Artyku³ przegl¹dowy Review
Bakterie fermentacji mlekowej (Lactic Acid Bacteria LAB) znajduj¹ szerokie zastosowanie w przemyle spo¿ywczym. Ze wzglêdu na to, i¿ naturalnym rodo-wiskiem wystêpowania bakterii fermentacji mlekowej jest mleko, roliny, a tak¿e uk³ad pokarmowy i b³ony luzowe cz³owieka i zwierz¹t, ju¿ od czasów staro¿yt-nych by³y powi¹zane z procesami fermentacji ¿ywno-ci, g³ównie w celu jej utrwalenia. W Polsce du¿e zna-czenie odgrywa proces fermentacji mleka, kapusty, ogórków oraz sa³atek i soków warzywnych. Bakterie te stosowane s¹ równie¿ w produkcji kiszonek paszo-wych. G³ówn¹ funkcj¹ LAB jest zwiêkszanie warto-ci od¿ywczej, strawnowarto-ci oraz przyswajalnowarto-ci sk³ad-ników mineralnych fermentowanej ¿ywnoci. W miarê rozwoju techniki i wiedzy s¹ one stosowane równie¿ przy produkcji fermentowanej ¿ywnoci o znaczeniu probiotycznym oraz w przygotowaniu preparatów far-maceutycznych. Nadanie produktom, obok w³aciwo-ci od¿ywczych, tak¿e terapeutycznych i profilaktycz-nych, wi¹¿e siê ze specyficznymi cechami, jakimi po-winny charakteryzowaæ siê szczepy bakterii fermen-tacji mlekowej. Wa¿n¹ technologiczn¹ cech¹ selekcjo-nuj¹c¹ jest odpornoæ LAB na niesprzyjaj¹ce
warun-ki. Zarówno procesy przemys³owe, jak i rodowisko przewodu pokarmowego stwarzaj¹ niekorzystne wa-runki do rozwoju tych drobnoustrojów. Na bakterie fermentacji mlekowej oddzia³ywuj¹ zmieniaj¹ce siê czynniki fizyczne i chemiczne, do których mo¿na za-liczyæ np. temperaturê, pH rodowiska, obecnoæ sub-stancji bakteriostatycznych (9-11, 22). Bior¹c powy¿-sze pod uwagê, zastosowanie fluorescencyjnych tech-nik umo¿liwia prowadzenie precyzyjnych badañ, a tym samym dok³adne okrelenie stanu fizjologicznego i prze¿ywania komórek bakteryjnych, opieraj¹ce siê na detekcji ró¿nych wyznaczników ich aktywnoci (8, 19, 23). Zainteresowanie technikami fluorescencyjnymi skupia siê wokó³ nadrzêdnego celu, jakim jest dosko-nalenie metod analizy ilociowej ró¿nego rodzaju pro-duktów. Stosowana szeroko w oznaczeniach liczeb-noci komórek bakterii konwencjonalna metoda p³yt-kowa opiera siê na zdolnoci komórek do namna¿ania i tworzenia kolonii na pod³o¿u sta³ym. Metody fluo-rescencyjne, w zale¿noci od zastosowanej techniki znakowania, umo¿liwiaj¹ ocenê prze¿ywalnoci bak-terii na podstawie innych cech ni¿ rozmna¿anie, i, co siê z tym wi¹¿e, na wyodrêbnienie wiêcej ni¿ dwóch
Badania stanu niehodowalnoci
komórek bakterii fermentacji mlekowej
w niesprzyjaj¹cych warunkach rozwoju
MAGDALENA OLSZEWSKA, £UCJA £ANIEWSKA-TROKENHEIMKatedra Mikrobiologii Przemys³owej i ¯ywnoci Wydzia³u Nauk o ¯ywnoci UWM, Pl. Cieszyñski 1, 10-726 Olsztyn
Olszewska M., £aniewska-Trokenheim £.
