Ziemniak Polski 2005 nr 2 11
Hodowla i genetyka
SELEKCJA POLSKICH ODMIAN ZIEMNIAKA KRAŃCOWO ODPORNYCH
NA WIRUS Y Z WYKORZYSTANIEM MARKERA GP122
718doc. dr hab. Waldemar Marczewski
IHAR, Zakład Genetyki i Materiałów Wyjściowych Ziemniaka 05-831 Młochów, e-mail: w.marczewski@ihar.edu.pl
irus Y ziemniaka (Potato virus Y, PVY) jest jednym z najważniejszych patoge-nów ziemniaka. Powoduje straty zarówno w uprawach, jak i w nasiennictwie. Wpływa nie tylko na plon bulw, ale może również obni-żać ich wartość przetwórczą. PVY jest łatwo przenoszony mechanicznie oraz przez wiele gatunków mszyc. Hodowla odmian odpor-nych jest jednym z najbardziej skuteczodpor-nych sposobów ochrony upraw ziemniaka przed infekcją PVY (Świeżyński 1994). Opisano dwa typy odporności ziemniaka na PVY: odporność krańcową (ER – extreme resi-stance) i nadwrażliwość (HR – hypersensi-tive response) (Valkonen i in. 1996). W nad-wrażliwości warunkowanej przez geny Ny reakcja obronna ma postać nekroz lokalnych lub systemicznych, o różnym nasileniu, spe-cyficznych dla poszczególnych szczepów PVY. Nekrotyzacja tkanki w niektórych przy-padkach jest związana z lokalizacją wirusa w miejscu infekcji, bez jego przemieszczania się do bulw lub innych organów i tkanek. Gen Nytbr, zmapowany na chromosomie IV
genomu ziemniaka, warunkuje bardzo silną reakcję nekrotyczną po zakażeniu szczepem PVY0, co prowadzi do uschnięcia rośliny. Jest to jedyny znany z literatury przykład genu odpowiedzialnego za reakcję nadwraż-liwości ziemniaka na infekcję wirusem Y (Ce-lebi-Toprak i in. 2002).
Krańcowa odporność na PVY jest warun-kowana przez geny oznaczone symbolem
Ry. Geny Ry pochodzące z dzikich
gatun-ków Solanum zmapowano na chromoso-mach IX (Hosaka i in. 2001), XI (Hämäläinen i in.1997, Brigneti i in.1997) i XII (Flis i in. 2005). Rośliny ziemniaka posiadające allel
Ry nie ulegają zakażeniu przez żaden
opi-sany szczep PVY. Po mechanicznej
inokula-cji roślin nie obserwuje się symptomów cho-roby ani w postaci lokalnych lub systemicz-nych plam nekrotyczsystemicz-nych na liściach, ani w postaci nekroz wiązek przewodzących (Val-konen i in. 1996). Brak objawów choroby jest prawdopodobnie spowodowany silnym re-strykcyjnym działaniem genu Ry na namna-żanie wirusa poniżej ilości niezbędnej do aktywacji reakcji nadwrażliwości. Nie można wykluczyć, że geny odpowiedzialne za wy-stępowanie reakcji nekrotycznej pełnią regu-latorową funkcję w ekspresji genu Ry. W polskiej hodowli ziemniaków odpornych na PVY wykorzystywany jest gen Rysto
pocho-dzący z Solanum stoloniferum (Flis 1997). Procedura identyfikacji klonów krańcowo odpornych jest pracochłonna, a jej wykona-nie trwa kilka miesięcy. Badania obejmują przygotowanie odpowiedniego inokulum, zakażanie mechaniczne roślin, obserwacje objawów po trzech tygodniach od inokulacji, a po czterech tygodniach identyfikację wiru-sa testem ELISA. Dodatkowo wykonuje się test szczepieniowy roślin w celu potwierdze-nia obecności allelu Ry, a także badapotwierdze-nia obecności wirusa w roślinach wyprowadzo-nych z bulw, co wymaga kolejwyprowadzo-nych miesięcy (Chrzanowska 2001).
