Artyku³ przegl¹dowy Review
Zbyt intensywne i powszechne wykorzystanie anty-biotyków w XX wieku przyczyni³o siê do powstania du¿ej liczby wieloopornych patogenów na tego rodza-ju leki. Opracowanie nowych strategii zwalczania patogenów jest koniecznoci¹ XXI wieku. Wysi³ki naukowców i przemys³u farmaceutycznego zmierzaj¹ do odkrycia i opracowania technologii wytwarzania nowych rodków przeciwdrobnoustrojowych przy wy-korzystaniu technik biologii molekularnej, genetyki, a ostatnio tak¿e genomiki bakterii. Peptydy produko-wane przez owady, p³azy, ssaki i bakterie, o w³aciwo-ciach cytotoksycznych, nie tylko w stosunku do bakte-rii, w tym mykobaktebakte-rii, ale i grzybów, i otoczkowych wirusów s¹ jedn¹ z grup, maj¹cych perspektywy wyko-rzystania w terapii przeciwko patogenom, gdy¿ s¹ one naturalnymi antybiotykami, ochraniaj¹cymi komórki, które je produkuj¹. Wyró¿nia siê kilka klas peptydów w zale¿noci od ich potencja³u elektrycznego, w³asno-ci, trzeciorzêdowej struktury oraz homologii sekwen-cji (13, 20). Ze wzglêdu na potencja³ elektryczny
wy-ró¿nia siê peptydy anionowe i kationowe. Dotychczas wyizolowano jedynie trzy peptydy anionowe z nab³on-ka dróg oddechowych owiec z chronicznym zapaleniem p³uc, spowodowanym przez Mannheimia haemolytica (8). Natomiast wród peptydów kationowych Brogden i wsp. (4) wyró¿nili peptydy: liniowe, heliakalne, amfi-patyczne lub peptydy z dwoma wi¹zaniami disiarczko-wymi; liniowe, zawieraj¹ce du¿¹ liczbê reszt proliny, argininy, glicyny lub tryptofanu oraz stabilizowane cys-tein¹ ze struktur¹ beta-harmonijkow¹.
Celem opracowania by³o dokonanie przegl¹du prze-ciwdrobnoustrojowych peptydów, nale¿¹cych do tych klas i rodzin, które wystêpuj¹ u ludzi i wa¿niejszych, z gospodarczego punktu widzenia, gatunków zwierz¹t. Przedyskutowano równie¿ mo¿liwoæ wykorzystania ich w terapii i profilaktyce.
Grupy peptydów kationowych
Peptydy kationowe s¹ szeroko rozpowszechnione w naturze. Wytwarzaj¹ je roliny, bakterie i zwierzêta, w tym równie¿ zwierzêta domowe. Znacznie ró¿ni¹ siê sk³adem, struktur¹ i miejscem ekspresji w ró¿nych tkan-kach i narz¹dach u ró¿nych gatunków (20), ale wspól-n¹ cech¹ wszystkich poznanych dotychczas
kationo-Peptydy przeciwdrobnoustrojowe
w zwalczaniu patogenów opornych
na powszechnie stosowane antybiotyki*
)
EMILIA BAGNICKA, NINA STRZA£KOWSKA, ARTUR JÓWIK,
JAROS£AW O. HORBAÑCZUK, JÓZEF KRZY¯EWSKI, LECH ZWIERZCHOWSKI
Instytut Genetyki i Hodowli Zwierz¹t PAN w Jastrzêbcu, ul. Postêpu 1, 05-552 Wólka Kosowska
Bagnicka E., Strza³kowska N., Jówik A., Horbañczuk J. O., Krzy¿ewski J., Zwierzchowski L.
Antimicrobial peptides in overcoming the resistance of pathogens to commonly used antibiotics Summary
The common abuse of antibiotics during the twentieth century caused the development of many multi-resistant pathogens to classic antibiotics. To find new strategies to fight against multi-resistant pathogens is the challenge of the twenty-first century. Since they seem to be natural antibiotics, peptides produced by bacteria, insects, amphibians and mammals with cytotoxic activities against bacteria, mycobacteria, fungi and enveloped viruses are one of the groups with prospects for use in therapy against pathogens. Such peptides protect the cells which produce them. Cationic peptides are a huge group of antimicrobial peptides, consisting of a number of families, e.g. defensins and cathelicidins. Their expression was initially found in phagocyte cells, like macrophages and neutrophiles as well as in epithelial cells. The aim of this study was to present a review of antimicrobial peptides identified in humans and in economically important farm animals and to discuss the possibilities of using them in therapy and prophylaxis.
