Magdalena Walkowiak
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Oddział w Poznaniu
Zastosowanie hodowli rekombinacyjnej,
mutacyjnej oraz androgenezy in vitro
w badaniach nad lnem oleistym
(Linum usitatissimum L.)
The recombination breeding, mutagenesis and in vitro androgenesis
in the investigations on linseed (Linum usitatissimum L.)
Słowa kluczowe: len oleisty (Linum usitatissimum L.), mutageneza, kultury in vitro
Praca zawiera przegląd wyników badań tradycyjnej hodowli, zastosowania mutagenezy oraz wykorzystania kultur in vitro w hodowli lnu oleistego. Cenne surowce otrzymywane z tej rośliny znajdują różnorodne zastosowanie w przemyśle oraz rolnictwie. Olej lniany charakteryzuje się dużą zawartością nienasyconych kwasów tłuszczowych, zawiera ponad 60% kwasu linolenowego (C18:3)
i powyżej 10% kwasu linolowego (C18:2).
W wyniku zastosowania czynnika mutagennego — metanosulfonianu etylu (EMS) otrzymano len oleisty o zmienionej proporcji kwasów tłuszczowych. Zawartość kwasu linolowego wzrosła do 70,3%, a linolenowego obniżyła się do 2%.
Dla przyspieszenia prac nad uzyskaniem pożądanych genotypów lnu oleistego rozpoczęto badania nad możliwością uzyskania podwojonych haploidów (DH, ang. doubled haploid) poprzez kultury pylników i izolowanych mikrospor.
Key words: linseed (Linum usitatissimum L.), mutagenesis, in vitro cultures
The review contains a study of results of traditional breeding methods, the use of mutagenesis and in vitro cultures in breeding of linseed. Valuable materials obtained from this plant are used in various ways in industry and agriculture. Linseed oil is characterised by a large amount of unsaturated fatty acids, it contains over 60% linolenic acid (C18:3) and over 10% of linoleic acid (C18:2).
As a result of the use of mutagen factor — ethyl metansulphonate (EMS) there has been obtained a new genotype of linseed producing oil with changed proportion of fatty acids. The content of the linolic acid increased up to 70.3% and the content of the linolenic acid decreased to 2%.
Investigations were conducted on the possibility to obtain doubled haploids — DH with the use of anther and isolated microspores cultures in order to accelerate the work on breeding for the desirable linseed genotype.
Wstęp
Len jest jedną z najstarszych znanych człowiekowi roślin uprawnych,znany był już sześć tysięcy lat temu w starożytnej Mezopotamii (Woyke i Muśnicki 1999), również w Biblii można spotkać wzmianki na temat tej rośliny. Uprawiany jest w celu pozyskania nasion, które stanowią cenny surowiec w przemyśle farmaceutycznym, spożywczym, chemicznym, kosmetycznym oraz włókna dla przemysłu włókienniczego (Rumińska i Ożarowski 1990). Nasiona i makuchy są także wartościową paszą dla zwierząt (Borowiec i in. 2001, Barowicz i in. 2002).
Len jest polecany na pola obsiewane burakami cukrowymi, gdzie spełnia rolę rośliny fitosanitarnej zwalczającej mątwika burakowego — Heterodera schachtii Schmidt (Kalinowska-Zdun 1999). Wskazane jest obsiewanie lnem w celach nie-konsumpcyjnych terenów zanieczyszczonych pierwiastkami śladowymi, gdyż nie wykazuje niepożądanej zdolności do kumulacji w nasionach nadmiernej ilości chromu, cynku, ołowiu, miedzi, niklu, żelaza oraz manganu (Zając i in. 2002).