Study of the nonculturable state of lactic acid bacteria cells under adverse growth conditions
Summary
The reason for undertaking the research concerning the physiological state of lactic acid bacteria is closely associated with applications of these microorganisms in the food industry. An increased demand referring to microbiological analysis has been affected by the intensification of research assessing the physiological state of microorganisms in unfavorable for them conditions. In technological processes as well as in natural habitats microorganisms can encounter a variety of adverse conditions, arising from the influence of physical and chemical factors such as extremes in temperature, pH or presence of bacteriostatic agents. Therefore, the determination of the viability of bacteria may be challenging due to difficulties in the selection of suitable enumeration methods. The use of conventional methods that rely on the replication and colony formation on growth media is hindered by the decreased reproductive capacity of cells under detrimental conditions. As a result, alternative techniques which do not focus on cell proliferation, but on the metabolic activity or cell structure integrity are being favored. Approaches performing direct detection of different physiological parameters of microbes are connected with the application of modern fluorescence techniques, and in consequence with progress in microbiological research.
stanów fizjologicznych komórek w populacji. Komórki ¿ywe, aktyw-ne metabolicznie, mog¹ straciæ zdol-noæ do wzrostu na pod³o¿ach hodow-lanych i ten stan upienia czêci po-pulacji mo¿e wystêpowaæ zw³aszcza wtedy, gdy komórki poddawane s¹ dzia³aniu czynników niekorzystnych (20, 32). Zastosowanie technik fluo-rescencyjnych w poznawaniu fizjo-logii drobnoustrojów staje siê wobec powy¿szego niezbêdnym narzêdziem w analizie mikrobiologicznej, dziêki którym mo¿liwe jest ledzenie sub-telnych zmian w dynamice namna¿a-nia i obumieranamna¿a-nia drobnoustrojów na poziomie pojedynczych komórek (19, 32).
Na istnienie komórek w stadium VBNC (viable but non-culturable) lub ABNC (active but non-culturable), czyli przechodzenia bakterii w nie-korzystnych warunkach bytowania w stan upienia, wskazali po raz pierwszy Roszak i wsp. w 1984 r.
(29). Termin VBNC opisuje komórki w niezadowa-laj¹cym stanie fizjologicznym, co oznacza, ¿e komór-ki s¹ ¿ywe, ale nie dziel¹ siê, w wyniku czego nie wykazuj¹ zdolnoci do wzrostu i tworzenia kolonii na pod³o¿ach hodowlanych (19, 27). Ocena stanu fizjo-logicznego okrelonej mikroflory staje siê wyzwaniem w momencie, gdy dochodzi do zahamowania proce-sów rozmna¿ania pod dzia³aniem ró¿norakich streso-rów, takich jak: temperatura, zmiana cinienia osmo-tycznego, natlenianie, obni¿one pH, obecnoæ soli ¿ó³-ciowych, niedobór sk³adników od¿ywczych (4, 5, 11, 16). Stwierdza siê, ¿e komórki w stadium VBNC wy-kazuj¹ fizjologiczne oznaki ¿ycia i pewn¹ aktywnoæ metaboliczn¹, w zwi¹zku z czym metody identyfika-cji w stanie VBNC powinny opieraæ siê na detekidentyfika-cji ró¿nych oznak aktywnoci lub integralnoci struktur komórkowych (19). W ostatnich dwóch dekadach no-towane jest wzrastaj¹ce zapotrzebowanie na rozwój bezporednich metod in situ, oceniaj¹cych stan fizjo-logiczny populacji drobnoustrojów w czasie rzeczy-wistym i pod wzglêdem innych cech ni¿ zdolnoæ do podzia³ów komórkowych (18, 22, 25). Kombinacja technik opieraj¹cych siê na ró¿nych podejciach do oceny stanu fizjologicznego komórek staje siê wtedy niew¹tpliwie cennym narzêdziem w weryfikacji nie-doszacowania jednej techniki wzglêdem drugiej. Li-czebnoci komórek bakteryjnych szacowane ró¿nymi metodami analizy ilociowej mog¹ byæ ze sob¹ po-równywane, w celu oceny ich przydatnoci w bada-niach statusu fizjologicznego mikroflory produktów. Ró¿nica miêdzy liczb¹ komórek, jak¹ mo¿na wykryæ np. bezporedni¹ metod¹ in situ a tradycyjn¹ metod¹ hodowlan¹ mo¿e byæ kontrolowana i analizowana,
jed-nak wyznaczenie granicy miêdzy komórkami ¿ywy-mi, hodowalnymi a niehodowalnymi oraz obumar³y-mi jest zagadnieniem trudnym i wymaga gromadzenia precyzyjnych wyników analizy. W tego rodzaju bada-niach wymagane s¹ zarówno konwencjonalne metody p³ytkowe, ale i precyzyjne metody bezporedniego zli-czania komórek, do których nale¿¹ techniki fluorescen-cyjne (20, 23). Liczebnoæ komórek szacowana meto-dami fluorescencyjnymi mo¿e byæ oceniana np. przez: integralnoæ membran komórkowych, aktywnoæ enzy-matyczn¹, oddychanie, potencja³ membranowy, we-wn¹trzkomórkowe pH. Wa¿ne s¹ wszystkie te w³aci-woci, które pozwalaj¹ stwierdziæ zachowywanie funk-cji ¿yciowych komórki (5, 6, 8).