Keywords: antimicrobial peptides, human, farm animals
*) Praca wykonana w ramach projektu BIO¯YWNOÆ innowacyjne,
funk-cjonalne produkty pochodzenia zwierzêcego nr POIG.01.01.02-014-090/09 wspó³finansowanego przez Uniê Europejsk¹ ze rodków Europejskiego Fundu-szu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka 2007-2013.
wych peptydów jest sk³onnoæ do tworzenia struktury amfipatycznej w obecnoci podwójnych warstw lipi-dowych b³on komórkowych. Ta cecha pozwala im na interakcjê z b³onami mikroorganizmów, co prowadzi do ich lizy i w konsekwencji do mierci. Ma³y rozmiar tych peptydów powoduje, ¿e s¹ niezwykle odporne na degradacjê przez peptydazy. Dziêki temu mog¹ te¿ zwalczaæ infekcje niewykryte przez inne sk³adniki uk³a-du immunologicznego. Mo¿na je uznaæ za dziedziczne efektory odpornoci. Dziêki temu, ¿e ekspresja tych peptydów pobudzana jest przez proste sygna³y oraz ¿e mog¹ byæ produkowane i rozprzestrzeniane szybciej ni¿ przeciwcia³a, ich obecnoæ pozwala na szybsz¹ odpo-wied obronn¹ organizmu w porównaniu z tempem namna¿ania siê drobnoustrojów. Ponadto ten chemicz-ny system obrony czêciowo wspomaga si³y obronne organizmu w przypadku czasowego lub trwa³ego uszko-dzenia klasycznego uk³adu odpornociowego (35).
Kationowe peptydy liniowe, peptydy amfipatycz-ne ze struktur¹ alfa-helix lub peptydy z jednym lub dwoma wi¹zaniami disiarczkowymi. Do tej grupy zaliczane s¹ peptydy amfipatyczne, formuj¹ce spiralê á-helix, jak i peptydy liniowe, zawieraj¹ce du¿¹ liczbê reszt proliny, argininy b¹d tryptofanu oraz peptydy z jednym lub dwoma wi¹zaniami disiarczkowymi (29). W ich sk³adzie nie ma cysteiny. W rodku ³añcucha mog¹ mieæ struktury o charakterze zawiasu lub sup-³a. Do tej grupy zaliczane s¹ szpikowe prekursory pep-tydowe o dzia³aniu przeciwdrobnoustrojowym, zwane katelicydynami. Ró¿ni¹ siê one struktur¹, sekwencj¹ oraz liczb¹ (od 12 to 79) reszt aminokwasowych. Po-wstaj¹ z prepropeptydów, które syntetyzowane s¹ w ko-mórkach szpiku kostnego, a przechowywane w wydziel-niczych ziarnistociach neutrofilów (29, 37). Peptydy te zawieraj¹ wysoko konserwatywn¹ sekwencjê sygna-³ow¹ i region wysoko homologiczny do kateliny inhi-bitora L katepsyny. Niektóre sporód tych propeptydów przyjmuj¹ strukturê á-helikaln¹ lub zawieraj¹ jeden lub dwa mostki disiarczkowe, inne natomiast zawieraj¹ znaczn¹ liczbê reszt proliny, argininy lub tryprofanu. Niektóre z nich poza w³aciwociami bakteriobójczy-mi pe³ni¹ dodatkow¹ funkcjê polegaj¹c¹ na neutraliza-cji lipopolisacharydów (LPS) i wspomaganiu gojenia siê ran (39).
W organizmie ludzkim stwierdzono ekspresjê tylko jednego genu katelicydyny (20). Zbudowana jest ona z 37 reszt aminokwasowych i posiada strukturê liniow¹, gdy¿ w swym sk³adzie nie zawiera cystein. W hydrofil-nym rodowisku peptyd ten przyjmuje konformacjê zwoju, natomiast w hydrofobowym strukturê á-heli-kaln¹ (36). Katelicydyna ludzka (LL-37/hCAP-18) jest obecna m.in. w: komórkach nab³onkowych pêcherzy-ków p³ucnych, komórkach surowiczych, b³on luzo-wych gruczo³ów podluzówkoluzo-wych, naj¹drzy, keraty-nocytów, skóry, przewodu pokarmowego i uk³adu od-dechowego. Ponadto peptyd ten wystêpuje we wtórnych ziarnistociach neutrofilów, monocytach, komórkach NK, limfocytach T i B (20, 21). Oprócz aktywnoci przeciwdrobnoustrojowej katelicydyna jest równie¿ che-motaktyczna dla: neutrofilów, monocytów, komórek
tucznych, komórek T. Ponadto indukuje degranulacjê komórek tucznych, wp³ywa na funkcjê makrofagów, stymuluje unaczynienie i reepitalizacjê zranionej skóry (38) oraz wykazuje aktywnoæ przeciwnowotworow¹ (25). Wykazuje ona równie¿ dzia³anie cytotoksyczne w stosunki do normalnych komórek ssaków. U zwie-rz¹t gospodarskich do rodziny katelicydyn zalicza siê, poza cekropin¹ P1 zidentyfikowan¹ u wiñ, tak¿e szpi-kowe antybakteryjne peptydy (myeloid antimicrobial peptides MAPs) wystêpuj¹ce w tkankach wiñ (PMAP), owiec (SMAP29 i SMAP34), byd³a (BMAP) oraz koni (eCATH-1, -2 i -3) (4, 33). Leukocyty byd³a i wiñ zawieraj¹ co najmniej po 10 ró¿nych katelicy-dyn (21). Peptydy szpikowe PMAP23 izolowane u wiñ, z C-koñcem zawieraj¹cym tryptofan, wykazuj¹ in vitro aktywnoæ przeciwko bakteriom Gram-ujemnym, Gram-dodatnim, dro¿d¿om i pleniom (40). Wyniki badañ in vitro, jak i in