Praca oryginalna Original paper
W badaniach funkcji w¹troby wykorzystuje siê wiele modeli in vitro, z których modelem spe³niaj¹cym naj-wiêcej wymagañ fizjologicznych, wa¿nych dla funk-cjonowania izolowanych hepatocytów, s¹ bioreaktory kapilarne (bioreaktor typu hollow-fiber) (3, 4, 6, 7, 11, 18). W porównaniu z innymi modelami dowiadczal-nymi, bioreaktor jest niew¹tpliwie najbardziej zaawan-sowany konstrukcyjnie: zapewnia nie tylko kontakt komórek z po¿ywk¹ i pod³o¿em sta³ym, ale umo¿li-wia równie¿ przep³yw medium od¿ywczego oraz w³a-ciw¹ polaryzacjê komórek. Dodatkowo, podobnie jak w¹troba, bioreaktor posiada co najmniej 2 kompart-menty: centralny i tkankowy, co jest niezwykle istotne
w badaniach kinetycznych. Modu³ bioreaktora prze-znaczony specjalnie do hodowli izolowanych hepato-cytów zosta³ opracowany przez zespó³ Zak³adu Far-makologii i Toksykologii SGGW we wspó³pracy z Ins-tytutem Biocybernetyki PAN. W uprzednich badaniach udowodniono, ¿e opracowany modu³ nadaje siê do hodowli hepatocytów (13) oraz porównano jego ak-tywnoæ z innymi prostszymi uk³adami in vitro w za-kresie nasilenia ureogenezy (14). Proponujemy, aby ocenê bioreaktorów w¹trobowych przeprowadzaæ w odniesieniu do modelu perfundowanej w¹troby, jako uk³adu wzorcowego dla bioreaktorów, oraz aby powy¿-sze porównanie przeprowadzaæ w medium ubogim
Porównanie aktywnoci metabolicznej
bioreaktora w¹trobowego z perfundowan¹ w¹trob¹
WOJCIECH KARLIK, PATRYCJA SZTUK, ADAM B¥KA£A, ALEKSANDER G£OWALA, DANUTA GRONO, MARIA WIECHETEK
Zak³ad Farmakologii i Toksykologii Katedry Nauk Przedklinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa
Karlik W., Sztuk P., B¹ka³a A., G³owala A., Grono D., Wiechetek M.
Comparative study of metabolic activity of liver bioreactor with perfused liver Summary
The aim this study was to compare metabolic activity of a hollow fiber bioreactor with a perfused liver. A special construction of a hollow fiber bioreactor was used with freshly isolated rat hepatocytes. After isolation, hepatocytes were incubated in the bioreactor for the duration of 3 hrs in the following conditions: 100 ml medium Hanks Balances Salts Solution supplemented with 4% albumin, 2 mM ornithine, 10 mM ammonium chloride and 6 mM ethanol were used; the medium was perfused in a circulated system for 25 ml/min; samples of the medium were taken to estimate ammonia, urea, glucose, lactate, ethanol, AST and ALT activity before and after 5 min and every 15 min of perfusion time. The same experimental condition was used in the perfused rat liver system. Utilization of ammonia was different in both systems and amounted to: 8.89 and 5.23 µmol/h/g hepatocytes in the bioreactor and perfused liver, respectively. Urea production was: 2.35 and 8.22 µmol/h/g hepatocytes, respectively. The largest differences between the compared systems were observed in the glucose and lactate metabolism. The bioreactor did not release glucose and lactate during the entire time of perfusion. In contrast, perfused liver intensively released glucose (31.32 µmol/hr/g cells) and produced lactate (29.42 µmol/hr/g cells). On the other hand, there was no statistically significance difference in the rate of ethanol metabolism between both systems, which amounted to 2.55 and 2.04 umol/h/g hepatocytes in the bioreactor and perfused liver, respectively. The results indicate that a bioreactor with freshly isolated hepatocytes is not bioequivalent to a perfused liver if estimation is made on the basis of ureogenesis and/or glucose utilization. However, ethanol utilization gives evidence that the metabolic activity of the bioreactor is comparable with a perfused liver. On the basis of the obtained results it can be concluded that the difference in metabolic activity of the bioreactor and perfused liver is connected with catabolic state and disturbances of energy metabolism in freshly isolated hepatocytes. In such a condition HBSS is not the proper medium for the recovery of homeostasis. To estimate the metabolic activity of freshly isolated hepatocytes cultivated in various in vitro systems such as a marker of model usefulness it is suggested to use the activity of inducible enzymes, but not constituent enzymes.
