, ale również jako skład-nik preparatów złożonych, jest dostępna w postaci kremów, lakierów, żeli i tabletek do ssania.

chlorheksydyna jest ważnym środkiem wspo-magającym w leczeniu stanów zapalnych

przy-zębia, profilaktyce próchnicy oraz w leczeniu kandydozy jamy ustnej, jako uzupełnienie terapii antymikotykami. liczne doniesienia wskazują na jej szczególną rolę w leczeniu endodontycznym. celem tego leczenia jest uzyskanie wolnego od drobnoustrojów światła kanału korzeniowego, gdzie poza mechanicznym opracowaniem kana-łu używa się wielu środków do pkana-łukania kanakana-łu, w tym chlorheksydynę [2, 6, 9, 10]. antyseptyk ten znalazł zastosowanie również jako składnik wkładki dokanałowej i środek do dezynfekcji ma-teriałów stosowanych do wypełnienia kanałów. Fakt łączenia się z twardymi tkankami zębów umożliwia uzyskanie długotrwałego dużego stę-żenia leku w kanale korzeniowym, co przyczynia się do zwiększenia skuteczności terapii. Kolejną ważną cechą jest jej mała szkodliwość dla tkanek okołowierzchołkowych i brak działania toksycz-nego. chlorheksydyna skutecznie eliminuje

Ente-rococcus faecalis oraz C. albicans, które aż w 75%

przypadków są odpowiedzialne za rekolonizację kanału i niepowodzenia w leczeniu endodontycz-nym, dlatego też w tych sytuacjach klinicznych jest polecane zastosowanie 2% chlorheksydyny [11].

celem pracy była ocena wpływu chlorheksy-dyny in vitro na fazę adhezji, będącą niezbędnym etapem dla wytworzenia biofilmu przez szczepy

C. albicans izolowane z ontocenozy jamy ustnej.

Materiał i metody

Materiał biologiczny

W badaniach użyto 50 szczepów C. albicans o potwierdzonej zdolności do tworzenia biofilmu, wyizolowanych z ontocenozy jamy ustnej zdro-wych osób z różnych grup wiekozdro-wych. osoby uczestniczące w badaniach lub ich opiekunowie wyrazili zgodę na pobranie wymazu z błony ślu-zowej jamy ustnej. Materiałem wyjściowym była

18 h hodowla drożdżaków w temp. 37o_{c w}

płyn-nym podłożu Sabourauda suplementowapłyn-nym 100 mM glukozą.

Określenie najmniejszego

stężenia hamującego

chlorheksydyny wobec komórek

planktoidalnych C. albicans

Wartości Mic (minimal inhibitory

concentra-tion) chlorheksydyny dla komórek

planktoidal-nych C. albicans zostały oznaczone mikrometodą seryjnych rozcieńczeń w podłożu płynnym Sabo-urauda, z użyciem polistyrenowych 96-dołkowych płytek titracyjnych. Wykonywano wiele seryjnych

rozcieńczeń chlorheksydyny w płynnym pod-łożu Sabourauda i do każdego dołka na płytce titracyjnej dodawano 2 µl zawiesiny badanych drożdżaków o gęstości 0,5 w skali McFarlanda, przygotowanej w tym samym podłożu. następnie płytki inkubowano 48 h w temp. 37 o_{c, po czym} dokonywano odczytu absorbancji przy długo-ści fali 490 nm (a490)za pomocą czytnika eliSa elx800 (BioTek). Za wartość Mic chlorheksydy-ny uznawano najmniejsze stężenie, przy którym nie obserwowano wzrostu drożdżaków w postaci zmętnienia, w porównaniu z próbą kontrolną za-wierającą tylko podłoże Sabourauda oraz anty-septyk. Dla każdego szczepu oznaczenie wartości Mic wykonywano w dwóch powtórzeniach.