Czołowym producentem lnu oleistego na świecie jest Kanada, gdzie stanowi on szóstą pod względem znaczenia gospodarczego roślinę uprawną, rocznie pod uprawę lnu w tym kraju przeznacza się 600–800 tys. ha (Saeidi i Rowland 1999). W Europie do największych producentów należą Niemcy — 74 tys. ha, Wielka Brytania — 64 tys. ha oraz Francja — 47 tys. ha. Obecnie obserwuje się rosnące zainteresowanie uprawą lnu w krajach o chłodniejszym klimacie, należą do nich Szwecja (Uppström 1998), Irlandia Północna (Easson i Mollay 2000), Finlandia (Sankari 2000). W Polsce w 1988 roku len uprawiano na obszarze 81 tys. ha (Piotrowska 1993), natomiast w 2004 roku powierzchnia zmalała do 3,4 tys. ha, głównie był to len włóknisty (Rocznik Statystyczny Rzeczypospolitej Polskiej 2005).
Charakterystyka lnu oleistego
Len zwyczajny (Linum usitatissimum L.) jest rośliną jednoroczną, samopylną, należącą do rodziny lnowatych (Linaceaee) pochodzącą ze strefy klimatu umiarkowanego (Woyke i Muśnicki 1999). Easson i Mollay (2000) podają, iż len w warunkach klimatu umiarkowanego uprawiany jest na włókno, natomiast w ciep-lejszej strefie klimatycznej uprawia się formy oleiste (Aufhamner i in. 2000). Len oleisty występuje w dwóch formach użytkowych, jako len drobnonasienny o masie 1000 nasion powyżej 5,5 g oraz len grubonasienny o masie 1000 nasion od 10 do 15 g. Rośliny dorastają do wysokości 80 cm, posiadają łodygę prostą, obłą, która górą się rozgałęzia. Liście są lancetowate, zaostrzone, na łodydze układają się skrętolegle. Kwiaty jasnoniebieskie lub białe są umieszczone na szczytach pędów. Charakterystyczną cechą lnu jest krótki okres kwitnienia pojedynczego kwiatu, który trwa zwykle tylko kilka godzin w zależności od panujących warunków atmosferycznych. Ilość nasion w torebce zależy od odmiany, gęstości siewu oraz
żyzności gleby. Dojrzałe nasiona są gładkie, śliskie, błyszczące, brązowe lub żółte. Zawierają w swoim składzie około 6–12% śluzów, 30–40% oleju, 20–25% białka oraz glikozydy, sterole, enzymy i sole mineralne (żelaza, magnezu, miedzi, cynku). W nasionach lnu znajduje się cenna dla komórek nerwowych organizmu człowieka lecytyna i kwas linolenowy, a także witaminy A i E. Zawarty w nasionach gluko-zyd linamaryna obniża wartość pastewną i leczniczą nasion lnu (Woyke i Muśnicki 1999).
Intensywne prace hodowlane w Europie i w Kanadzie pod koniec XX wieku przyniosły efekt w postaci nowych bardzo plennych odmian o brązowych i żółtych nasionach (Rowland i in. 1990, Grady 1994, Dribnenki i Green 1995, Kenaschuk i Rushid 1998, Grant i in. 1999). W Polsce w roku 2007 w Rejestrze Odmian znaj-dują się cztery odmiany lnu oleistego (Lista odmian roślin rolniczych i warzywnych 2007). Lewandowski (2006) podaje, że krajowe odmiany lnu cechuje produktyw-ność na poziomie powyżej 2 t/ha. Również Piotrowska i Furowicz (1998) w prze-prowadzonych badaniach nad wysokotłuszczowymi odmianami Opal i Szafir osiągnęły plon przekraczający 2 t/ha. Natomiast Witkowicz i in. (2005) porów-nując polską odmianę Opal z kanadyjską odmianą Flanders uzyskali plon nasion powyżej 1,5 t/ha.