vivo na owcach wykaza³y sku-tecznoæ dzia³ania SMAP29 przeciwko Mannheimia ha-emolytica, patogenowi wystêpuj¹cemu w uk³adzie od-dechowym prze¿uwaczy. SMAP29 (zwane równie¿ SC5) i SMAP34 s¹ potencjalnymi kandydatami do wykorzystania w terapii przeciwko ostrym i przewlek-³ym zaka¿eniom uk³adu oddechowego (5). SMAP29 wykazuje równie¿ siln¹ aktywnoæ przeciwko niektó-rym wa¿nym klinicznym izolatom, w³¹czaj¹c oporne na antybiotyki szczepy Staphylococcus aureus, Ente-rococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa i Crypto-coccus neoformans (32). Guthmiller i wsp. (12) wyka-zali natomiast wysok¹ wra¿liwoæ Actinobacillus acti-nomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum i Esche-richia coli na dzia³anie SMAP29 przy stê¿eniu 10 µg/ mL. Grzyby Candida krusei i Candida tropicalis by³y zabijane, a rozwój Streptococcus sanguis i Candida albicans by³ hamowany przy koncentracji min. 50 µg/ mL. Peptyd BMAP34 jest magazynowany jako prekur-sor w cytoplazmatycznych ziarnistociach bydlêcych neutrofilów i wykazuje szerokie spektrum dzia³ania zarówno przeciwko bakteriom Gram-ujemnym, jak i Gram-dodatnim. Nie jest natomiast aktywny w sto-sunku do komórek Eukariota (4). Oprócz wspomnia-nego peptydu BMAP34 do rodziny bydlêcych katelicy-dyn nale¿y równie¿ BMAP27 i -28 (29). Peptydy szpi-kowe wystêpuj¹ce u koni równie¿ wykazuj¹ aktywnoæ przeciwko bakteriom Gram-ujemnym i Gram-dodatnim (4). Geny dwóch koñskich katelicydyn: eCATH-2 i -3 s¹ genami funkcjonalnymi i ich produkty s¹ obecne w neutrofilach, natomiast gen eCATH-1 nie jest zdolny do kodowania polipeptydu. Dojrza³e peptydy tych dwóch katelicydyn wykryto w stanach zapalnych, co sugeruje, i¿ dojrzewanie prepropetydów nastêpuje po aktywacji neutrofilów (28). Jak podaj¹ Wiechu³a i wsp. (37), katelicydyny odgrywaj¹ równie¿ rolê jako media-tory przeciwzapalne, wp³ywaj¹ce na proliferacjê komó-rek i ich migracjê, procesy immunomodulacji, gojenia siê ran, angiogenezy, uwalniania cytokin i histaminy. Peptydy zawieraj¹ce du¿¹ liczbê reszt proliny i argini-ny s¹ bardziej aktywne przeciwko bakteriom Gram--ujemnym ni¿ Gram-dodatnim. Inne peptydy helikalne i zawieraj¹ce du¿¹ liczbê reszt tryptofanu wykazuj¹
jed-nakowo wysok¹ aktywnoæ przeciwko obydwu szcze-pom bakterii (39).
Kationowe peptydy liniowe, zawieraj¹ce du¿¹ licz-bê reszt proliny, argininy, glicyny lub tryptofanu. S¹ to peptydy liniowe, o wielkoci 40-80 reszt amino-kwasowych. Brak w ich sk³adzie cysteiny, zawieraj¹ natomiast du¿¹ liczbê niektórych aminokwasów np.: prolinê, argininê, glicynê lub tryptofan. Mog¹ formo-waæ rozci¹gniêty zwój. Do grupy tej zalicza siê bakte-necyny, profeinê i indolicydynê (4). Baktenecyny s¹ pep-tydami zawieraj¹cymi du¿¹ liczbê reszt argininy, wy-stêpuj¹cymi w neutrofilach byd³a, owiec i kóz (10, 31). Peptydy izolowane u byd³a: Bac5 i -7 w swym sk³adzie zawieraj¹ ponad 45% reszt proliny i ponad 23% argini-ny (10). Kolejargini-nym liniowym peptydem, zawieraj¹cym prolinê (3), izolowanym z du¿ych cytoplazmatycznych granul bydlêcych neutrofilów jest 13-aminokwasowa indolicydyna, zawieraj¹ca równie¿ du¿¹ liczbê reszt tryptofanu (5), wykazuj¹ca aktywnoæ przeciwko bak-teriom Gram-ujemnym i Gram-dodatnim (30).
U owiec stwierdzono obecnoæ w leukocytach dwóch baktenecyn (OaBac5á i -â), natomiast u kóz jednej ((Ch)Bac). Shamova i wsp. (31) stwierdzili, ¿e owcza OaBac5á i kozia (Ch)Bac wykazuj¹ wysok¹ aktywnoæ przeciwko bakteriom Escherichia coli, Salmonella Typhimurium i Pseudomonas aeruginosa. Huttner i wsp. (16) podaj¹, ¿e geny czterech peptydów, zawieraj¹cych du¿¹ liczbê reszt proliny lub argininy, tj. OaBac5, -6, -7.5 i -6 zidentyfikowano u owiec w chromosomie 19. Boman (3) wydzieli³ baktenecyny wraz z brewininami (brevinina-1 i -2) wystêpuj¹cymi u ¿ab i byd³a w od-rêbn¹ grupê peptydów ze struktur¹ pêtli, z jednym, wewn¹trzcz¹steczkowym wi¹zaniem disiarczkowym. Peptydy te, sk³adaj¹ce siê z 12 reszt aminokwasowych (w tym z 4 reszt argininy), charakteryzuj¹ siê central-nie po³o¿on¹ pêtl¹, zbudowan¹ z 9 aminokwasów utrzy-mywanych razem przez jeden mostek disiarczkowy. Hancock (13) do klasy kationowych peptydów ze struk-tur¹ pêtli, oprócz baktenecyn, zaliczy³ równie¿ grami-cydyny i polimyksyny, zidentyfikowane u bakterii.
