Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 62 (5), 563-565, 2006

(1)

Medycyna Wet. 2006, 62 (5) 563

Praca oryginalna Original paper

Zapalenie wymienia nale¿y do najbardziej kosztow-nych i trudkosztow-nych do opanowania metodami weteryna-ryjnymi chorób byd³a mlecznego. Stwierdzono gene-tyczne ró¿nice w podatnoci krów na tê chorobê (5). Mechanizmy ró¿nic w genetycznej sk³onnoci do za-chorowania nie zosta³y jeszcze do koñca poznane. Przypuszcza siê, ¿e wystêpowanie tej choroby zale¿y od wielu genów. Identyfikacja tych genów pozwoli³a-by na zwiêkszenie efektywnoci selekcji pozwoli³a-byd³a mlecz-nego w kierunku poprawy zdrowia wymienia poprzez prowadzenie selekcji wspomaganej markerami gene-tycznymi. Poszukiwanie markerów genetycznych obej-muje, miêdzy innymi, poszukiwanie genów, których produkty wp³ywaj¹ bezporednio na poziom badanej cechy (6).

Do identyfikacji markera genetycznego mastitis konieczne jest wykorzystanie informacji o funkcji genu w organizmie. Wa¿ne jest równie¿ znalezienie powi¹-zania pomiêdzy ró¿nymi allelami genu a wystêpowa-niem choroby.

Geny g³ównego uk³adu zgodnoci tkankowej (MHC) odgrywaj¹ wa¿n¹ rolê w regulacji odpowiedzi immu-nologicznej. Z tego powodu zainteresowano siê zwi¹z-kiem pomiêdzy genami BoLA klasy II a wystêpowa-niem mastitis u krów (3, 10-12). Produkty genów BoLA klasy II odgrywaj¹ wa¿n¹ rolê podczas prezen-tacji antygenu limfocytom T oraz wp³ywaj¹ na liczbê i rodzaj komórek T (1). Sporód genów BoLA klasy II najbardziej obiecuj¹cy wydaje siê zwi¹zek genu

BoLA--DRB3 z zapaleniem wymienia (7). Gen ten u byd³a zlokalizowano na 23 chromosomie. W genie BoLA--DRB3 ekson 2 jest wa¿ny funkcjonalnie, poniewa¿ koduje miejsce wi¹zania peptydów i w zwi¹zku z tym wp³ywa na mo¿liwoæ immunologicznego rozpozna-wania obcych bia³ek. Dotychczasowe badania wska-zuj¹ na powi¹zanie miejsc polimorficznych w eksonie 2 tego genu z wystêpowaniem stanu zapalnego wy-mienia u krów (7).

Badania genów warunkuj¹cych podatnoæ na ma-stitis dotycz¹ równie¿ polimorfizmu genu laktofery-ny. Laktoferyna jest bia³kiem wielofunkcyjnym, ale jego g³ównym zadaniem jest zapobieganie infekcjom bakteryjnym. Jest to powodowane prawdopodobnie du¿ym powinowactwem laktoferyny do jonów Fe3+_,

czerpaniem ich ze rodowiska i pozbawieniem bakte-rii ¿elaza koniecznego do ich wzrostu (2). Gen lakto-feryny wystêpuje w chromosomie 22 u byd³a i jest zbudowany z 17 eksonów. Mimo ¿e mechanizm dzia-³ania laktoferyny nie zosta³ jeszcze do koñca poznany, wiadomo, ¿e poziom tego bia³ka wzrasta znacznie podczas infekcji gruczo³u mlekowego. Prowadzone by³y prace nad poszukiwaniem powi¹zania pomiêdzy polimorfizmem genu laktoferyny a wystêpowaniem mastitis u krów (4, 8). Z powodu wa¿nej roli genów BoLA-DRB3 i laktoferyny w reakcji na infekcje bak-teryjne, geny te zosta³y w³¹czone do badañ, których celem dalekosiê¿nym jest identyfikacja markerów ge-netycznych mastitis. Badanie markerów gege-netycznych obejmuje równie¿ okrelenie wspó³dzia³ania genów BoLA-DRB3 i laktoferyny na wystêpowanie mastitis.