Określenie najmniejszego

stężenia chlorheksydyny

hamującego fazę adhezji

w trakcie formowanie się

biofilmu C. albicans

(MBIC – minimal biofilm

inhibitory concentration)

W celu określenia wpływu chlorheksydyny na fazę adhezji wykorzystywano również 96-dołko-we płytki titracyjne oraz MTT-bromek 3-(4,5-di-metylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2H tetrazoliowy. Z użyciem płytek titracyjnych wykonywano wiele seryjnych rozcieńczeń chlorheksydyny w płynnym podłożu Sabourauda. Wyjściowe stężenia chlor-heksydyny wynosiły od 0,25 × Mic do 4 × Mic oznaczonych dla komórek planktoidalnych C.

al-bicans. na płytki titracyjne nanoszono 100 µl

zawiesiny badanych drożdżaków o gęstości 4 w ska-li McFarlanda, przygotowanej w tym samym pod-łożu. płytki inkubowano 1,5 h w temp. 37o_{c w} ce-lu zahamowania adhezji komórek drożdżaków. po fazie adhezji odpłukiwano płytki dwukrotnie za pomocą pBS (zbuforowanej soli fizjologicznej), usuwając komórki, które nie uległy adhezji oraz antyseptyk. następnie dodawano 100 µl podłoża Sabourauda suplementowanego 100 mM glukozą i inkubowano 48 h w temp. 37o_{c. po trzykrotnym} przemyciu powstałego biofilmu z użyciem pBS dodawano 40 µl MTT o stężeniu 1 mg/ml, 2 µl 0,4 mM roztworu menadionu oraz 158 µl pBS, w celu wizualizacji powstałego biofilmu. MTT re-dukuje się do fioletowego formazanu, co jest wyra-zem aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej

żywych komórek. po 3 h inkubacji w temp. 37o_c

dokonywano pomiaru absorbancji przy długo-ści fali 490 nm (a490) za pomocą czytnika eliSa elx800 (BioTek) po przeniesieniu 100 µl roztworu do pustego dołka płytki titracyjnej [12]. Za war-tość MBic chlorheksydyny uznawano najmniejsze stężenie, przy którym wartość a490 była porów-nywalna z wartością a490 próby kontrolnej (pod-łoże Sabourauda z antyseptykiem). Dla każdego szczepu oznaczenie wartości MBic wykonywano w dwóch powtórzeniach.

Wyniki

Jak wskazuje ryc. 1, zakres wartości Mic dla ko-mórek C. albicans w formie planktoidalnej wynosił 0,00037–0,006%, a zakres wartości MBic chlorhek-sydyny dla komórek tworzących biofilm, czyli stężeń hamujących fazę adhezji, wynosił 0,00075–0,048%.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0,00037 0,00075 0,0015 0,003 0,006 0,012 0,024 0,048 stężenie chlorheksydyny (%) chlorhexidine concentration (%) liczba szczepów number of strain

s komórki planktoidalne planktonic cells biofilm Ryc. 1. porównanie aktywności chlorheksydyny in vitro wobec komórek Candida albicans planktoidalnych (Mic) i tworzących biofilm (MBic)

Fig. 1. comparison of

chlo-rhexidine activity in vitro against planktonic (Mic) and biofilm forming (MBic) cells of Candida albicans

Zgodnie z danymi przedstawionymi w tabeli 1, wartość MBic50, czyli stężenia hamującego fazę adhezji 50% szczepów, była 4-krotnie wyższa niż wartość Mic50 dla komórek planktoidalnych, czyli stężenia hamującego wzrost 50% szczepów. War-tość MBic90 (stężenie hamujące fazę adhezji 90% szczepów) była dwukrotnie wyższa od wartości Mic90 dla komórek planktoidalnych (stężenie ha-mujące wzrost 90% szczepów).

Omówienie

Jednym z czynników etiologicznych zakażeń stomatologicznych mogą być drożdżaki z rodzaju