w sk³adniki od¿ywcze. Dotychczas takich badañ nie przeprowadzano. Istotna jest równie¿ odpowied na pytanie, jakie parametry nale¿y badaæ, a z jakich zre-zygnowaæ, aby otrzymane wyniki mia³y wartoæ prak-tyczn¹ oraz pozwala³y na wyznaczenie wspó³czynni-ków ekstrapolacji danych uzyskiwanych w badaniach in vitro do warunków in vivo. Celem badañ by³o po-równanie aktywnoci metabolicznej skonstruowane-go przez autorów bioreaktora w¹troboweskonstruowane-go z aktyw-noci¹ perfundowanej w¹troby, w specyficznych wa-runkach eksperymentalnych, z wykorzystaniem me-dium ubogiego w sk³adniki od¿ywcze.
Materia³y i metody
W dowiadczeniu wykorzystano szczury szczepu Wistar, samce, o redniej masie cia³a 450 g, od których pozyski-wano w¹trobê do perfuzji lub izolacji hepatocytów.
Modu³ bioreaktora. W eksperymencie wykorzystano modu³ bioreaktora opracowany specjalnie do hodowli wie-¿o izolowanych hepatocytów, skonstruowany przez Insty-tut Biocybernetyki i In¿ynierii Biomedycznej PAN we wspó³pracy z Katedr¹ Farmakologii i Toksykologii SGGW w Warszawie. Modu³ oparty jest na schemacie budowy hemofiltra z obudow¹ wykonan¹ z polipropylenu. Wewn¹trz obudowy znajduje od 600 do 800 kapilar (wykonanych z polisulfonu) o d³ugoci 140 mm, rednicy wewnêtrznej 360 µm i gruboci cian 60 µm. W modu³ach wykorzysta-nych w pracy punkt odciêcia membran kapilarwykorzysta-nych waha³ siê w granicach 50-250 kD. Ca³kowita powierzchnia ze-wnêtrzna kapilar umieszczonych w module wynosi³a 0,10--0,18 m2. Pod wzglêdem funkcjonalnym modu³
bioreakto-ra posiada 2 kompartmenty oddzielone membbioreakto-ran¹ kapilar: kompartment centralny, który jest sum¹ po³¹czonych prze-strzeni wewnêtrznych kapilar oraz kompartment zewnêtrz-ny (tkankowy, komórkowy), który stanowi przestrzeñ znaj-duj¹c¹ siê wewn¹trz obudowy (na zewn¹trz kapilar). Przez kompartment centralny przep³ywa medium od¿ywcze, a w kompartmencie zewnêtrznym znajduj¹ siê komórki. Oba kompartmenty posiadaj¹ niezale¿ne porty wejcia i wyj-cia.
Izolacja hepatocytów. Hepatocyty izolowano metod¹ dwustopniowej perfuzji w¹troby zgodnie z procedur¹ opi-san¹ przez Seglena (19) z niewielkimi modyfikacjami. Do inkubacji w bioreaktorze przeznaczono tylko te populacje komórek, których prze¿ywalnoæ wynosi³a powy¿ej 85%, a wydajnoæ izolacji przekracza³a 10 g hepatocytów/w¹t-robê. Wyizolowane hepatocyty w iloci 10 g umieszczano w module bioreaktora metod¹ aktywnego osadzania na ze-wnêtrznej powierzchni kapilar (13).