Wspó³czesne metody analizy mikrobiologicznej wykorzystuj¹ce znaczniki fluorescencyjne W zale¿noci od wybranej metody znakowania fluo-rescencyjnego komórek wyró¿niamy rozmaite grupy fluorochromów. Jedn¹ z grup barwników fluorescen-cyjnych s¹ fluorochromy kationowe (np. rodamina 123)
oraz anionowe (np. DiBAC4(3) BOX), których
wa-runkiem pojawienia siê sygna³u jest zachowywanie przez komórkê potencja³u elektrochemicznego mem-brany. Jako ¿e systemy warunkuj¹ce zachowywanie potencja³u odgrywaj¹ istotn¹ rolê w tak wa¿nych pro-cesach metabolicznych, jak: synteza ATP, aktywny transport, regulacja wewn¹trzkomórkowego pH, potencja³ elektrochemiczny b³ony staje siê trafnym celem w okrelaniu utrzymywania przez komórkê ak-tywnoci (8). Innym rozwi¹zaniem jest zastosowanie prefluorochromów bior¹cych udzia³ w detekcji aktyw-noci enzymatycznej. Dobrym przyk³adem s¹ substan-Ryc. 1. Obrazy preparatów mikroskopowych komórek bakterii fermentacji mle-kowej z mikroskopu epifluorescencyjnego wykonane 4 technikami fluorescencyj-nymi. (A) pa³eczki Lactobacillus sp. barwione przy u¿yciu testu LIVE/DEAD®
BacLight Bacterial Viability Kit; (B) pa³eczki Lactobacillus plantarum barwione zestawem fluorochromów CFDA/PI; (C) paciorkowce Lactococcus sp. barwione fluorochromem DAPI; (D) pa³eczki Lactobacillus plantarum po fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z zastosowaniem sondy 16S rRNA Lplan (17) znakowanej CY3 (zdjêcia w³asne).
cje, które w formie utlenionej nie fluoryzuj¹, natomiast po zredukowaniu przez okrelone enzymy przekszta³-cone s¹ we fluoryzuj¹ce zwi¹zki. Takim prefluorochro-mem jest zwi¹zek tetrazolowy CTC (5 cyano-2,3-di-totyl tetrazolium chloride), redukowany pod wp³ywem dehydrogenaz do barwnych formazanów (CTF), które precypituj¹ wewn¹trz komórki (6). Wiêksze zainte-resowanie w okrelaniu aktywnoci enzymatycznej budz¹ prefluorochromy do identyfikacji aktywnoci esterolitycznej. Substrat prefluorochromowy dyfunduje przez membranê i jest rozszczepiany przez niespecy-ficzn¹ esterazê, która uwalnia fluoryzuj¹cy produkt zachowywany we wnêtrzu komórek ze sprawn¹ b³on¹ komórkow¹. W tego rodzaju reakcjach bior¹ udzia³: dwuoctan fluoresceiny i jego pochodne, jako substra-ty oraz fluoresceina i jej pochodne, jako fluoryzuj¹ce produkty. Jak siê ocenia, pochodne fluorochromów daj¹ lepszy sygna³ fluoryzuj¹cy. Dotyczy to np. dwu-octanu karboksyfluoresceiny (carboxyfluorescein di-acetate CFDA) przekszta³canego do karboksyfluores-ceiny (carboxyfluorescein CF), która jako zwi¹zek hydrofilowy zatrzymywana jest bardziej skutecznie w cytozolu komórki ni¿ jej odpowiednik fluoresce-ina (25).