Candida, głównie C. albicans. Drożdżak ten jest

uważany za jeden z najważniejszych drobnoustro-jów odpowiedzialnych za niepowodzenia w lecze-niu endodontycznym [2, 6]. chlorheksydyna od-znacza się najwyższą skutecznością w porównaniu do innych preparatów stosowanych w eradykacji tego drożdżaka z kanałów zębowych. W leczeniu endodontycznym stosuje się stężenia tego antysep-tyku 0,02–2%, do odkażania jamy ustnej są zaleca-ne stężenia 0,1–0,2%, a do odkażania płytkowych uzupełnień protetycznych 0,2–1% [6]. Wiadomo, iż C. albicans będący przyczyną zakażeń stoma-tologicznych znajduje się nie tylko na płytce na-zębnej, ale także na grzbietowej części języka czy na błonie śluzowej policzków, a najważniejszym czynnikiem wirulencji tych drożdżaków jest zdol-ność tworzenia biofilmu. Zjawisko formowania biofilmu jest obecnie poważnym problemem sto-matologicznym, a poszukiwanie substancji aktyw-nych wobec biofilmu jest pilną potrzebą współcze-snej stomatologii; istnieje konieczność stosowania odpowiednich antyseptyków jako uzupełnienie mechanicznych zabiegów usuwania biofilmu.

W badaniach własnych oceniono wpływ chlorheksydyny – najpopularniejszego w stoma-tologii antyseptyku – na fazę adhezji szczepów

C. albicans izolowanych z ontocenozy jamy

ust-nej. na pierwszym etapie pracy określono wraż-liwość na chlorheksydynę komórek plankto-idalnych C. albicans (Mic = 0,00037–0,006%). przedstawione wyniki zgodne są z danymi in-nych autorów. Wg patel et al. [13] zakres Mic chlorheksydyny dla tego typu komórek wynosił 0,008–0,16 mg\ml (0,0008–0,016%). Doniesienia te oraz wyniki własne potwierdzają skuteczność stężeń tego antyseptyku stosowanych w prepara-tach stomatologicznych wobec komórek plankto-idalnych C. albicans.

liczne dane z piśmiennictwa wskazują rów-nież na skuteczność chlorheksydyny w stosunku do biofilmu, tworzonego przez różne drobnoustroje, w tym przez C. albicans [6, 7, 14, 15]. Wrażliwość biofilmu C. albicans na ten antyseptyk zależy jed-nak od stopnia dojrzałości tej struktury. Badania korelacji między stopniem dojrzałości biofilmu a Mic chlorheksydyny wskazują, iż wraz z doj-rzewaniem biofilmu wartości te rosną, a struktura dojrzałego biofilmu może wykazywać całkowitą oporność na ten antyseptyk nawet w stężeniu 2% [16]. Dane przedstawione w niniejszej pracy wskazują na skuteczność działania chlorheksy-dyny na fazę adhezji, stanowiącą wstępny etap tworzenia biofilmu, już w stężeniach ≤ 0,048%. różnice w stężeniach chlorheksydyny hamują-cych tworzenie biofilmu w zależności od stopnia jego rozwoju mogą być wynikiem oddziaływania chlorheksydyny jedynie na powierzchniowe war-stwy biofilmu i jej ograniczonej penetracji w tę strukturę [17].

należy zwrócić uwagę na monitorowanie oporności szczepów C. albicans na ten antysep-tyk ze względu na powszechność jego stosowania i długi czas aplikacji sprzyjający selekcji szczepów o obniżonej wrażliwości. Zjawisko narastania oporności wobec chlorheksydyny opisywano np. po długotrwałych 2-tygodniowych cyklach lecz-niczych.

Wnioski

Uzyskane rezultaty potwierdzają skuteczność obecnie stosowanych w profilaktyce stomatolo-gicznej preparatów zawierających chlorheksydy-nę w stężeniach obejmujących swoim spektrum zarówno komórki C. albicans w formie plankto-idalnej, jak i tworzące biofilm. należy jednak mo-nitorować stopień oporności szczepów C. albicans na ten powszechnie używany antyseptyk w stoma-tologii.

Tabela 1. porównanie aktywności chlorheksydyny in

vitro wobec komórek Candida albicans planktoidalnych i tworzących biofilm

Table 1. comparison of chlorhexidine activity in vitro

against planktonic and biofilm forming cells of Candida albicans

parametry

(parameters) Stężenie chlorheksydyny(chlohexidine concentration) % Mic50 0,00075 Mic90 0,003 Zakres Mic 0,00037–0,006 MBic50 0,003 MBic90 0,006 Zakres MBic 0,00075–0,048

Piśmiennictwo

[1] Suci p. a., Tyler B. J.: action of chlorhexidine digluconate against yeast and filamentous forms in an early stage Candida albicans biofilm. antimicrob. agents. chemother. 2002, 46, 3522–3531.