Perfuzja bioreaktora. Bioreaktor z osadzonymi hepa-tocytami, po zamkniêciu portów bocznych, pod³¹czano por-tami centralnymi do pompy perystaltycznej w celu prowa-dzenia perfuzji. Jako medium perfuzyjne zastosowano bufor Hanksa (100 ml) z dodatkiem 4% albuminy, 2 mM ornityny, 10 mM chlorku amonowego i 6 mM etanolu. Bioreaktor perfundowano przez 3 godziny z szybkoci¹ 2,5 ml/min./g hepatocytów. Przed rozpoczêciem perfuzji, w 5. minucie trwania perfuzji, a nastêpnie co 15 minut, pobierano po 2 ml medium z przeznaczeniem do analiz bio-chemicznych.
Perfuzja w¹troby in situ. Perfuzjê w¹troby prowadzo-no in situ, wprowadzaj¹c bufor Hanksa do ¿y³y wrotnej i odbieraj¹c go z ¿y³y g³ównej tylnej od strony prawego przedsionka serca. Stosowano identyczne warunki perfu-zji jak w przypadku bioreaktora. Szybkoæ perfuperfu-zji ustala-no przyjmuj¹c, ¿e masa w¹troby wyustala-nosi 6,5% masy cia³a szczura, a masa hepatocytów 60% masy w¹troby. W celu oceny warunków przep³ywu przez w¹trobê prowadzono pomiar cinienia medium na wejciu i wyjciu z w¹troby. Po zakoñczeniu eksperymentu w¹troby wa¿ono.
Analizy chemiczne. W próbkach medium, pobieranych podczas perfuzji bioreaktora i w¹troby, oznaczano stê¿e-nie amoniaku, mocznika, mleczanu, glukozy, etanolu oraz aktywnoæ aminotransferaz (ALT i AST). Wszystkie ozna-czenia wykonywano przy u¿yciu odpowiednich testów ko-lorymetrycznych firmy Sigma.
Analiza statystyczna. Analizê zmian metabolitów w cza-sie perfuzji przeprowadzano testem wieloczynnikowej ana-lizy wariancji. Do porównania wyników uzyskanych w obydwu uk³adach dowiadczalnych stosowano test t-Stu-denta. W ka¿dym przypadku porównywane rednie pocho-dzi³y z 4 niezale¿nych dowiadczeñ.
Wyniki i omówienie
Zarówno w dowiadczeniach z perfundowan¹ w¹t-rob¹, jak i bioreaktorem obserwowano spadek stê¿e-nia amostê¿e-niaku w medium, któremu towarzyszy³ wzrost stê¿enia mocznika (ryc. 1). Po zakoñczeniu perfuzji stê¿enie amoniaku w medium perfunduj¹cym biore-aktor wynosi³o 7,43 mM, podczas gdy w perfuzacie w¹troby by³o o ponad 1 mM ni¿sze i wynosi³o 6,34 mM. W obydwu uk³adach dowiadczalnych szczególnie intensywny spadek stê¿enia amoniaku obserwowano w ci¹gu pierwszych 50 min. perfuzji, natomiast od 80. minuty stê¿enie amoniaku utrzymywa³o siê na niemal niezmienionym poziomie do koñca trwania ekspery-mentu (ryc. 1). Porównuj¹c dynamikê zmian stê¿enia amoniaku mo¿na zauwa¿yæ, ¿e w modelu perfundo-wanej w¹troby spadek stê¿enia amoniaku by³ wiêkszy ni¿ w modelu bioreaktora. Nale¿y jednak podkreliæ, i¿ stwierdzona ró¿nica nie wiadczy o mniejszym wy-korzystaniu amoniaku przez hepatocyty w bioreakto-rze. Oceniaj¹c bowiem otrzymane wyniki, nale¿y uwzglêdniæ fakt, i¿ przez pierwsze 30 minut perfuzji zachodzi proces dystrybucji amoniaku z kompartmentu centralnego bioreaktora do kompartmentu tkankowe-go. Dystrybucja wszystkich badanych metabolitów zosta³a wyznaczona w innym eksperymencie, w któ-rym wykazano, ¿e czas wyrównania stê¿eñ miêdzy kompartmentem centralnym a komórkowym dla sto-sowanego modu³u bioreaktora (przy szybkoci prze-p³ywu 25 ml/min. i 100 ml kr¹¿¹cego buforu perfu-zyjnego) wynosi oko³o 30 min. (danych nie zamiesz-czono). A zatem dynamikê wykorzystania amoniaku nale¿y analizowaæ poczynaj¹c od 35 min. dowiad-czenia. Od 35. minuty perfuzji krzywe ilustruj¹ce zmia-ny stê¿enia amoniaku w obydwu modelach dowiad-czalnych mia³y równoleg³y przebieg opisany funkcj¹ ekspotencjaln¹, znan¹ z farmakokinetyki pierwszego
rzêdu. Wykorzystuj¹c powy¿sz¹ zale¿noæ mo¿na z krzywej regresji precyzyjnie obliczyæ stopieñ wyko-rzystania amoniaku. Dane przedstawione w tabeli 1. wskazuj¹, ¿e wykorzystanie amoniaku w modelu z bioreaktorem by³o o ponad 60% wiêksze ni¿ w mo-delu perfundowanej w¹troby, mimo ¿e bezwzglêdne stê¿enie amoniaku w perfuzacie bioreaktora by³o wy¿-sze przez ca³y okres objêty dowiadczeniem (ryc. 1).