Obecnie prace hodowców są skierowane na pozyskanie odmian lnu charakte-ryzujących się wysokim plonem oleju z hektara. Jak podają Piotrowska i Furowicz (1998) z powierzchni jednego hektara można otrzymać 1 tonę oleju. Autorki te dodają, że rody jasnonasienne odznaczają się wyższą zawartością tłuszczu, a olej pozyskany z tych nasion posiada około 60% kwasu linolenowego. Także badania przeprowadzone przez Zająca i in. (2001) na brązowonasiennej odmianie Opal i żółtonasiennej odmianie Hungardian Gold wykazały, że odmiany jasnonasienne charakteryzują się wyższą zawartością tłuszczu, natomiast niższą zawartością białka w stosunku do odmian brązowonasiennych.
Wykorzystanie mutagenezy w hodowli lnu oleistego
Olej lniany tłoczony z nasion odmian o standardowym składzie kwasów tłusz-czowych posiada wysoką zawartość kwasu linolenowego, należącego do grupy omega 3. Dlatego olej lniany należy do olejów szybkoschnących i znajduje zastosowanie w produkcji farb i lakierów (Muśnicki 1999). Dla uzyskania bardziej trwałych form nadających się do celów spożywczych (smażenie i gotowanie), podjęto badania nad uzyskaniem nowych form lnu, którego nasiona będą posiadały obniżoną zawartość kwasu linolenowego. Pożądane efekty otrzymano poprzez hodowlę mutacyjną Green i Marshall (1984), w efekcie której otrzymano pierwszą niskolinolenową odmianę lnu (Dribnenki i Green 1995).
W wyniku zastosowania metanosulfonianu etylu (EMS) 0,3% i 0,4% w tem-peraturze 2oC oraz w temperaturze pokojowej Green i Marshall (1984) otrzymali
po-ziomem kwasu linolenowego do 31,1% i 28,9%. Formą rodzicielską obu mutantów była odmiana Glenelg, nasiona tej odmiany zawierały 43,3% kwasu linolenowego. Poprzez skrzyżowanie tych dwóch mutantów i selekcję w pokoleniu F2
wyodręb-niono rośliny zawierające poniżej 2% kwasu linolenowego (Green 1986a). Badania wykazały, że w liniach M-1589 i M-1722 zaszły różne mutacje w niesprzężonych ze sobą genach (Green 1986b).
Podobne doświadczenie przeprowadzili Nichterlein i in. (1988) stosując 0,5% EMS na nasiona lnu odmiany Raulinus; wyselekcjonowali mutanta, który w poko-leniu M5 posiadał obniżony poziom kwasu linolenowego z 55,4 do 38,9%, natomiast
zawartość kwasu linolowego z 14,2% wzrosła do 27,0%. Wskutek działania EMS na nasiona kanadyjskiej odmiany lnu McGregor o standardowym składzie kwasów tłuszczowych Rowland i Bhatty (1990) otrzymali trzy mutanty: E-67, E-1747, E-1929 o zmienionym składzie kwasów, największe zmiany w składzie kwasów tłuszczowych wystąpiły u mutanta E-1747. Zawartość kwasu oleinowego u tego mutanta wahała się od 13,7 do 24,7%, kwasu linolowego od 16,4 do 58,9%, a kwasu linolenowego od 14,5 do 49,3%. W wyniku dalszych prac nad uzyskanymi mutantami w pokoleniu M4 mutanta E-1747 wyselekcjonowano dwie linie
charakteryzujące się niską zawartością kwasu linolenowego i wysoką kwasu lino-lowego. Linia E-1747-9-1-5 zawierała 2% kwasu linolenowego i 63,9–75,4% kwasu linolowego, a linia E-1747-9-7-5 zawierała 1,9 kwasu linolenowego i 69,9–78,4% kwasu linolowego. Stabilność ekspresji tych cech u obu linii została potwierdzona w pokoleniu M5 (Rowland 1991).