U wiñ wyizolowano dwie formy peptydu z du¿¹ licz-b¹ reszt proliny i argininy (PR-39 i âPR-39), które s¹ aktywne w stosunku do bakterii Gram-ujemnych oraz profeniny-1 i -2, zawdziêczaj¹ce sw¹ nazwê du¿ej licz-bie reszt proliny (57,1%) i fenyloalaniny (19,0%) (41). Peptydy kationowe stabilizowane cystein¹ ze struktur¹ beta-harmonijkow¹. Bardzo obiecuj¹c¹ grup¹ peptydów, które w przysz³oci mog³yby byæ wykorzystane do zwalczania patogenów, s¹ peptydy sta-bilizowane cystein¹, ze struktur¹ â-antyharmonijkow¹. Peptydy te zawieraj¹ od 16 do 40 reszt aminokwaso-wych, maj¹ dwa lub wiêcej mostków disiarczkowych (4). Z powodu zawartoci du¿ej liczby reszt arginino-wych posiadaj¹ one bardzo silny charakter zasadowy (3). Defensyny s¹ wysokokationowe defensyny ssa-ków maj¹ ³adunek od +6 do +12 (34). Grupa ta obej-muje protegryny oraz á-, â- i è-defensyny (4). Defen-syny wykazuj¹ aktywnoæ przeciwko bakteriom, grzy-bom, komórkom rakowym i otoczkowym wirusom oraz uczestnicz¹ w tzw. tlenowo-niezale¿nym systemie
obronnym neutrofilów i makrofagów (17). Dok³adn¹ analizê przedstawicieli rodziny beta-defensyn, ziden-tyfikowanych u zwierz¹t gospodarskich przedstawili Bagnicka i wsp. (1).
Rodzina peptydów omio- i dziesiêciocysteino-wych. W ostatnim 10-leciu XX wieku Krause i wsp. (19) oraz Park i wsp. (26) zidentyfikowali u ludzi peptyd o w³aciwociach antybakteryjnych, zawieraj¹-cy 8 zawieraj¹-cystein, tworz¹zawieraj¹-cych 4 mostki disiarczkowe, o d³u-goci 20, 22 lub 25 aminokwasów. Oba zespo³y naj-wy¿sz¹ ekspresjê tego peptydu stwierdzi³y w w¹trobie, nazywaj¹c go, odpowiednio, Liver-expressed anti-microbial peptide (LEAP-1) i hepcydyna (hHEPC). Obecnie obowi¹zuj¹ca nazwa to hepcydyna. Krause i wsp. (19), badaj¹c ekspresjê tego genu w wielu tkan-kach metod¹ Real-Time RT-PCR, podali, ¿e jego eks-presja w w¹trobie jest ponad 1500 razy wiêksza w po-równaniu z najni¿sz¹ ekspresj¹ wystêpuj¹c¹ w nerkach. Stwierdzono, ¿e ekspresja tego genu w innych tkan-kach jest znacznie ni¿sza ni¿ w w¹trobie, natomiast w sercu jest 100 razy, a w mózgu oko³o 20 razy wy¿sza ni¿ w nerkach. Ekspresja w p³ucach, j¹drach, tchawicy, liniankach, prostacie, nadnerczu, tarczycy, pêche-rzu, dwunastnicy i ¿o³¹dku zawiera³a siê w przedziale, odpowiednio, od 5- do 1-krotnoci w stosunku do po-ziomu ekspresji genu w nerkach. Peptyd ten wyka-zuje aktywnoæ przeciwko bakteriom Gram-dodatnim (Bacillus megaterium, B. subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus carnosus) oraz Gram-ujemnym (Neis-seria cinerea) i dro¿d¿om (Saccharomyces cerevisiae) (27). Natomiast wg Parka i wsp. (26) peptyd ten wyka-zuje aktywnoæ przeciwko grzybom (Candida albicans, Aspergillus fumigatus i Aspergillus niger) oraz bakte-riom (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphy-lococcus epidermidis i Streptococcus z grupy B). Jak podaj¹ Falzacappa i wsp. (9), ich mechanizm dzia³ania jest podobny do dzia³ania defensyn. Dziêki obecnoci zasadowych aminokwasów, które nadaj¹ cz¹steczce do-datni ³adunek oraz tendencji do przybierania amfipa-tycznej struktury drugiego rzêdu nastêpuje przenikanie b³on komórkowych bakterii.