Stê¿enie mocznika w medium po 3-godzinnej per-fuzji w¹troby by³o ok. 2-razy wy¿sze od stwierdzone-go w tym czasie w dowiadczeniu z bioreaktorem
i wynosi³o, odpowiednio, 2,61 i 1,31 mM (ryc. 1). Przez ca³y okres perfuzji obserwowano liniowy wzrost stê-¿enia mocznika w obydwu badanych modelach do-wiadczalnych, przy czym ogólna iloæ zsyntetyzowa-nego mocznika w uk³adzie perfundowanej w¹troby by³a ponad 3-krotnie wiêksza ni¿ w bioreaktorze (tab. 1).
Na podstawie stechiometrycznych przeliczeñ reak-cji syntezy mocznika z amoniaku mo¿na wnioskowaæ, ¿e w perfundowanej w¹trobie amoniak wykorzysty-wany by³ do syntezy mocznika, natomiast w
bioreak-AMONIAK 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 0 50 100 150 200
Czas perfuzji [min]
Stê¿enie
[mM]
0 50 100 150 200
Czas perfuzji [min]
Stê¿enie [mM] MOCZNIK 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 0 50 100 150 200
Czas perfuzji [min]
Stê¿enie [mM] MLECZAN 0,0 2,0 4,0 6,0 0 50 100 150 200
Czas perfuzji [min]
Stê¿enie [mM] GLUKOZA 4,0 8,0 12,0 16,0 20,0 0 50 100 150 200
Czas perfuzji [min]
Stê¿enie [mM] ETANOL 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 Bioreaktor W¹troba
Ryc. 1. Zmiany stê¿enia amoniaku, mocznika, glukozy, mle-czanu i etanolu w medium od¿ywczym podczas perfuzji w¹t-roby i bioreaktora w¹trobowego. Podano wartoci rednie z n = 4 powtórzeñ wraz z odchyleniami standardowymi
torze znaczna czêæ amoniaku (ok. 50%) wykorzystywana by³a w innych procesach ni¿ synteza mocznika. Ponadto otrzyma-ne wyniki wskazuj¹, ¿e w perfundowaotrzyma-nej w¹trobie znaczna czêæ mocznika (ponad 60%) syntetyzowana by³a z innych ró-de³ ni¿ dodany do medium NH4Cl. Nale-¿y zatem podkreliæ, ¿e w odniesieniu do natê¿enia zu¿ywania amoniaku i ureoge-nezy porównywane modele dowiadczal-ne nie s¹ biorównowa¿dowiadczal-ne.