Wprowadzenie markerów DNA, zwłasz-cza tych generowanych przy zastosowaniu łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR – polymerase chain reaction), doprowadziło do przełomu w badaniach genetycznych roślin. Od latach 90. minionego wieku do dziś opra-cowano wiele technik identyfikacji różnic w sekwencji DNA (polimorfizmu DNA) między porównywanymi osobnikami, odmianami czy gatunkami roślin. Są one z powodzeniem wykorzystywane między innymi do mapowa-nia genomów roślinnych, badań
filogene-W
Ziemniak Polski 2005 nr 2
12
tycznego pokrewieństwa gatunków, do wy-różniania form mieszańcowych i doboru form rodzicielskich w hodowli, a wreszcie do iden-tyfikacji genów ważnych cech użytkowych, np. genów odporności na patogeny. Popra-wa odporności na patogeny, a w perspekty-wie uzyskanie odmian o trwałej odporności na choroby, to główny cel hodowli odporno-ściowej roślin uprawnych. Identyfikacja mar-kerów DNA sprzężonych z genami odporno-ści stworzyła szanse na dokonanie jako-ściowej zmiany w procedurach selekcji od-pornych genotypów. O przydatności markera w praktyce decyduje jego silne sprzężenie z monitorowanym genem, stabilne w kolejnych generacjach. Metoda molekularna powinna zapewniać łatwą w wykonaniu, powtarzalną i szybką identyfikację markera. Nie bez zna-czenia są koszty stosowania metody mole-kularnej w porównaniu z klasycznymi testami diagnostycznymi. Użycie markerów DNA w selekcji będzie szczególnie wskazane w wy-padku cech, których ocena na podstawie reakcji fenotypu jest kosztowna, długotrwała i zależna od wielu czynników środowisko-wych, które mogą wpływać na wynik oceny odporności, bądź też niemożliwa do wyko-nania z uwagi na brak właściwej metody diagnostycznej.
W badaniach prowadzonych w ramach tematu zamówionego przez Komitet Badań Naukowych (nr K024/PO6/2001/GR/05) zidentyfikowano marker GP122
Sprawdzono przydatność opracowanej metody do identyfikacji odmian ziemniaka krańcowo odpornych na PVY. Zbadano 69 odmian (Flis i in. 2005), wśród nich 19 krań-cowo odpornych i 23 podatne, reprezentują-cych polskie hodowle ziemniaka (tab. 1). Specyficzny marker GP122
718 sprzężony z genem Ry-fsto. Gen Ry-fsto zmapowano na
chromosomie XII genomu ziemniaka w wyni-ku badań populacji tetraploidalnej ziemniaka, będącej krzyżówką odpornego klonu PW- -363 i podatnej odmiany Cicero. Źródłem odporności PW-363 był męskopłodny klon otrzymany z kolekcji Instytutu Roślin
Upraw-nych w Sankt Petersburgu (Flis i in. 2005). Procedura identyfikacji markera GP122718 obejmuje następujące etapy:
− izolacja DNA z liści badanej rośliny, − powielenie markera GP122718 metodą
PCR,
− potraktowanie otrzymanej mieszaniny reakcyjnej specyficznym enzymem re-strykcyjnym,
− rozdział elektroforetyczny produktów restrykcyjnych na żelu agarozowym,
− identyfikacja specyficznego fragmentu DNA o długości 718 par zasad w świetle UV w wypadku klonów odpornych na PVY.
718 zidentyfikowa-no we wszystkich badanych odmianach od-pornych, a nie wykryto w odmianach podat-nych. Źródłami odporności na PVY w testo-wanych odmianach były klony: Sto XIIB z kolekcji Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Ro-ślin, C.854 z kolekcji Szkockiego Instytutu Badania Roślin Uprawnych (SCRI) w Edyn-burgu bądź MPI 55.957/24 i MPI 55.957/54, otrzymane z Instytutu Maksa Plancka w Ko-lonii (Flis 1997). Całkowita zgodność z ocze-kiwaniami uzyskanych wyników dla pięciu źródeł odporności z jednej strony świadczy o wspólnym praźródle genu Ry-fsto,
pochodzą-cym z dzikiego gatunku Solanum
stolonife-rum, z drugiej zaś – stwarza szansę
efek-tywnego stosowania metody molekularnej dla szerokiej puli materiałów hodowlanych.