Hepcydyna, przechowywana w makrofagach, jest przede wszystkim hormonem kontroluj¹cym absorpcjê ¿elaza z po¿ywienia oraz uwalnianie go z makrofagów. W przypadku infekcji hepcydyna powoduje zatrzymy-wanie ¿elaza w makrofagach i hepatocytach. Powoduje to zmniejszenie jego absorpcji i poziomu w surowicy krwi. Przyczynia siê to do ograniczenia iloci dostêp-nego ¿elaza dla bakterii, niezbêddostêp-nego do ich rozwoju. W zwi¹zku z tym podwójne dzia³anie hepcydyny w sto-sunku do bakterii polega na ograniczeniu iloci dostêp-nego im ¿elaza oraz bezporednim ich zabijaniu (9). Mechanizm dzia³ania hepcydyny i jej rolê w utrzyma-niu homesotazy ¿elaza bardzo dok³adnie opisali w pra-cy przegl¹dowej Lipiñski i Starzyñski (23).
Couto i wsp. (6) zidentyfikowali u koni peptydy z dziesiêcioma resztami cysteinowymi. Jeden z nich (eNAP-1) wyizolowano z ziarnistoci koñskich neutro-filów. Peptyd ten, poza zwiêkszon¹ w stosunku do de-fensyn liczb¹ cystein, zawiera relatywnie du¿¹ liczbê
reszt alaniny, glicyny, lizyny i proliny. Prawdopodob-nie chroni on uk³ad moczowy koni przed Prawdopodob-niektórymi patogenami (Streptococcus zooepidemicus, Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa). Trzydzieci szeæ z tych reszt aminokwasowych (78,3%) jest identycz-nych z ludzkim neutrofilowym polipeptydem nale¿¹-cym do opisanej poni¿ej rodziny granulin. Peptydy homologiczne do eNAP1 zidentyfikowano u szczurów w komórkach szpiku i nab³onku nerek. Cysteinowy mo-tyw kolejnego peptydu eNAP-2 wyizolowanego równie¿ z koñskich neutrofilów ró¿ni siê od odpowiedniego motywu poznanych dotychczas defensyn i granulin, ale wykazuje znacz¹ce podobieñstwo sekwencji do WDM1, tj. peptydu nale¿¹cego prawdopodobnie do rodziny bia-³ek zawieraj¹cych 4 mostki disiarczkowe, np. w zwie-rzêcych i ludzkich antyproteinazach. Peptyd eNAP-2 wykaza³ aktywnoæ w stosunku do Streptococcus zooepi-demicus, Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa (7). Granuliny (GRN) to rodzina polipeptydów bogatych w cysteinê. Niektóre z nich s¹ czynnikami wzrostowy-mi. Przypuszcza siê, ¿e odgrywaj¹ one wa¿n¹ rolê w uk³adzie krwiotwórczym i w nab³onku. Znane s¹ 4 ludzkie peptydy podobne do granulin (granulin-like peptides) [http://www. ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ dispomim.cgi?id=138945].
Mo¿liwoæ wykorzystania przeciwdrobnoustrojowych peptydów w terapii i profilaktyce
Istnieje du¿e prawdopodobieñstwo, ¿e przeciwdrob-noustrojowe peptydy, bêd¹ce czynnikami odpornoci wrodzonej organizmów, bêd¹ w przysz³oci wykorzy-stywane zarówno w profilaktyce, jak i terapii chorób zakanych, zastêpuj¹c b¹d uzupe³niaj¹c dzia³anie kla-sycznych antybiotyków (18). Wiechu³a i wsp. (37) pod-krelaj¹, ¿e naturalne peptydy przeciwdrobnoustrojo-we s¹ skuteczne dziêki lokalizacji przeciwdrobnoustrojo-wewn¹trz leukocy-tów, które s¹ przyci¹gane do miejsca infekcji. Z kolei bodce zakane stymuluj¹ ich ekspresjê w komórkach nab³onka, stanowi¹cego naturaln¹ barierê ochronn¹ przed wnikaniem patogenów. Natomiast peptyd, poda-ny do¿ylnie, musia³by dotrzeæ do miejsca zaka¿enia przez zdrowe tkanki, a s¹ one silnie dodatnio na³ado-wanymi strukturami, co zmniejszy tempo ich przenika-nia. Dlatego taka droga podawania syntetycznych pep-tydów wydaje siê ma³o prawdopodobna, a ich wyko-rzystanie bêdzie siê ogranicza³o do stosowania miej-scowego (kremy, maci).
Obecnie wiele orodków naukowych i koncernów farmaceutycznych pracuje nad poznaniem mechaniz-mów dzia³ania niektórych peptydów oraz ich syntez¹. Gordon i Romanowski (11) oraz Wiechu³a i wsp. (37) podali, ¿e kilka zsyntetyzowanych peptydów jest ju¿ w ró¿nych fazach klinicznych testów. Niektóre z nich to Pexiganan (Cytolex=MSI-78) zsyntetyzowany na bazie magaininy (¿aba Xenopus) (leczenie wielobakte-ryjnych zaka¿eñ stopy cukrzycowej), Iseganan (IB-367) na bazie protegryn (winie) (terapia stanów zapalnych luzówki jamy ustnej, przy mukowiscydozie, w prze-wlek³ych zaka¿eniach p³uc), Omiganan (MBI-226) indilicyna (byd³o) (zaka¿enia zwi¹zane ze stosowaniem
cewników), MBI 595AN równie¿ bydlêca indolicyna (zaka¿enia tr¹dzikowe), P113 P113D histatyna (cz³o-wiek) (kandyzoza jamy ustnej). Kilka kolejnych bar-dzo obiecuj¹cych peptydów jest w fazie badañ przed-klinicznych.