Podobnie jak w przypadku mocznika, znacz¹ce statystycznie ró¿nice miêdzy po-równywanymi uk³adami dowiadczalny-mi zaobserwowano w odniesieniu do
stê-¿enia glukozy i mleczanu w medium (ryc. 1). W uk³a-dzie perfundowanej w¹troby obserwowano niemal li-niowy wzrost stê¿enia glukozy w perfuzacie, któremu towarzyszy³ wzrost stê¿enia mleczanu. Stê¿enie mle-czanu w pierwszych 60 min. perfuzji w¹troby wzros³o do wartoci blisko 6 mM i utrzymywa³o siê na tym poziomie do koñca dowiadczenia (ryc. 1). Natomiast w uk³adzie z bioreaktorem nie obserwowano istotnych zmian stê¿enia glukozy i mleczanu w medium pod-czas trwania eksperymentu (ryc. 1). Powy¿sze zmiany stê¿eñ badanych metabolitów w perfuzacie znajduj¹ odzwierciedlenie w ró¿nicach kinetyki uwalniania glu-kozy i mleczanu w porównywanych modelach (tab. 1). Tak wiêc, podobnie jak w przypadku ureogenezy, rów-nie¿ w odniesieniu do natê¿enia procesów glikogeno-lizy i glikoglikogeno-lizy porównywane modele dowiadczalne okaza³y siê ró¿ne.
W prezentowanej pracy wykorzystano bioreaktor specjalnie przystosowany do pracy na izolowanych hepatocytach szczura. Modu³ bioreaktora mia³ odpo-wiednio dobrane membrany polisulfonowe, które w osobnych eksperymentach uznano za najbardziej biozgodne (5, 9, 10, 12). Wielkoæ powierzchni mem-bran oraz objêtoæ kompartmentu komórkowego zo-sta³a dostosowana do iloci hepatocytów uzyskiwanych w standardowej izolacji z w¹troby szczura, metod¹ dwustopniowej perfuzji (500 × 106 hep.).
Odpowied-nie rozmiary modu³u oraz sprawdzony sposób umiesz-czania komórek na membranach gwarantowa³y przy-leganie do cian kapilar wszystkich wprowadzonych komórek i jednoczenie nie zmienia³y istotnie trans-portu przezb³onowego badanych metabolitów. Mimo powy¿szych cech, po porównaniu natê¿enia ureoge-nezy i przemian glukozy, okaza³o siê, ¿e w zastoso-wanych warunkach dowiadczenia konstrukcja biore-aktora nie spe³ni³a pok³adanych w nim oczekiwañ. Nie uzyskano dowodu na to, ¿e bioreaktor, dziêki zapew-nieniu w maksymalnym stopniu wymagañ fizjologicz-nych hepatocytów, móg³by stanowiæ bardziej wiary-godny model dowiadczalny w zakresie ekstrapolacji danych dowiadczalnych ni¿ obecnie dostêpne mode-le in vitro. Uzyskany wynik jest zaskakuj¹cy, jeli uwzglêdniæ fakt, ¿e w wielu publikacjach zwraca siê
uwagê na podobieñstwo aktywnoci metabolicznej izo-lowanych hepatocytów do aktywnoci w¹troby in vivo, nawet w tak prostych uk³adach dowiadczalnych, jak zawiesina komórkowa (1, 2, 8, 15-17, 20). Dodatko-wo, w badaniach w³asnych wykazano, ¿e zastosowa-ny bioreaktor jest bardziej uniwersalzastosowa-nym modelem ni¿ zawiesina czy kultura jednowarstwowa (14).