Mutant Zero otrzymany w Australii (Green i Marshall 1984, Green 1986a) w wyniku metagenezy chemicznej przeprowadzonej za pomocą EMS, charaktery-zował się niską zawartością kwasu linolenowego i wysoką linolowego, posłużył do wyhodowania pierwszej odmiany niskolinolenowej lnu LinolaTM947,
zarejestro-wanej w 1993 roku w Kanadzie. Odmiana ta charakteryzowała się obniżoną zawartością kwasu linolenowego do 2,4% i wysoką kwasu linolowego — 71,5% (Dribnenki i Green 1995). Również Uppström (1998) stosując jako czynnik mutagenny 0,4% roztwór EMS otrzymał mutanty o zwiększonej zawartości kwasu linolowego oraz obniżonej kwasu linolenowego.
Len oleisty w kulturach in vitro
Rośliny wyższe mają zdolność do rozwoju na drodze androgenezy, kiedy to roślina powstaje z gametofitu męskiego. Proces ten może przebiegać dwutorowo, przez kulturę pylników lub izolowanych mikrospor na pożywce w warunkach in vitro. Powstałe w ten sposób rośliny są najczęściej haploidalne i mają liczbę chromosomów charakterystyczną dla gamet.
W Polsce pierwsze rośliny haploidalne (Atropa belladonna L.) w kulturze pylników in vitro otrzymano w latach siedemdziesiątych (Zenkteler 1971) oraz z Brassica napus w latach osiemdziesiątych XX wieku (Starzycki i Krzymański
1984). Obecnie odchodzi się od kultur pylnikowych na rzecz izolowanych mikrospor. Metoda izolacji mikrospor opisana przez Lichtera w 1982 roku jest rutynowo wykorzystywana w celu szybkiego otrzymania homozygotycznych linii (Lichter 1982). Charakteryzuje się ona dużą wydajnością, jest stosunkowo tania, co znacząco obniża koszty uzyskania pożądanych genotypów w stosunku do hodowli konwencjonalnej. Czas potrzebny do wyhodowania nowej odmiany można skrócić nawet o kilka lat, w zależności od gatunku. Według Nałęczyńskiej i in. (1995) metoda ta może znaleźć zastosowanie również w selekcji materiału roślinnego. Od wielu lat w kulturach in vitro izolowanych mikrospor z powodzeniem uzyskuje się homozygotyczne linie rzepaku ozimego (Brassica napus L.) (Cegielska i Szała 1997).
Po raz pierwszy regenerację roślin lnu oleistego z izolowanych mikrospor uzyskali Nichterlein i Friedt (1993), stosując do zawieszania wyizolowanych mikrospor pożywkę NLN, opracowaną przez Lichtera (1982), wzbogaconą 13% sacharozą. Odpowiednio przygotowaną zawiesinę mikrospor rozlewano na szalki Petriego i inkubowano w temperaturze 35 i 30oC.
W Zakładzie Genetyki i Hodowli Roślin Oleistych IHAR podjęto próby badawcze dotyczące regeneracji lnu oleistego w kulturze izolowanych mikrospor. Według badań własnych najodpowiedniejsze do izolacji są pąki kwiatowe o dłu-gości 0,4–0,5 cm, które zawierają mikrospory w stadium późnojednojądrowym (Walkowiak i in. 2006). Przed przystąpieniem do uwalniania mikrospor z pąków kwiatowych poddawano je sterylizacji w 2% podchlorynie wapnia i 70% etanolu. Wyizolowane mikrospory przenoszono na pożywkę NLN z 10 i 13% sacharozą, inkubacja przebiegała w temperaturze 30 i 24oC. Według wstępnych obserwacji
pierwsze formy embrioidalne lnu oleistego częściej występowały na pożywce NLN, gdzie źródłem węgla była 10% sacharoza, a inkubacja przebiegała w temperaturze 24oC. Również pożywka bogata w sacharozę korzystnie wpływa na tworzenie się
kalusa z pylników kilku odmian lnu oleistego (Wielgus i in. 2006).