Inn¹ grup¹ barwników s¹ fluorochromy interkalu-j¹ce z DNA. Zaliczamy tutaj DAPI (4,6-diamidino-2--phenyl-indol) wykorzystywany do oznaczania ca³ko-witej liczby bakterii, wi¹¿¹cy siê z dsDNA. Rejestro-wanie sygna³u fluoryzuj¹cego jest wynikiem specyficz-nego ³¹czenia siê DAPI z nieuszkodzonym nukleoidem komórek, ale tak¿e niespecyficznego wi¹zania z inny-mi strukturainny-mi, co sprawia, ¿e wszystkie wyznakowa-ne komórki w próbie to zarówno komórki aktywwyznakowa-ne, jak te¿ martwe oraz tzw. ghost cells (6, 18). Kolejn¹ metod¹ jest oznaczanie udzia³u komórek ¿ywych i martwych ró¿nicowanych na zasadzie penetrowania okrelonego barwnika nukleinowego przez sprawn¹ oraz uszkodzon¹ b³onê komórkow¹ (15). Test Live/ Dead BacLight Bacterial Viability Kit zawiera zestaw dwóch fluorochromów: SYTO9 oraz jodku propidyny (propidium iodide PI), które pozwalaj¹ na wyznako-wanie komórek pod wzglêdem integralnoci membra-ny. SYTO9 jest fluorochromem o zdolnoci penetracji przez zarówno zintegrowan¹, jak i uszkodzon¹ b³onê, natomiast jodek propidyny mo¿e przedostawaæ siê tyl-ko przez zniszczon¹ membranê i w ten sposób otrzy-muje siê kompresowany obraz ukazuj¹cy komórki ¿ywe i martwe (3). Alternatywnie, dobrym indykato-rem komórek martwych w populacji mo¿e byæ inny barwnik nukleinowy, okrelany skrótem TOTO-1, o pe³nej nazwie: 1-(4,4,7,7-tetramethyl-4,7-diazaun- decamethylene)-bis-4-[3-methyl-2,3dihydro(benzo- -1,3-oxazole)-2-methylidene]-1-(3-trimethylammo-niumpropyl)-pyridinium tetraiodide. Zastosowanie tego barwnika jest czêciej preferowane od PI, szcze-gólnie w po³¹czeniu z cytometri¹ przep³ywow¹, ze wzglêdu na bardziej odpowiednie parametry widma wzbudzania i emisji oraz jego masê molekularn¹ (10).
Obiecuj¹c¹ metod¹ badania stanu fizjologicznego drobnoustrojów jest technika fluorescencyjnej hybry-dyzacji in situ (fluorescence in situ hybridisation FISH) polegaj¹ca na hybrydyzacji sekwencji rRNA komórek sond¹ oligonukleotydow¹ znakowan¹ fluo-rescencyjnie do identyfikacji i oznaczania ilociowego komórek bakteryjnych. Dobór sond oligonukleotydo-wych 16S/23S rRNA na poziomie rodzajów, a nawet gatunków bakterii czyni technikê FISH wysoce spe-cyficzn¹ i precyzyjn¹ wzglêdem ocenianej populacji drobnoustrojów (1, 14, 23, 30, 31). Technika FISH opiera siê na detekcji rRNA komórek. Do czynników wp³ywaj¹cych na pozytywny sygna³ wizualizacji w technice FISH zalicza siê: liczbê docelowych cz¹s-teczek rRNA obecnych w komórce, dostêpnoæ sondy dla rRNA, intensywnoæ fluorescencji hybrydyzowa-nej sondy. Przydatnoæ techniki FISH w ocenie prze-¿ywalnoci zale¿y od rozpadu rRNA po mierci ko-mórek. Rozpad rRNA zale¿y natomiast od poziomu RNazy w i w otoczeniu komórki oraz od integralnoci membran komórkowych i stopnia ich permeabilizacji. Mimo z³o¿onoci procesów warunkuj¹cych wiarygod-n¹ ocenê utrzymywania funkcji ¿yciowych przez ko-mórki technik¹ FISH, celowoæ jej u¿ycia jest bardziej uzasadniona w porównaniu z technikami opieraj¹cy-mi siê na detekcji DNA np. real-time PCR, ze wzglê-du na krótszy pó³okres rozpawzglê-du rRNA ni¿ DNA (20).