Uzyskane dane mog¹ sugerowaæ, ¿e w niniejszym eksperymencie wybór wskaników aktywnoci hepa-tocytów, w po³¹czeniu z zastosowanym medium, jest nieodpowiedni. Wydaje siê, ¿e w zaproponowanych warunkach eksperymentalnych lepszymi wskanika-mi do porównania aktywnoci metabolicznej ró¿nych modeli in vitro wykorzystuj¹cych wie¿o izolowane hepatocyty powinny byæ raczej reakcje katalizowane przez enzymy indukcyjne (g³ównie superrodziny CYP450). Oceniane w niniejszej pracy procesy (ure-ogeneza i przemiany glukozy) katalizowane s¹ przez enzymy konstytucyjne, w których czynnikiem limitu-j¹cym dla reakcji jest poda¿ substratów, podczas gdy w reakcjach katalizowanych przez enzymy indukcyj-ne limituj¹ca jest raczej poda¿ enzymu. Wiadomo, ¿e podczas izolacji hepatocytów dochodzi przede wszystkim do wyczerpania zasobów energetycznych komórki (a nie puli dostêpnych enzymów), st¹d bez-porednio po izolacji daj¹ siê zauwa¿yæ przede wszyst-kim ró¿nice w zakresie przemian limitowanych do-stêpnoci¹ substratów. W stanie nasilonego katabo-lizmu, stwierdzanego w hepatocytach po procedurze izolacji, warunki fizjologiczne gwarantowane przez model badawczy maj¹ znaczenie drugorzêdne. Bar-dziej istotny jest wówczas ³atwy dostêp sk³adników od¿ywczych. W eksperymentach, w których porów-nywano nasilenie ureogenezy w zawiesinie, hodowli p³ytkowej i bioreaktorze, bezporednio po izolacji he-patocytów, najwy¿sze natê¿enie ureogenezy stwierdzo-no w³anie w zawiesinie komórkowej, która pozba-wiona jest barier dyfuzyjnych, a wiêc zapewnia naj-lepsz¹ dostêpnoæ substratów (14). Z up³ywem czasu, w prawid³owo prowadzonej hodowli hepatocytów, bi-lans energetyczny komórek zostaje przywrócony, ale ze wzglêdu na ograniczon¹ syntezê bia³ek enzymatycz-nych oraz niewielk¹ stymulacjê ze strony
ksenobioty-Tab. 1. Wykorzystanie amoniaku i etanolu oraz produkcja mocznika, gluko-zy i mleczanu w modelu bioreaktora i perfundowanej w¹troby obliczone miêdzy 35. a 95. minut¹ perfuzji
Objanienia: obliczeñ dokonano z krzywych regresji funkcji stê¿enia od czasu, wyznaczonych z uwzglêdnieniem zmian stê¿enia poszczególnych zwi¹zków w przebiegu ca³ego eksperymentu. Uzyskane wartoci zosta³y przeliczone na 1 g hepatocytów, przy za³o¿eniu, ¿e 60% masy w¹troby szczura stanowi¹ hepatocyty. W tabeli zamieszczono rednie arytmetyczne z 4 dowiadczeñ ± SD. * p < 0,01 miêdzy modelami dowiadczalnymi
j a z d o R u l e d o m e i n a t s y z r o k y W u k a i n o m a Pmroodczunkickjaa Pgroludkuokzcyja Pmroledcuzkacnjua Wykeotraznyosltuanie ] w ó t y c o t a p e h g · z d o g [ / il o m µ r o t k a e r o i B 8,89±2,90 *2,35±0,44 3*1,35±1,4 2*1,55±1,51 2,55±1,13 a b o rt ¹ W 5,23±1,39 *8,22±1,10 *31,32±9,1 *29,42±2,32 2,04±1,26
ków, miêdzy poszczególnymi uk³adami in vitro poja-wiaj¹ siê istotne ró¿nice w zakresie aktywnoci enzy-mów indukcyjnych. W kulturze zawiesinowej ju¿ po 4 godz., a w kulturze p³ytkowej dopiero po 4-5 dniach silnie spada aktywnoæ CYP450 (15, 16, 21). Warto tutaj zaznaczyæ, ¿e w przedstawionym eksperymencie do perfuzji zastosowano doæ ubogie (pozbawione aminokwasów, hormonów i mikroelementów) medium. W takiej sytuacji komórki bardzo wolno wychodz¹ ze stanu katabolicznego. St¹d wp³yw procedury izolacji na funkcjonowanie hepatocytów umieszczonych w bioreaktorze okaza³ siê szczególnie widoczny.