Ocena wp³ywu polimorfizmu wybranych genów

na wystêpowanie mastitis u krów*

)

GRA¯YNA SENDER, AGNIESZKA KORWIN-KOSSAKOWSKA, KARIMA GALAL ABDEL HAMEID, BEATA PRUSAK

Instytut Genetyki i Hodowli Zwierz¹t PAN, 05-552 Wólka Kosowska, Jastrzêbiec

Sender G., Korwin-Kossakowska A., Hameid K. G. A., Prusak B.

Association of the polymorphism of some genes with the occurrence of mastitis in cattle Summary

The purpose of this study was to investigate the association of the lactoferrin alleles and interaction of BoLA-DRB3 and lactoferrin alleles with the somatic cell count in cow milk. The polymorphism of the lactoferrin gene was identified in blood samples collected from 125 cows. Udder health was determined by test - day milk somatic cell count. Lactoferrin genotype BB was significantly (p<0.01) associated with a decrease of the somatic cell count in cow milk. Due to the small sample the relationship between interaction of BB lactoferrin genotype and BoLA-DRB3*16 with somatic cell count were not established.

Keywords: mastitis, genetic markers, lactoferrin gene

(2)

Medycyna Wet. 2006, 62 (5) 564

Celem badañ by³o okrelenie wp³ywu polimorfizmu genu laktoferyny i interakcji genotypu BoLA-DRB3 i laktoferyny na liczbê komórek somatycznych w mle-ku krów.

Materia³ i metody

Badaniami objêto 125 krów rasy holsztyñskiej utrzymy-wanych w oborze nale¿¹cej do Instytutu Genetyki i Ho-dowli Zwierz¹t PAN w Jastrzêbcu. Do okrelania stanu zdrowia wymienia pos³u¿y³y wyniki comiesiêcznych ba-dañ liczby komórek somatycznych (wskanik zapalenia wymienia) oznaczone w próbkach mleka pobieranych w czasie kontroli u¿ytkowoci mlecznej badanych zwie-rz¹t. Ocenê stanu zdrowia wymienia przeprowadzono na podstawie nie mniej ni¿ piêciu oznaczeñ liczby komórek somatycznych w próbkach mleka w czasie co najmniej jed-nej laktacji.

Próbki krwi pobrane od krów pos³u¿y³y do okrelenia polimorfizmu genów BoLA-DRB3 i laktoferyny. DNA izo-lowano z leukocytów krwi wykorzystuj¹c gotowy zestaw do izolacji DNA Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega). Do okrelenia polimorfizmu genu BoLA-DRB3 wykorzystano metodê MPT-PCR (multi-primer target PCR) (7). Polimorfizm genu laktoferyny okrelano metod¹ RFLP--PCR. Do amplifikacji fragmentu DNA o d³ugoci 301 par zasad wykorzystano primery dobrane we wczeniejszych badaniach (9). Otrzymany fragment DNA trawiono enzy-mem restrykcyjnym EcoR1. Miejsce restrykcyjne znajdo-wa³o siê w intronie 6 tego genu. W wyniku trawienia enzy-mem restrykcyjnym otrzymano dwa allele. W przypadku nie wystêpowania miejsca restrykcyjnego otrzymano allel A o d³ugoci 301 par zasad. Natomiast allel B by³ trawiony na dwa fragmenty o d³ugoci 201 i 100 par zasad (9).