Badania dotycz¹ce wspó³dzia³ania klasycznych an-tybiotyków z defensynami wyizolowanymi z granulo-cytów króliczych w stosunku do szczepów Staphylo-coccus aureus przeprowadzono w Akademii Medycz-nej w Bia³ymstoku. W badaniach tych stwierdzono, ¿e penicylina G, netylmycyna, klindamycyna, roksytromy-cyna oraz ryfampiroksytromy-cyna dzia³aj¹ synergistycznie z de-fensynami w hamowaniu wzrostu niektórych szczepów S. aureus; jednak w przypadku wiêkszoci szczepów nie obserwuje siê interakcji. Doksycylina stosowana równolegle z defensynami dzia³a albo antagonistycz-nie, albo nie obserwuje siê interakcji. Kloksacylina i cefotaksym dzia³aj¹ antagonistycznie z defensynami w hamowaniu wzrostu czêci szczepów gronkowców opornych na te antybiotyki. Stwierdza siê natomiast synergizm dzia³ania klasycznych antybiotyków i defen-syn w stosunku do niektórych gronkowców wra¿liwych na antybiotyki (22).
Inny, ewentualny sposób wykorzystania peptydów przeciwdrobnoustrojowych, to terapia genowa dla wzmo¿enia ekspresji peptydów w przypadku infekcji. Takie badania zosta³y ju¿ podjête. Po wprowadzeniu do hodowli komórek wyprowadzonych z kilku mysich i ludzkich linii komórkowych oraz komórek pierwot-nych, w³¹czaj¹c fibroblasty, komórek linianki, komó-rek nab³onka i komórki T, genu ludzkiej beta-defensy-ny-2 poprzez wektor retrowirusowy, wzros³a aktywnoæ przeciwdrobnoustrojowa, co wskazuje na mo¿liwoæ za-stosowania terapii genowej (15). Niestety, wirusowe wektory, które s¹ bardziej efektywne ni¿ bezporednia metoda transferu genów, zachowuj¹ potencjaln¹ mo¿-liwoæ wywo³ania stanu zapalnego, a nawet zaka¿enia (np. po rekombinacji z dzikim wirusem). Bardziej praktyczn¹ opcj¹ mo¿e byæ zwiêkszenie ekspresji prze-ciwdrobnoustrojowych peptydów przez suplementacjê diety przypuszczalnym regulatorem ich wydzielania, co mog³oby zwiêkszaæ odpornoæ gospodarza. Synergis-tyczna aktywnoæ peptydów i klasycznych antybioty-ków mog³aby zminimalizowaæ rozwój opornoci pato-genów (24). Dowiedziono, ¿e peptydy o bakteriobój-czych w³aciwociach, wyizolowane z jelita cienkiego wiñ, dodane do wody lub paszy kurcz¹t-brojlerów wp³ynê³y na zwiêkszenie ich odpornoci oraz poprawê wch³aniania sk³adników od¿ywczych w jelitach (2).
Wytwarzanie syntetycznych peptydów o w³aciwo-ciach przeciwdrobnoustrojowych jest obiecuj¹c¹ stra-tegi¹ prowadz¹c¹ do wykorzystania ich jako nowej klasy specyfików o w³aciwociach leczniczych do zapobie-gania i zwalczania infekcji. Przewiduje siê zastosowa-nie peptydów w terapii, jako: dzia³aj¹cego pojedynczo czynnika przeciwzapalnego, czynników stosowanych w kombinacji z konwencjonalnymi antybiotykami albo lekami przeciwwirusowymi do uzyskania synergistycz-nego lub sumuj¹cego siê efektu, czynników dzia³aj¹-cych jako immunostymulatory do pobudzenia
natural-nej odpornoci organizmów oraz jako czynników neu-tralizuj¹cych dla endotoksyn powoduj¹cych szok sep-tyczny. Zaletami wykorzystania peptydów przeciwdrob-noustrojowych w terapii s¹: ich szerokie spektrum ak-tywnoci, bezporednie dzia³anie bójcze, stymulacja aktywnoci fagocytarnej, potencjalnie niski poziom wzbudzenia ewentualnej opornoci mikroorganizmów oraz ich aktywnoæ przeciwzapalna. Koszty badañ na-ukowych d¹¿¹cych do zsyntetyzowania peptydów i ich os³ony przy podawaniu drog¹ pozajelitow¹, koszty ochrony patentowej, ewentualna toksycznoæ ogólna lub miejscowa, os³abienie aktywnoci peptydów przy zwiêkszonym stê¿eniu soli czy wra¿liwoæ na pH, cechy farmakokinetyczne (PK) i farmakodynamiczne (PD) aktywnych peptydów, ewentualne uczulenia po po-nownym podaniu, naturalna opornoæ niektórych szcze-pów bakterii, zak³ócenie funkcji biologicznych (np. an-giogeneza) i wreszcie wysoki koszt produkcji, to argu-menty przemawiaj¹ce na niekorzyæ ich stosowania w terapii (11). Nie mo¿na jednak zapominaæ, ¿e drob-noustroje równie¿ wytwarzaj¹ mechanizmy obronne. Herasimenka i wsp. (14) dowiedli, i¿ niektóre polisa-charydy (PSs) inhibuj¹ aktywnoæ LL-37 i SMAP-29. Prawdopodobnie dziêki ujemnemu ³adunkowi PS oraz dodatniemu ³adunkowi hydrofilnego regionu peptydu dochodzi do ich interakcji, dziêki czemu peptydy nie mog¹ przy³¹czyæ siê do b³ony komórkowej bakterii i w konsekwencji nie mog¹ jej zniszczyæ. Poznanie wiêc ka¿dego aspektu dotycz¹cego ich biologicznej aktyw-noci czy zsyntetyzowanie lub wyekstrahowanie tych cz¹steczek jest niezwykle wa¿ne (18). Podawanie eg-zogennych peptydów jest wyzwaniem, gdy¿ konieczna jest jeszcze identyfikacja w³aciwych metod syntezy rekombinantów tych peptydów, adekwatna droga po-dania oraz unikniêcie ich ewentualnej toksycznoci w stosunku do organizmu gospodarza.