Powy¿sze wyjanienia braku biorównowa¿noci bioreaktora z perfundowan¹ w¹trob¹ nie znalaz³y od-zwierciedlenia w danych dotycz¹cych zdolnoci do metabolizowania etanolu przez perfundowan¹ w¹tro-bê i bioreaktor. W obydwu modelach dowiadczalnych obserwowano identyczny spadek stê¿enia etanolu w medium perfunduj¹cym (ryc. 1); by³ on szczególnie intensywny w pierwszych 30 min. perfuzji. Poniewa¿ pierwszy etap zmian stê¿enia etanolu zwi¹zany jest z dystrybucj¹ tego zwi¹zku do kompartmentu tkanko-wego, analizê eliminacji przeprowadzono poczynaj¹c od 35. minuty perfuzji. Okaza³o siê, ¿e wykorzystanie etanolu oceniane po okresie dystrybucji nie ró¿ni³o siê istotnie w badanych modelach (tab. 1). Na tej podsta-wie nale¿a³oby stpodsta-wierdziæ, i¿ opracowany bioreaktor i perfundowana w¹troba s¹ uk³adami w pe³ni biorów-nowa¿nymi. Jednak na tle poprzednich wyjanieñ, wynikaj¹cych z porównania ureogenezy i glikolizy, trudno jest jednoznacznie wyt³umaczyæ wyniki doty-cz¹ce metabolizmu etanolu, szczególnie, ¿e dehydro-genaza alkoholowa nie jest enzymem indukcyjnym. Mo¿na przypuszczaæ, ¿e dostêpnoæ NAD niezbêdne-go do utlenienia etanolu by³a podobna w porównywa-nych uk³adach, mimo procedury izolacji komórek i zastosowania ubogiej po¿ywki.
Z przeprowadzonych badañ wynika, ¿e wybór in-dykatora mo¿e mieæ decyduj¹ce znaczenie dla oceny jakoci i przydatnoci danego modelu dowiadczalne-go do badañ in vitro. W przypadku bioreaktora zbudo-wanego na bazie wie¿o izolowanych hepatocytów, perfundowanego dodatkowo medium ubogim w sk³ad-niki od¿ywcze, poziom ureogenezy, analiza przemian glukozy i metabolizmu etanolu s¹ niew³aciwie do-branymi markerami, poniewa¿ prowadz¹ do rozbie¿-nych wyników. Przeprowadzony eksperyment sugeruje jednoczenie, ¿e w przypadku izolowanych hepatocy-tów obserwacja procesów kontrolowanych przez uk³a-dy enzymatyczne o charakterze konstytucyjnym zwiêk-sza ryzyko uzyskania rozbie¿nych wyników miêdzy ró¿nymi uk³adami in vitro. Poniewa¿ wspomniane roz-bie¿noci s¹ spowodowane prawdopodobnie silnym stanem katabolicznym wie¿o izolowanych hepatocy-tów, czêciowym rozwi¹zaniem powy¿szego proble-mu wydaje siê przeprowadzanie badañ porównaw-czych po d³u¿szym okresie stabilizacji komórek, w po-¿ywce bogatej w sk³adniki od¿ywcze. Jednak z
dru-giej strony, zbyt d³ugi okres stabilizacji zmniejsza ak-tywnoæ enzymów indukcyjnych, które nale¿a³oby poleciæ jako odpowiednie markery dla porównania ró¿nych modeli in vitro opartych na izolowanych he-patocytach.
Pimiennictwo
1.Benford D. J., Hubbard S. A.: Preparation and culture of mammalian cells, [w:] Snell K., Mullock B. (red.): Biochemical Toxicology. A Practical Approach, IRL Press Ltd., Oxford 1987, 57-82.
2.Berry M. N., Edwards A. M., Barritt G. J.: Utilization of hepatocytes for drug studies, [w:] Burdon R. H., van Knippenberg P. H. (red.): Isolated Hepatocytes. Preparation, Properties and Applications. Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford 1991, 179-200.
3.Dixit V. D.: Development of a bioartificial liver using isolated hepatocytes. Artificial Organs 1994, 18, 371-384.
4.Flendrich L. M. F., Soe J. S., Jorning G. G. A.: In vitro evaluation of a novel bioreactor based on an integral oxynegator and a spirally wound nonwoven polyester matrix for hepatocyte culture as small aggregates. J. Hepatol. 1997, 26, 1379-1392.
5.Garwacki S., Karlik W., Wiechetek W., Weryñski A.: Evaluation of metabolic activity of hepatocytes encapsulated in the hollow fiber, [w:] Capocaccia L., Merli M., Riggio O. (red.): Advances in Hepatic Encephalopathy and Metabo-lic Nitrogen Exchange. CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida 1995, 495-499. 6.Gerlach J. G.: Development of a hybrid liver support system: a review. Int.