Opracowanie statystyczne materia³u mia³o na celu wy-kazanie zale¿noci pomiêdzy genotypem genu laktoferyny a liczb¹ komórek somatycznych. Przeanalizowano równie¿ zale¿noæ pomiêdzy interakcj¹ genotypu BoLA-DRB3 i laktoferyny a stanem zdrowia gruczo³u mlekowego mie-rzonego liczb¹ komórek somatycznych. Do obliczeñ wy-korzystano procedurê GLM pakietu SAS. W modelu sta-tystycznym s³u¿¹cym do analizy logarytmu liczby komó-rek somatycznych w mleku badanych krów uwzglêdniono: genotyp badanych zwierz¹t, powtarzalnoæ wyników do-tycz¹cych zwierzêcia zagnie¿d¿onego w genotypie (lub interakcji genotypów BoLA-DRB3 i laktoferyny), numer laktacji, rok i sezon badania, dzieñ laktacji i wydajnoæ mle-ka. Wp³yw dnia laktacji i wydajnoci mleka na liczbê ko-mórek somatycznych uwzglêdniono w modelu jako regres-jê. Istotnoæ ró¿nic pomiêdzy poziomem liczby komórek somatycznych w grupach krów reprezentuj¹cych ró¿ne ge-notypy laktoferyny i ró¿ne interakcje genotypów BoLA--DRB3 i laktoferyny wykonano za pomoc¹ testu Duncana. W modelu nie uwzglêdniono wp³ywu buhaja, poniewa¿ badane zwierzêta pochodzi³y po 54 ojcach (rednio 2,5 córki na buhaja). W przypadku takiej struktury populacji mo¿na za³o¿yæ, ¿e wp³yw genotypu ojca by³ losowy.

Wyniki i omówienie

W badanej populacji krów stwierdzono czêstoæ al-lelu A laktoferyny wynosz¹c¹ 80% natomiast alal-lelu B

20%. Czêstoci alleli laktoferyny by³y zbli¿one do podawanych wczeniej przez innych autorów (9).

W tab. 1 przedstawiono liczbê komórek somatycz-nych w zale¿noci od genotypu laktoferyny. Najni¿-sz¹ liczbê komórek somatycznych stwierdzono w gru-pie krów z genotypem BB. Grupa ta ró¿ni³a siê istot-nie (p < 0,01) od grupy krów z allelem AA oraz krów heterozygotycznych (tab. 1). Najwy¿sz¹ liczb¹ komó-rek somatycznych charakteryzowa³y siê krowy o ge-notypie AB laktoferyny i ró¿ni³y siê istotnie (p < 0,01) od zwierz¹t z pozosta³ymi genotypami. Niestety, gru-pa osobników z korzystnym pod wzglêdem wystêpo-wania mastitis allelem B by³a nieliczna i dlatego ba-dania te wymagaj¹ potwierdzenia na wiêkszym mate-riale. Badany polimorfizm wystêpowa³ w intronie 6 genu laktoferyny. Zmiana ta nie mia³a charakteru funkcjonalnego i nie przek³ada³a siê na sekwencjê ko-dowanych bia³ek. Jednak¿e omawiany polimorfizm mo¿e byæ cennym markerem liczby komórek soma-tycznych w mleku. W dotychczasowych badaniach nie znaleziono istotnych zale¿noci pomiêdzy polimorfi-zmem genu laktoferyny wystêpuj¹cym w eksonach a wystêpowaniem mastitis. Autorzy przypuszczaj¹, ¿e mog³o to byæ spowodowane zbyt ma³¹ liczb¹ bada-nych zwierz¹t (4). Liczebnoæ badabada-nych zwierz¹t (4) by³a nieco mniejsza ni¿ w naszych badaniach, a jed-nak poszukiwano zale¿noci pomiêdzy polimorfizmem genu laktoferyny a wystêpowaniem mastitis. W wiet-le innych wyników (4) tym cenniejsze wydaje siê osza-cowanie istotnych ró¿nic liczby komórek somatycz-nych w zale¿noci od genotypu laktoferyny w tak nie-wielkiej populacji.