Pimiennictwo
1.Bagnicka E., Strza³kowska N., Jówik A., Krzy¿ewski J., Horbañczuk J., Zwierz-chowski L.: Expression and polymorphism of defensins in farm animals. Acta Biochim. Pol. 2010, 57, 487-497.
2.Bao H., She R., Liu T., Zhang Y., Peng K. S., Luo D., Yue Z., Ding Y., Hu Y., Liu W., Zhai L.: Effects of pig antibacterial peptides on growth performance and intestine mucosal immune of broiler chickens. Poult. Sci. 2009, 88, 291-297. 3.Boman H. G.: Peptide antibiotics and their role in innate immunity. Annu. Rev.
Immunol. 1995, 13, 61-92.
4.Brogden K. A., Ackermann M., McCray Jr. P. B., Tack B. F.: Antimicrobial pep-tides in animals and their role in host defence. Int. J. Antimicrob. Ag. 2003, 22, 465-478.
5.Brogden K. A., Klafa V. C., Ackermann M. R., Palmquist D. E., McCray Jr. P. B., Tack B. F.: The ovine cathelicidin SMAP29 kills ovine respiratory pathogens in vitro and in an ovine model of pulmonary infection. Antimicrob. Agents 2001, 45, 331-334.
6.Couto M. A., Harwig S. S., Cullor J. S., Hughes J. P., Lehrer R. I.: Identification of eNAP-1, an antimicrobial peptide from equine neutrophils. Infect. Immun. 1992, 60, 3065-3071.
7.Couto M. A., Harwig S. S., Lehrer R. I.: Selective inhibition of microbial serine proteases by eNAP-2, an antimicrobial peptide from equine neutrophils. Infect. Immun. 1993, 61, 2991-2994.
8.Fales-Williams A. J., Gallup J. M., Rmirez-Romero R., Brogden K. A., Acker-mann M. R.: Increased anionic peptide distribution and intensity during pro-gression ansd resolution of bacterial pneumonia. Clin. Diagn. Lab. Immun. 2002, 9, 28-32.
9.Falzacappa M. V. V., Muckenthaler M. U.: Hepcidin: Iron-hormone and anti-microbial peptide. Gene 2005, 364, 37-44.
10.Gennaro R., Skerlavaj B., Romeo D.: Purification, composition, and activity of two bactenecins, antibacterial peptides of bovine neutrophils. Infec. Immun. 1989, 57, 3142-3146.
11.Gordon Y. J., Romanowski E. G.: A review of antimicrobial peptides and their therapeutic potential as anti-infective drugs. Curr. Eye Res. 2005, 30, 505-515. 12.Guthmiller J. M., Vargas K. G., Srikantha R., Schomberg L. L., Weistroffer P. L., McCray P. B. JR., Tack B. F.: Susceptibilities of oral bacteria and yeast to mammalian cathelicidins. Antimicrob. Agents 2001, 45, 3216-3219. 13.Hancock R. E. W.: Peptide antibiotics. Lancet 1997, 349, 418-422.
14.Herasimenka Y., Benincasa M., Mattiuzzo M., Cescutti P., Gennaro R., Rizoo R.: Interaction of anitmicrobial peptides with bacterial polysaccharides from lung pathogens. Peptides 2005, 26, 1127-1132.
15.Huang G. T., Zhang H. B., Kim D., Liu L., Ganz T.: A model for antimicrobial gene therapy: demonstration of human beta-defensin 2 antimicrobial activities in vivo. Hum. Gene Ther. 2002, 13, 2017-2025.
16.Huttner K. M., Bresinski-Caliguri D. J., Mahoney M. M., Diamond G.: Anti-microbial peptide expression is developmentally regulated in the ovine gastro-intenstinal tract. J. Nutr. 1998, 128, 297S-299S.
17.Kagan B. L., Selsted M. E., Ganz T., Lehrer R. I.: Antimicrobial defensin peptides form voltage-dependent ion-permeable channels in planar lipid bilayer membranes. PNAS USA 1990, 87, 210-214.