Rośliny haploidalne i linie podwojonych haploidów (DH) są znane i wyko-rzystywane w badaniach genetycznych oraz hodowli od szeregu lat. Ze względu na swoją homozygotyczność samopylne rośliny, do jakich należy len oleisty, otrzy-mane z linii DH, mogą w bardzo krótkim czasie być zarejestrowane jako nowe odmiany. Potomstwo takich roślin jest identyczne jak formy rodzicielskie. Prowadzenie hodowli lnu oleistego z wykorzystaniem czynników mutagennych oraz kultur in vitro umożliwia zwiększenie istniejącej zmienności genetycznej.
Literatura
Aufhammer W., Wägner W., Kaul H.P., Kübler E. 2000. Strahlungsnutzung durch Bestände ölreicher Körnerfruchtarten – Winterraps, Öllein und Sonnenblume im Vergleich. J. Agronomy & Crop Sci., 184: 277-286.
Barowicz T., Migdał W., Pieszka M. 2002. Skład chemiczny siary i mleka loch żywionych w trakcie ciąży oraz laktacji dawkami z udziałem oleju lnianego. Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XXIII 495-500.
Borowiec T., Zając T., Migdał W., Micek P. 2001. Wpływ skarmiania nasion lnu oleistego w daw-kach pokarmowych na strawność składników oraz wskaźniki fizjologiczne w treści żwacza i surowicy krwi owiec. Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XXII: 207-216.
Cegielska-Taras T., Szała L. 1997. Regeneracja roślin z mikrosporowych zarodków rzepaku ozimego (Brassica napus L.). Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XVIII: 21-30.
Dribnenki J.C.P., Green A.G. 1995. Linola TM 947 low linolenic acid flax. Can. J. Plant Sci., 75: 201-202.
Easson D.L., Mollay R.M. 2000. A study of the plant, fibre and seed development in flax and linseed (Linum usitatissimum) grown at a range of seed rates. J. Agric. Sci., Cambridge, 135: 361-369. Grady K.A., Lay G.L. 1994. Registration of Day flax. Crop Sci., 34 (1): 308.
Grant C.A., Dribnenki J.C.P., Bailey L.D. 1999. A comparison of the yield response of solin (cv. Linola 947) and flax (cvs. McGregor and Vimy) to application of nitrogen, phosphorus, and Provide (Penicillium bilaji). Can. J. Plant Sci., 79: 527-533.
Green A.G. 1986a. A mutant genotype of flax (Linum usitatissimum L.) containing very low levels of linolenic acid in its seed oil. Can. J. Plant. Sci., 66: 499-503.
Green A.G. 1986b. Genetic control of polyunsaturated fatty acid biosynthesis in flax (Linum
usitatissimum) seed oil. Theor. Appl. Genet., 72: 654-661.
Green A.G., Marshall D.R. 1984. Isolation of induced mutants in linseed (Linum usitatissimum) having reduced linolenic acid content. Euphytica, 33: 321-328.
Kalinowska-Zdun M. 1999. Rośliny okopowe korzeniowe. W: Szczegółowa uprawa roślin. Jasińska Z., Kotecki A. (red.). Wydawnictwo AR Wrocław, t. 1: 386-434.
Kenaschuk E.O., Rashid K.V. 1998. AC Watson flax. Can. J. Plant Sci., 78: 465-466.
Lewandowski A. 2006. Synteza wyników doświadczeń rejestrowych – 2005, 2004. Zeszyt 44. COBORU, Słupia Wielka, 7-12.
Lichter R. 1982. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus. Z. Pflanzen-phsiol., 105: 427-434.
Lista odmian roślin rolniczych i warzywnych wpisanych do krajowego rejestru odmian w Polsce. 2007. Str. 38.
Muśnicki Cz. 1999. Rośliny oleiste. Len oleisty. W: Szczegółowa uprawa roślin. Jasińska Z., Kotecki A. (red.). Wydawnictwo AR Wrocław, t. 2: 485-487.