J. Artif. Organs 1996, 19, 645-654.
7.Gerlach J. G., Encke J. E., Hole O. H., Muller C. M., Ryan C. R., Neuhaus P. N.: Bioreactor for a large scale hepatocyte in vitro perfusion. Transplantation 1994, 58, 984-988.
8.Griffin S. J., Houston J. B.: Comparison of fresh and cryopreserved rat hepato-cyte suspensions for the prediction of in vitro intrinsic clearance. Drug Metabo-lism Disposition 2004, 32, 552-558.
9.Jówiak A., Karlik W., Weryñski A., Wiechetek M.: Polisulfone membrane pro-motes hepatocytes adhesion in non-serum, non-hormones medium. XIth World Congress of the International Soc. Artif. Organs, Providence. Artif. Organs 1997, 21, 207.
10.Jówiak A., Karlik W., Wiechetek M., Weryñski A.: Attachment and metabolic activity of hepatocytes cultivated on selected polymeric membranes. Int. J. Ar-tif. Organs 1998, 21, 460-466.
11.Kamlot A. K., Rozga J. R., Watanabe F. W., Demetriou A. D.: Review: artificial liver support systems. Biotechnol. Bioeng. 1996, 50, 382-391.
12.Karlik W., Jówiak A., Weryñski A., Wiechetek M.: Polisulfone membrane improves hepatocytes metabolism and reduce damaging effect of heparin on hepatocytes. XIth World Congress of the International Soc. Artif. Organs, Provi-dence. Artif. Organs 1997, 21, 209.
13.Karlik W., Jówiak A., Wiechetek M., Weryñski A.: A simple method for hepato-cyte attachment in hollow fibre bioreactors. Int. J. Artif. Organs 1999, 22, 566--572.
14.Karlik W., Jówiak A., Wiechetek M., Weryñski A.: Hollow fiber hepatic bioreac-tor as an in vitro model for metabolism. A comparative study with monolayer and suspension culture. The Wessex Conference Centre Sparhholt, Winchester, UK, 14-18 IX. Abstract Book of 10th International Workshop on In Vitro Toxi-cology 1998, 3, 11.
15.Kowalska-Py³ka H., Muzyczuk-Piekarska A.: Komórki w¹troby model w ba-daniach in vitro. Medycyna Wet. 2002, 58, 189-191.
16.Li A. P.: Primary hepatocyte culture as an in vitro toxicological system of the liver, [w:] Gad S. C. (red.): In Vitro Toxicology, Raven Press, New York 1994, 195-220.
17.Naritomi Y., Terashita S., Kagayama A., Sugiyama Y.: Utility of hepatocytes in predicting drug metabolism: comparision of hepatoc intrinsic clearance in rats and humans in vivo and in vitro. Drug Metabolism Disposition 2003, 31, 580-588.
18.Nyberg S. L. N., Shirabe K. S., Peshwa M. V. P., Sielaff T. D. S., Crotty P. L. C., Mann H. J. M., Remmel R. P. R., Payne W. D. P., Hu W. H., Cerra F. B. C.: Extracorporeal application of a gel-entrapment bioartificial liver: demonstra-tion of drug metabolism and other biochemical funcdemonstra-tions. Cell Transplantademonstra-tion 1993, 2, 441-452.
19.Seglen P. O. S.: Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biolog. 1976, 13, 29-83.
20.Tyson C. A., Green C. E.: Application of liver and kidney cell system that reduce animal usage, [w:] Salem H. (red.): Animal Test Alternatives: Refinement, Reduction, Replacement. Marcel Dekker, Inc., New York 1995, 9-17. 21.Wiechetek M., Karlik W.: Izolowane hepatocyty: alternatywny model w
bada-niach toksycznoci. Medycyna pracy 1996, XLVII (supl. 6), 105-114. Adres autora: dr Wojciech Karlik, ul. Ciszewskiego 8, 02-796 Warszawa; e-mail: wojciech_karlik@sggw.pl