We wczeniejszych badaniach genów determinuj¹-cych podatnoæ na zapalenie gruczo³u mlekowego,

Tab. 1. Zale¿noæ pomiêdzy liczb¹ komórek somatycznych a genotypem laktoferyny (x ± se)

Objanienie: a, b, c rednie oznaczone ró¿nymi literami ró¿ni¹ siê istotnie przy p £ 0,01

y n y r e f o t k a l p y t o n e G n Liczbakomóreksomatycznych l(og) A A 83 5,76a_±₀_,₄₄ B B 35 5,47b_±₀_,₄₀ B A 37 6,03c_±₀_,₃₇

Objanienie: jak w tab. 1.

Tab. 2. Zale¿noæ pomiêdzy liczb¹ komórek somatycznych a interakcj¹ genotypów BoLA-DRB3 i laktoferyny (x ± se)

y p y t o n e g e n a r b y W y n y r e f o t k a l i 3 B R D -A L o B n Liczbakomórel(okgs)omatycznych n / 6 1 A A 18 5,60a_±₀_,₅₀ n / 3 2 A A 13 6,48b_±₀_,₅₃ n / n A A 50 5,60a_±₀_,₃₈ n / 6 1 B A 10 5,59a_±₀_,₄₄ n / 3 2 B A 15 6,85c_±₀_,₄₂ n / n B A 19 5,94d_±₀_,₃₂

(3)

Medycyna Wet. 2006, 62 (5) 565 przeprowadzonych na tym samym materiale,

stwier-dzono powi¹zanie allelu BoLA DRB3.2*16 z obni¿e-niem liczby komórek somatycznych w mleku krów (7). Podobne wyniki w stosunku do allelu BoLA DRB3.2*16 uzyskali równie¿ inni autorzy (10-12). Stwierdzili oni istotny spadek liczby komórek soma-tycznych w grupie krów bêd¹cych nosicielkami tego allelu. W zwi¹zku z tym w badanej populacji przeana-lizowano wp³yw interakcji genotypów BoLA-DRB3 i laktoferyny na liczbê komórek somatycznych (tab. 2). Krowy o genotypach AA i AB laktoferyny oraz bêd¹-ce jednoczenie nosicielkami allelu BoLA-DRB3*16 charakteryzowa³y siê istotnie (p < 0,01) ni¿sz¹ liczb¹ komórek somatycznych w mleku w stosunku do krów bêd¹cych nosicielkami allelu BoLA-DRB3*23. Rów-nie¿ zwierzêta o genotypie laktoferyny AA nie bêd¹ce nosicielkami alleli BoLA-DRB3*16 i 23 mia³y istot-nie ni¿sz¹ liczbê komórek somatycznych w stosunku do krów o genotypie laktoferyny AA bêd¹cych nosi-cielkami allelu BoLA-DRB3*23. Z drugiej strony, kro-wy o genotypie AB laktoferyny, u których nie kro- wystê-powa³ allelu BoLA-DRB3*16, charakteryzowa³y siê istotnie (p < 0,01) wy¿sz¹ liczb¹ komórek somatycz-nych. Z powodu zbyt ma³ej liczebnoci nie wszystkie warianty interakcji mog³y byæ przeanalizowane. Jed-nak¿e najmniej korzystna z punktu widzenia wystê-powania mastitis wydaje siê interakcja genotypów BoLA-DRB3*23 i AB laktoferyny. Badanie interakcji dwóch genów wykaza³o, ¿e na³o¿enie siê wp³ywu dwóch genów pozwoli³oby wyeliminowaæ z populacji osobniki najbardziej pogarszaj¹ce liczbê komórek so-matycznych.