[2] Miranda T. T., Vianna c. r., rodrigues l., Monteiro a. S., rosa c. a., correa a.: Diversity and frequency of yeasts from the dorsum of the tongue ad necrotic root canals associated with primary apical periodontitis. int. endod. J. 2009, 42, 839–844.

[3] Mnichowska-polanowska M., giedrys-Kalemba S.: Metody i techniki stosowane w badaniach nad biofilmem Candida. Mikol. lek. 2009, 16, 238–244.

[4] Dorocka-Bobkowska B., Konopka K.: powstawanie biofilmu Candida i jego znaczenie w patogenezie zakażeń przewlekłych – przegląd piśmiennictwa. Dent. Med. prob. 2003, 40, 405–410.

[5] Strużycka i., Stępień i.: Biofilm – nowy sposób rozumienia mikrobiologii. nowa Stomatol. 2009, 14, 3, 85–89. [6] Mohammadi Z., abbott p.: The properties and applications of chlorhexidine in endodontics. int. endod. J. 2009,

42, 288–302.

[7] Takeuchi y., guggenheim B., Filieri a., Baehni p.: effect of chlorhexidine/thymol and fluoride varnishes on dental biofilm formation in vitro. eur. J. Sci. 2007, 115, 468–472.

[8] Filoche S. K., Soma K., Sissons c. H.: antimicrobial effects of essential oils in combination with chlorhexidine digluconate. oral Microbiol. immuol. 2005, 20, 221–225.

[9] Malicka B., Ziętek M., grzebieluch W.: Zastosowanie chlorheksydyny w stomatologii. Dent. Med. prob. 2005, 42, 497–505.

[10] Turk B. T., Sen B. H., ozturk T.: In vitro antimicrobial activity of calcium hydroxide with different vehicles against Enterococcus faecalis and Candida albicans. J. endod. 2007, 108, 297–301.

[11] Wujec p., pawlicka H.: Standardowe środki płuczące polecane w leczeniu endodontycznym – przegląd piśmien-nictwa. Dent. Med. probl. 2008, 45, 466–472.

[12] Zaw M. T., Samaranayake y. H., Samaranayake l.p.: In vitro biofilm formation of Candida albicans and non-albicans Candida species under dynamic and anaerobic conditions. arch. oral Biol. 2007, 52, 761–767.

[13] patel M., coogan M.: antifungal activity of the plant Dodonaea viscose var. angustifolia on Candida albicans from HiV-infected patients. J. ethnopharmacol. 2008, 118, 173–176.14.

[14] redding S., Bhatt B., rawls r., Siegel g., Scott K., lopez-ribot J.: inhibition of Candida albicans biofilm formation on denture material. oral Surg. oral Med. oral pathol. oral radiol. endod. 2009, 107, 669–672. [15] pusateri c., Monaco e., edgerton M.: Sensitivity of Candida albicans biofilm cells grown on denture acrylic to

antifungal proteins and chlorhexidine. arch. oral Biol. 2009, 54, 588–594.

[16] chandra J., Kuhn D. M., Mukherjee p. K., Hoyer l. l., Mccormick T., ghannoum M. a.: Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. J. Bacteriol. 2001, 183, 5385–5394.

[17] Kittel e., Kamysz e., Bartoszewicz M., Junka a., Smutnicka D., Mączyńska B., Kamysz W., Kittel M.: Biofilm infekcyjny i płytka bakteryjna w zapaleniu przyzębia i tkanek okołowierzchołkowych: procedury zabiego-we i okołozabiegozabiego-we ograniczające rekolonizację – wyniki badań. Sepsis 2009, 2, 237–240.

Adres do korespondencji:

praca wpłynęła do redakcji: 4.06.2010 r. po recenzji: 21.06.2010 r.

Zaakceptowano do druku: 21.06.2010 r. received: 4.06.2010

revised: 21.06.2010 accepted: 21.06.2010