Badania stanu fizjologicznego i prze¿ywalnoci komórek bakterii fermentacji mlekowej z zastosowaniem technik fluorescencyjnych Wyniki badañ wskazuj¹, ¿e stan upienia czêci po-pulacji mo¿e wystêpowaæ wród mikroflory poddawa-nej dzia³aniu czynników stresowych, mikroflory pro-duktów probiotycznych, szczepionek starterowych oraz d³ugoterminowo przechowywanych produktów (9-11, 15, 20, 21, 28, 32). Id¹c w tym kierunku, Bunthof i Abee (9) zajmowali siê ustaleniem przydatnoci barw-ników fluorescencyjnych, a dok³adniej takich fluoro-chromów, jak: CFDA oraz TOTO-1 do szybkiego ozna-czania udzia³u komórek ¿ywych i martwych kultur star-terowych do produkcji serów w zakwasie macierzy-stym i roboczym oraz wchodz¹cych w sk³ad produk-tów probiotycznych. Stwierdzono, ¿e liczba komórek oznaczona barwieniem CF nie koreluje z liczb¹ bak-terii uzyskan¹ metod¹ p³ytkow¹ i jest od niej wy¿sza. Badacze okrelaj¹ upiony stan fizjologiczny popula-cji jako subletalny, co mo¿na rozumieæ jako utratê zdolnoci do podzia³ów, lecz przy zachowaniu zinteg-rowanej b³ony komórkowej i aktywnoci metabolicz-nej. Tego rodzaju spostrze¿enia zgadzaj¹ siê tak¿e z in-nymi doniesieniami. Gatti i wsp. (15), badaj¹c ró¿ne szczepy bakterii fermentacji mlekowej wchodz¹ce w sk³ad szczepionek mleczarskich, oznaczali ich li-czebnoci i okrelili wiêksz¹ liczbê ¿ywych komórek, stosuj¹c zestaw fluorochromów LIVE/DEAD BacLight ni¿ konwencjonaln¹ metod¹ p³ytkow¹. Moreno i wsp. (24) badali prze¿ywalnoæ bakterii fermentacji
mle-kowej, w tym szczepów probiotycznych, w wybranych produktach mleczarskich. Wykazano oko³o 10 razy mniejsz¹ liczebnoæ drobnoustrojów, wykorzystuj¹c posiewy p³ytkowe ni¿ metod¹ mikroskopow¹ z za-stosowaniem barwników SYTO9 jodek propidyny. Auty i wsp. (2) równie¿ prezentuj¹ wyniki wiadcz¹-ce o mniejszej liczebnoci komórek pa³eczek probio-tycznych oznaczanej metod¹ p³ytkow¹ wzglêdem bez-poredniej metody in situ. Collado i wsp. (13) stwier-dzaj¹, ¿e liczba LAB z rodzaju Bifidobacterium pod-danych dzia³aniu soku ¿o³¹dkowego, oznaczona me-tod¹ hodowlan¹, zawsze by³a mniejsza od liczebnoci oznaczonej SYTO9-PI. W innych pracach Bunthof i wsp., zastosowali zestawy barwników CF/PI (11), a tak¿e CF/TOTO-1 w po³¹czeniu z cytometri¹ prze-p³ywow¹ (10) do okrelania udzia³u komórek ¿ywych i martwych w hodowlach licznych szczepów bakterii fermentacji mlekowej. Metody te pozwala³y na szyb-kie badanie fizjologii i prze¿ywania komórek na pod-stawie ró¿nic w liczebnoci populacji przed i po dzia-³aniu niekorzystnych czynników: wysokiej tempera-tury, soli ¿ó³ciowych lub kwasów. Papadimitriou i wsp. (26) na podstawie zastosowania cytometrii przep³ywo-wej po³¹czonej z fluorescencyjnym znakowaniem ko-mórek CFDA/PI w hodowli LAB z rodzaju Strepto-coccus, poddanej dzia³aniu niskiego pH, wyodrêbnili trzy grupy komórek charakteryzuj¹cych siê odmien-nym stanem fizjologiczodmien-nym: ¿ywe, martwe oraz tzw. uszkodzone, które zdefiniowano jako niehodowal-ne z zachowan¹ aktywnoci¹ metaboliczn¹. £aniew-ska-Trokenheim i wsp. (22) wykazali ró¿nice pomiê-dzy liczbami komórek potencjalnie probiotycznych szczepów Lactobacillus acidophilus, oznaczanymi prefluorochromem CFDA oraz metod¹ p³ytkow¹ pod-czas d³ugotrwa³ej hodowli na mleku. Zwrócono uwa-gê na powiêkszanie siê ró¿nicy miêdzy tymi oznacze-niami wraz z czasem prowadzenia hodowli, sugeruj¹c stan upienia, czyli utratê przez komórki zdolnoci do podzia³ów, przy wykazywaniu aktywnoci esteraz wewn¹trzkomórkowych w pónej fazie stacjonarnej rozwoju populacji. Warmiñska-Radyko i wsp. (32), badaj¹c wzrost populacji szczepów z rodzaju Lacto-coccus sp. w mleku z zastosowaniem testu LIVE/ DEAD, na podstawie rozbie¿noci w porównaniu z oznaczeniami otrzymanymi metod¹ p³ytkow¹, wnio-skuj¹, ¿e komórki mog¹ przechodziæ w tzw. stan nie-hodowalnoci, który jest uzale¿niony indywidualnie od szczepu, czasu prowadzenia hodowli oraz nieko-rzystnych warunków, których dzia³aniu poddawane s¹ badane populacje paciorkowców.