Podsumowuj¹c, najbardziej korzystnym z punktu widzenia ograniczenia wystêpowania mastitis wydaje siê genotyp BB laktoferyny, jednak¿e wystêpuje on w populacji byd³a z nisk¹ czêstotliwoci¹. Warto za-znaczyæ, ¿e zwierzêta charakteryzuj¹ce siê tym geno-typem nie by³y spokrewnione. Z powodu niskiej frek-wencji genotypu BB laktoferyny niemo¿liwe by³o uwzglêdnienie wp³ywu interakcji genotypu BB

lakto-feryny i BoLA-DRB3*16 na liczbê komórek somatycz-nych w mleku krów. Oczekuje siê, ¿e osobniki, u któ-rych wystêpuje ta interakcja, bêd¹ najmniej podatne na zapalenie wymienia, wymaga to jednak dalszych badañ.

Pimiennictwo

1.Buczek J., Deptu³a W., Gliñski Z., Jarosz J., Stosik M., Wernicki A.: Immuno-logia porównawcza i rozwojowa zwierz¹t. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa 2000, 277-345.

2.Fang W., Oliver S. P.: Identification of lactoferrin-binding proteins in bovine mastitis-causing Streptococcus uberis. FEMS Microbiol. Lett. 1999, 176, 91-96.

3.Kelm S. C., Detilleux J. C., Freeman A. E., Kehrli M. E., Dietz A. B., Fox L. K., Butler J. E., Kasckovics I., Kelley D. H.: Genetic association between para-meters of innate immunity and measures of mastitis in periparturient Hol-stein cattle. J. Dairy Sci. 1997, 80, 1767-1775.

4.Li G., Zhang Y., Sun D., Li N.: Study on the polymorphism of bovine lacto-ferrin gene and its relationship with mastitis. Animal Biotechnol. 2004, 15, 67-76.

5.Sender G.: Odpornoæ na mastitis jako sk³adowa celu hodowlanego w pro-gramach doskonalenia byd³a mlecznego. Prace Mat. Zoot. 2001, 12 zesz. specj. 1-61.

6.Sender G., Korwin-Kossakowska A., Stepiñska U.: Wykorzystanie marke-rów genetycznych w programie zwalczania mastitis. Medycyna Wet. 2003, 59, 853-856.

7.Sender G., Korwin-Kossakowska A., Gralak B.: Wp³yw polimorfizmu genu BoLA-DRB3 na wystêpowanie mastitis u krów. Medycyna Wet. 2005, 61, 540-542.

8.Seyfert H. M., Henke M., Interthal H., Klussmann U., Koczan D., Natour S., Pusch W., Senft B., Steinhoff U. M., Tuckoricz A., Hobom G.: Defining can-didate genes for mastitis resistance in cattle: the role of lactoferrin and lyso-syme. J. Anim. Breed. Genet. 1996, 113, 269-276.

9.Seyfert H. M., Kuhn C.: Characterization on a first bovine lactoferrin gene variant, based on an EcoRI polymorphism. Anim. Genet. 1994, 25, 54. 10.Sharif S., Mallard B. A., Sargeant J. M.: Presence of glutamine at position

74 of pocket 4 in the BoLA-DR antigen binding groove is associated with occurrence of clinical mastitis caused by Staphylococcus species. Vet. Im-munol. Immunopathol. 2000, 76, 231-238.

11.Sharif S., Mallard B. A., Wilkie B. N., Sargeant J. M., Scott H. M., Dek-kers J. C. M., Leslie K. E.: Associations of the bovine major histocompatibi-lity complex DRB3 (BoLA-DRB3) alleles with occurrence of disease and milk somatic cell score in Canadian dairy cattle. Anim. Genet. 1998, 29, 185-193.

12.Starkenburg R. J., Hansen L. B., Kehrli M. E., Chester-Jones H.: Frequen-cies and effects of alternative DRB3.2 alleles of bovine lymphocyte antigen for Holsteins in milk selection and control lines. J. Dairy Sci. 1997, 80, 3411--3419.

Adres autora: doc. dr hab. Gra¿yna Sender, ul. G³ówna 26, 05-500 ¯a-bieniec; e-mail: g.sender@ighz.pl