18.Kamysz W., Okrój M., £ukasiak J.: Novel properties of antimicrobial peptides. Review. Acta Biochim. Pol. 2003, 50, 461-469.
19.Krause A., Neitz S., M H.-J., Schulz A., Forssmann W.-G., Schulz-Knappe P., Adermann K.: LEAP-1, a novel highly disulfide-bonded human peptide, exhibits antimicrobial activity. FEBS Letters 2000, 480, 147-150.
20.Lehrer R. I., Ganz T.: Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defence. Curr. Opin. Immunol. 1999, 11, 23-27.
21.Lehrer R. I., Ganz T.: Cathelicidins: a family of endogenous antimicrobial peptides. Curr. Opin. Hematol. 2002, 9, 18-22.
22.Leszczyñska K.: Ocena efektów skojarzonego dzia³ania antybiotyków z defen-synami oraz mieloperoksydaz¹ na szczepy Staphylococcus aureus. Praca dokt., Zak³ad Mikrobiologii AM, Bia³ystok 1998.
23.Lipiñski P., Starzyñski R. R.: Regulacja ogólnoustrojowej homeostazy ¿elaza przez hepcydynê. Post. Hig. Med. Dow. 2004, 58, 65-73.
24.Meyerholz D. K., Ackermann M. R.: Antimicrobial peptides and Sufactant proteins in ruminant respiratory tract disease. Vet. Immunol. Immunop. 2005, 107, 91-96.
25.Okumura K., Itoh A., Isogai E., Hirose K., Hosokawa Y., Abiko Y., Shibata T., Hirata M., Isogai H.: C-terminal domain of human CAP18 antimicrobial peptide induces apoptosis in oral squamous cell carcinoma SAS-H1 cells. Cancer Lett. 2004, 212, 185-194.
26.Park C. H., Valore E. V., Waring A. J., Ganz T.: Hepcidin, a urinary antimicro-bial peptide synthesized in the liver. J. Biol. Chem. 2001, 276, 7806-7810. 27.Sang Y., Ramanathan B., Minton J. E., Ross C. R., Blecha F.: Porcine
liver-expressed anitimicrobial peptides, hepcidin and LEAP-2: cloning and induction by bacterial infection. Dev. Comp. Immunol. 2006, 30, 357-366.
28.Scocchi M., Bontempo D., Boscolo S., Tomasinsig L., Giulotto E., Zanetti M.: Novel cathelicidins in horse leukocytes. FEBS Letters 1999, 457, 459-464. 29.Scocchi M., Shenglun W., Zanetti M.: Structural organization of bovine
catheli-cidin gene family and identification of a novel member. FEBS Letters 1997, 417, 311-315.
30.Selsted M. E., Novotny M. J., Morris W. L., Tang Y. Q., Smith W., Cullor J. S.: Indolicin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neutrophils. J. Biol. Chem. 1992, 267, 4292-4295.
31.Shamova O., Brogden K. A., Zhao C., Nguyen T., Kokryakov V. N., Lehrer R. I.: Purification and properties of proline-rich antimicrobial peptides from sheep and goat leukocytes. Infect. Immun. 1999, 67, 4106-4111.
32.Skerlavaj B., Benincasa M., Risso A., Zanetti M., Gennaro R.: SMAP-29: a potent antibacterial and antifungal peptide from sheep leucocytes. FEBS Letters 1999, 463, 58-62.
33.Skerlavaj B., Scocchi M., Gennaro R., Risso A., Zanetti M.: Structural and Functional Analysis of Horse Cathelicidin Peptides. Antimicrob. Agents 2001, 3, 715-722.
34.Suresh A., Verma Ch.: Modelling study of dimerization in mammalian defen-sins. Proc. Fifth Internat. Conf.: Bioinformatics BMC. Bioinformatics 2006, 7, Supplement 5, s. 17.
35.lemp-Migiel A., Wiczkowski A.: Ludzkie endogenne bia³ka i peptydy anty-bakteryjne. Praca przegl¹dowa. Ann. Acad. Med. Silesien. 2006, 60, 366-369. 36.Turner J., Cho Y., Dinh N. N., Waring A. J., Lehrer R. I.: Activities of LL-37, a cathelin-assiciated antimicrobial peptide of human neutrophils. Antimicrob. Agents 1998, 42, 2206-2214.
37.Wiechu³a B. E., Tustanowski J. P., Martirosian G.: Peptydy antydrobnoustro-jowe. Wiad. Lek. 2006, 59, 542-547.
38.Zanetti M.: Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity. J. Leukocyte Biol. 2004, 75, 39-48.
39.Zanetti M., Gennaro R., Romeo D.: Cathelicidins: a novel protein family with a common proregion ans a variable C-teminal antimicrobial domain. FEBS Letters 1995, 374, 1-5.
40.Zhang G., Ross C. R., Blecha F.: Porcine antimicrobial peptides: new prospects for ancient molecules of host defence. Vet. Res. 2000, 31, 277-296.
41.Zhao C., Ganz T., Lehrer R. I.: Structures of genes for two cathelin-associated antimicrobial peptides: prophenin-2 and PR-39. FEBS Letters 1995, 376, 130--134.
Adres autora: dr hab. Emilia Bagnicka, prof. IGiHZ PAN, IGiHZ PAN w Jastrzêbcu, 05-552 Wólka Kosowska