Mo¿liwoæ zastosowania techniki FISH w badaniach ¿ywnoci budzi du¿e nadzieje w ocenie stanu fizjolo-gicznego bakterii fermentacji mlekowej. Sondy oligo-nukleotydowe rRNA dla bakterii fermentacji mleko-wej mog¹ byæ wykorzystywane zarówno do ich iden-tyfikacji, ledzenia zmian liczebnoci populacji pod-czas procesów fermentacyjnych oraz detekcji LAB powoduj¹cych wady produktów, np. wina (7). W
za-le¿noci od wymaganego poziomu detekcji (rodzaj, gatunek) ró¿ne regiony genomu mog¹ byæ brane pod uwagê jako potencjalny cel hybrydyzacji. Sekwencja 16S oraz 23S rRNA zawiera zarówno konserwatywne regiony powszechne dla wszystkich eubacteria, jak i wysoce zmienne, specyficzne dla okrelonego gatun-ku. Trudnoci¹ w aplikacji techniki FISH na poziomie gatunkowym mo¿e byæ dobór odpowiednich sond, gdy¿ nie jest wskazane ich stosowanie w blisko spo-krewnionych gatunkach LAB, ze wzglêdu na du¿y poziom podobieñstwa sekwencji rRNA, np. L. plan-tarum i L. pentosus czy L. paraplanplan-tarum (12). Przy-datnoæ FISH jako metody do monitorowania dyna-miki rozwoju LAB w ¿ywnoci jest ci¹gle badana i weryfikowana. Lahtinen i wsp. (20) badali prze¿y-walnoæ pa³eczek z rodzaju Bifidobacterium w d³ugo-terminowo przechowywanym napoju owsianym z u¿y-ciem 4 metod analizy ilociowej. Odnosili wyniki uzyskane metod¹ p³ytkow¹ do wyników 3 technik bio-logii molekularnej, w tym FISH. Wskazuj¹c na liczne zalety aplikacyjne fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w ¿ywnoci, wykazali statystycznie istotne ró¿nice w liczebnociach uzyskanych w porównaniu z meto-d¹ hodowlan¹, stwierdzaj¹c przydatnoæ tej techniki w oznaczaniu ca³kowitej liczby bakterii.