Tabela 1
Odmiany ziemniaka testowane pod kątem obecności markera GP122718
Odmiany krańcowo odporne
na PVY Marker Odmiany podatne na PVY Marker
Anielka, Barycz, Baszta, Beata, Bekas, Bzura, Dunajec, Fregata, Hinga, Klepa, Meduza, Nimfy, Omulew, Skawa, Umiak, Vistula, Ania, Gabi, Maryna
+
Arkadia, Grot, Ikar, Koga, Korona, Neptun, Triada, Balbina, Cedron, Drop, Irga, Irys, Kolia, Lena, Mors, Oda, Orłan, Perkoz, Rybitwa, Salto, Sokół, Wolfram, Żagiel
__
+ obecność markera; - brak markera
Procedura identyfikacji klonów ziemniaka krańcowo odpornych na PVY za pomocą
dotychczas stosowanych testów diagno-stycznych jest długotrwała (Chrzanowska
Ziemniak Polski 2005 nr 2 13 2001). Metodą molekularną zaś marker
GP122718 można wykrywać w jeden dzień. Jednostkowy koszt testu nie powinien być wyższy niż przy ocenie z zastosowaniem testów biologicznych i ELISA. Z pewnością warto go stosować do oceny odporności na PVY zaawansowanych rodów hodowlanych ziemniaka.
Literatura
1. Brigneti G., Garcia-Mas J., Baulcombe D. C.
1997. Molecular maping of the potato virus Y resis-tance gene Rysto in potato. – Theor. Appl. Genet. 94: 198--203; 2. Celebi-Toprak F., Slack S. A., Jahn M.
M. 2002. A new gene, Nytbr, for hypersensitivity to
Potato virus Y from Solanum tuberosum maps to
chromosome IV. – Theor. Appl. Genet. 104: 669-674;
3. Chrzanowska M. 2001. Ocena odporności i reakcji
rodów oraz odmian ziemniaka na szczepy wirusa Y ziemniaka (PVY). Monogr. Rozpr. Nauk. IHAR 10: 41-44; 4. Flis B. 1997. Źródła odporności na wirus Y ziemniaka, ich charakterystyka i wykorzystanie w
ho-dowli. – Biul. Inst. Ziemn. 48: 71-80; 5. Flis B., Hennig
J., Strzelczyk-Żyta D., Gebhardt C., Marczewski W.
2005. The Ry-fsto gene from Solanum stoloniferum for
extreme resistant to Potato virus Y maps to potato chromosome XII and is diagnosed by PCR marker GP122718 in PVY resistant potato cultivars. – Molecular
Breed. (w druku); 6. Hämäläinen J. H., Watanabe K.
N., Valkonen J. P. T., Arihara A., Plaisted R. L., Pehu E., Miller L., Slack S. A. 1997. Mapping and
marker-assisted selection for a gene for extreme resis-tance to potato virus Y. – Theor. Appl. Genet. 94: 192-197; 7. Hosaka K., Hosaka Y., Mori M., Maida T.,
Matsunaga H. 2001. Detection of a simplex RAPD
marker linked to resistance to potato virus Y in a tetra-ploid potato. – Am. J. Potato Res. 78: 191-196;
8. Świeżyński K. M. 1994. Inheritance of resistance to
viruses. In: Bradshaw J. E., Mackay G. R. (eds). Po-tato Genetics. CAB Int., Wallingford, UK: 339-363;
9. Valkonen J. P. T., Jones R. A. C., Slack S. A., Watanabe K. N. 1996. Resistance specificities to
viruses in potato: Standardization of nomenclature. – Plant Breed. 115: 433-438