Nałęczyńska A., Cegielska T., Szała L. 1995. Technika kultur izolowanych mikrospor rzepaku (Brassica napus L.) i jej zastosowania. Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XVI: 43-46.
Nichterlein K., Marqvard R., Friedt W. 1988. Breeding for modified fatty acid coposition by induced mutations in linseed (Linum usitatissimum L.). Plant Breeding, 101: 190-199.
Nichterlein K., Friedt W. 1993. Plant regeneration from isolated microspores of linseed (Linum
usitatissimum L.). Plant Cell Reports, 12: 426-430.
Piotrowska A. 1993. Stan i perspektywy hodowli lnu oleistego. Postępy Nauk Rolniczych, 5/245: 101-103.
Piotrowska A., Furowicz B. 1998. Postęp w hodowli jasnonasiennego lnu oleistego. Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XIX: 641-643.
Rowland G.G., Bhatty R.S. 1990. Ethyl methanesulphonate induced fatty acid mutations in flax. J. Am. Oil. Chem. Soc., 67: 213-214.
Rowland G.G., Kenaschuck E.O., Bhatty R.S. 1990. Flanders flax. Can. J. Plant Sci., 70: 543-544. Rowland G.G. 1991. An EMS – induced low-linolenic acid mutant in McGregor flax (Linum
usitatissimum L.). Can. J. Plant Sci., 71: 393-396.
Rumińska A., Ożarowski A. 1990. Leksykon roślin leczniczych. PWRiL, Warszawa, 263, 279. Saeidi G., Rowland G.G. 1999. Seed colour and linolenic acid effects on agronomic traits in fax. Can.
J. Plant Sci., 79: 521-526.
Sankari H.S. 2000. Linseed (Linum usitatissimum L.) cultivars and breeding lines as stem biomass producers. J. Agronomy Crop Sci., 184: 225-231.
Starzycki M., Krzymański J. 1984. Wyniki prac na androgenezą B. napus w 1984 r. Wyniki Badań nad Rzepakiem Ozimym 1984 – Zeszyty Problemowe IHAR, 64-68.
Uppstöm B. 1998. Oljelin med hög halt linolsyra för humankonsumtion. Sveriges Ustädesförenings Tidskrift, 2: 64-78.
Walkowiak M., Piotrowska A., Cegielska-Taras T. 2006. Kultura izolowanych mikrospor lnu oleistego (Linum usitatissimum L.). W: Haploidy i linie podwojonych haploidów w genetyce i hodowli roślin. Adamski T., Surma A. (red.), IGR PAN: 127-130.
Wielgus K., Mańkowska G. 2006. Ocena zdolności pylników wybranych odmian lnu oleistego (Linum usitatissimum L.). Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XXVII: 213-222.
Witkiewicz R., Zając T., Kryńska B., Klima K. 2005. Zmienność i współzależność komponentów struktury plonu nasion lnu oleistego. Acta Agraria Et Silvestria, XLV: 11-17.
Woyke T., Muśnicki Cz. 1999. Rośliny włókniste. Len. W: Szczegółowa uprawa roślin. Jasińska Z., Kotecki A. (red.). Wydawnictwo AR – Wrocław, (2): 520-537.
Zając T., Borowiec F., Micek P. 2001. Porównanie produktywności, składu chemicznego i profilu kwasów tłuszczowych żółtych i brązowych nasion lnu oleistego. Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XXII: 441-453.
Zając T., Antonkiewicz J., Witkowicz R. 2002. Kształtowanie się zawartości wybranych pierwiast-ków w roślinach lnu oleistego (Linum usitatissimum L.) w zależności od fazy rozwojowej i części rośliny. Acta Agrobotanica, 54 (2): 27-34.
Zenkteler M. 1971. Development of new plants from leaves and roots of Atropa belladonna L. in the in vitro culture. Acta Soc. Bot. Pol., 40 (2): 305-313.