Zwiêkszone wymagania odnosz¹ce siê do analityki mikrobiologicznej spowodowane s¹ m.in. zintensyfi-kowaniem badañ oceniaj¹cych stan fizjologiczny drob-noustrojów w niekorzystnych dla nich warunkach. Metoda p³ytkowa o statusie tzw. z³otego standardu jest najczêciej stosowana w ilociowej analizie mikrobio-logicznej, która pozwala na okrelenie liczby komó-rek wykazuj¹cych zdolnoæ do rozmna¿ania i tworze-nia kolonii. Wyzwaniem w zastosowaniu tej metody staje siê zahamowanie procesów rozmna¿ania, wyni-kaj¹ce np. z poddania komórek dzia³aniu czynników szkodliwych. Alternatyw¹ w stosunku do tradycyj-nie stosowanej metody p³ytkowej jest znakowatradycyj-nie sk³adnikiem fluorescencyjnym, umo¿liwiaj¹ce szyb-kie wykrycie, liczenie i identyfikacjê drobnoustrojów. Uzasadnione jest dobieranie technik, które odnosz¹ siê np. do aktywnoci metabolicznej komórek lub stabili-zacji struktur komórkowych. Precyzyjne monitorowa-nie zmian dynamiki rozwoju i obumierania populacji drobnoustrojów przemys³owego zastosowania wyma-ga badañ modelowych oraz alternatywnych technik, oceniaj¹cych stan fizjologiczny drobnoustrojów w spo-sób wielowymiarowy (ró¿norodny, zró¿nicowany), czyli odwo³uj¹cych siê do ró¿nych wyznaczników funkcjonalnoci komórek jednoczenie.
Pimiennictwo
1.Amann R. I., Zarda B., Stahl D. A., Schleifer K.-H.: Identification of indivi-dual prokaryotic cells by using enzyme-labeled, rRNA-targeted oligonucleo-tide probes. Appl. Environ. Microbiol. 1992, 58, 3007-3011.
2.Auty M. A. E., Gardiner G. E., McBrearty S. J., OSullivan E. O., Mulvihill D. M., Collins J. K., Fitzgerald G. F., Stanton C., Ross R. P. M.: Direct in situ viability assessment of bacteria in probiotic dairy products using via-bility staining in conjunction with confocal scanning laser microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, 420-425.
3.Baena-Ruano S., Jimenez-Ot C., Santos-Duenas I., Cantero-Moreno D., Barja F., Garcia-Garcia I.: Rapid method for total, viable and non-viable acetic acid bacteria determination during acetification process. Process Bio-chemistry 2006, 41, 1160-1164.
4.Barer M. R., Harwood C. R.: Bacterial viability and culturability. Adv. Microb. Physiol. 1999, 41, 93-137.
5.Ben Amor K., Vaughan E. E., de Vos W. M.: Advanced molecular tools for the identification of lactic acid bacteria. J. Nutr. 2007, 137, 741S-747S. 6.Biggerstaff J., Le Puil M., Weidow B., Prater J., Glass K., Radosevich M.,
White D.: New methodology for viability testing in environmental samples. Mol. Cell. Probes 2006, 20, 141-146.
7.Blasco L., Ferrer S., Pardo I.: Development of specific fluorescent oligo-nucleotide probes for in situ identification of wine lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 2003, 225, 115-123.
8.Breeuwand P., Abee T.: Assessment of viability of microorganisms employing fluorescencje techniques. Int. J. Food Microbiol. 2000, 55, 193-200. 9.Bunthof C., Abee T.: Development of a flow cytometric method to analyze
subpopulations of bacteria in probiotic products and dairy starters. Appl. Environ. Microbiol. 2002, 68, 2934-2942.
10.Bunthof C., Bloemen K., Breeuwer P., Rombouts F., Abee T.: Flow cytometric assessment of viability of Lactic Acid Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, 2326-2335.
11.Bunthof C., Braak S., Breeuwer P., Rombouts F., Abee T.: Rapid fluorescence assessment of the viability of stressed Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65, 3681-3689.
12.Coeuret V., Dubernet S., Bernardeau M., Gueguen M., Vernoux J. P.: Isola-tion, characterization and identification of lactobacilli focusing mainly on cheeses and other dairy products. Lait 2003, 83, 269-306.
13.Collado M. C., Moreno Y., Hernandez E., Cobo J. M., Hernandez M.: In vitro viability of Bifidobacterium strains isolated from commercial dairy products exposed to human gastrointestinal conditions. Food Sci. Tech. Int. 2005, 11, 307-314.
14.De Vries M. C., Vaughan E. E., Kleerebezem M., de Vos W. M.: Optimising single cell activity assessment of Lactobacillus plantarum by fluorescent in situ hybridisation as affected by growth. J. Microbiol. Meth. 2004, 59, 109--115.
15.Gatti M., Bernini V., Lazzi C., Neviani E.: Fluorescence microscopy for studying the viability of micro-organisms in natural whey starters. Lett. Appl. Microbiol. 2006, 42, 338-343.
16.Guchte M., Serror P., Chervaux C., Smokvina T., Ehrlich S., Maguin E.: Stress responses in lactic acid bacteria. Anton. Leeuw. 2002, 82, 187-216. 17.Hensiek R., Krupp G., Stackerbrandt E.: Development of diagnosstic
oligo-nucleotide probes for four Lactobacillus species occurring in the intestinal tract. Syst. Appl. Microbiol. 1992, 15, 123-128.
18.Hermida M., Taboada M., Menendes S., Rodriguez-Otero J. L.: Semi-auto-mated direct epifluorescent filter technique for total bacterial count in raw milk. J. AOAC Int. 2000, 83, 1345-1348.
19.Joux F., Lebaron F.: Use of fluorescent probes to assess physiological func-tions of bacteria at single-cell level. Microbes Infection 2000, 2, 1523-1535. 20.Lahtinen S., Gueimonde M., Ouwehand A., Reinikainen J., Salminen S.: Comparison of methods to enumerate probiotic bifidobacteria in a fermented food product. Food Microbiol. 2006, 23, 571-577.
21.Lahtinen S., Gueimonde M., Ouwehand A., Reinikainen J., Salminen S.: Probiotic bacteria may become dormant during storage. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71, 1662-1663.
22.£aniewska-Trokenheim £., Olszewska M., Mik-Krajnik M., Zadernowska A.: Patterns of survival and volatile metabolites of selected Lactobacillus strains in long-term incubation in milk. J. Microbiol. 2010, 48, 445-451. 23.Mik M., Warmiñska-Radyko I.: Wybrane techniki fluorescencyjne w
bada-niach stanu fizjologicznego i prze¿ywalnoci komórek bakteryjnych w ¿yw-noci. Medycyna Wet. 2008, 64, 623-628.
24.Moreno Y., Collado M., Ferrus M., Cobo J., Hernandez E., Hernandez M.: Viability assessment of lactic acid bacteria in commercial dairy products stored at 4°C using LIVE/DEAD BacLight staining and conventional plate counts. Int. J. Food Sci. Tech. 2006, 41, 275-280.
25.Morono Y., Takano S., Miyanaga K., Tanji Y., Unno&Katsutoshi H.: Appli-cation of glutaraaldehyde for the staining of esterase-active cells with carbo-xyfluorescein diacetate. Biotechnol. Lett. 2004, 26, 379-383.
26.Papadimitriou K., Pratsinis H., Nebe-Von-Caron G., Kletsas D., Tsakalidou E.: Rapid assessment of the physiological status of Streptococcus macedonicus by flow cytometry and fluorescence probes. Int. J. Food Microbiol. 2006, 111, 197-205.
27.Paszyñska-Weso³owska I., Bartoszcze M.: Bakterie w stadium VBNC za-gro¿enie dla zdrowia cz³owieka. Medycyna Wet. 2009, 65, 228-231. 28.Rault A., Beal C., Ghorbal S., Ogier J.-C., Bouix M.: Multiparametric flow
cytometry allows rapid assessment and comparison of lactic acid bacteria via-bility after freezing and during frozen storage. Cryobiology 2007, 55, 35-43. 29.Roszak D. B., Grimes D. J., Colwell R. R.: Viable but non-recoverable stage of Salmonella enteritidis in aquatic system. Can. J. Microbiol. 1984, 30, 334--338.
30.Vogel R., Bocker G., Stolz P., Ehrmann M., Fanta D., Ludwig W., Pot B., Kersters K., Schleifer K. H., Hammes W.: Identification of lactobacilli from sourdough and description of Lactobacillus pontis sp. nov. Int. J. Syst. Bac-teriol. 1994, 44, 223-239.
31.Wallner G., Amann R., Beisker W.: Optimizing fluorescent in situ hybridisa-tion with rRNA-targeted oligonucleotide probes for flow cytometric identifi-cation of microorganisms. Cytometry 1993, 14, 136-143.
32.Warmiñska-Radyko I., Olszewska M., Mik-Krajnik M.: Effect of temperature and sodium chloride on the growth and metabolism of Lactococcus strains in long-term incubation of milk. Milchwissenschaft 2010, 65, 32-35. Adres autora: mgr Magdalena Olszewska, Pl. Cieszyñski 1, 10-726 Olsztyn; e-mail: magdalena.olszewska@uwm.edu.pl
