Artyku³ przegl¹dowy Review
Vibrio spp. s¹ bakteriami szeroko rozpowszechnio-nymi w rodowisku morskim. Wystêpuj¹ w ciep³ych morzach u wybrze¿y Azji, Australii, Ameryki Pó³noc-nej i Po³udniowej, jak równie¿ w wodach przybrze¿-nych zachodniej i po³udniowej Europy (5, 23). Do ro-dzaju Vibrio nale¿y kilkadziesi¹t gatunków, z których kilkanacie uznaje siê za potencjalnie chorobotwór-cze dla cz³owieka. S¹ to zw³aszcza V. cholerae czynnik etiologiczny cholery, pandemicznej choroby zakanej, V. parahaemolyticus i V. vulnificus. Choro-botwórcze szczepy V. parahaemolyticus powoduj¹ ostre zapalenie przewodu pokarmowego, w przebiegu którego mo¿e dojæ do rozwoju posocznicy, koñcz¹-cej siê niekiedy mierci¹ (1, 23). Obecnoæ tych bak-terii w ¿ywnoci pochodzenia morskiego stanowi po-tencjalne ryzyko infekcji pokarmowych konsumentów. Do zaka¿enia dochodzi najczêciej po spo¿yciu suro-wych lub poddanych niedostatecznej obróbce termicz-nej ryb i owoców morza, rzadziej na skutek dostania
siê drobnoustroju do krwiobiegu, jako wynik infekcji przyrannych (1).
Charakterystyka V. parahaemolyticus
V. parahaemolyticus jest Gram-ujemn¹, prost¹, a nie-kiedy zaokr¹glon¹ pa³eczk¹, nale¿¹c¹ do rodziny Vibrionaceae (przecinkowce). W rodowisku p³ynnym wykazuje zdolnoæ ruchu dziêki obecnoci pojedyn-czej rzêski umieszczonej biegunowo. Bakterie te nie wytwarzaj¹ zarodników, rosn¹ zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych, w zakresie temperatur 5-45°C i pH rodowiska 4,8-11. S¹ drobnoustrojami halofilnymi, rozwijaj¹cymi siê w odpowiednim stê¿e-niu chlorku sodu (0,5-10%). W optymalnych warun-kach, czyli w temperaturze 37°C, przy pH rodowiska 7,8-8,6 i 3% stê¿eniu NaCl przejawiaj¹ niezwykle szybki wzrost czas generacji wynosi tylko 9-12 mi-nut. W warunkach ch³odniczych szybko ulegaj¹ inak-tywacji, zw³aszcza przy niedostatecznej zawartoci
Vibrio parahaemolyticus
potencjalne zagro¿enie dla zdrowia konsumentów
MAGDALENA £OPATEK, KINGA WIECZOREK, JACEK OSEKZak³ad Higieny ¯ywnoci Pochodzenia Zwierzêcego Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
£opatek M., Wieczorek K., Osek J.
Vibrio parahaemolyticus: Potential threat to consumer health
Summary
V. parahaemolyticus is a Gram-negative, straight, sometimes curved, bacillus that belongs to the family of Vibrionaceae. These bacteria are widespread in the marine environment, which is their main reservoir. V. parahaemolyticus occurs in estuaries and warm seawaters along the coasts of many continents. It is the most frequent cause of food poisoning in Asian countries, but only sporadically causes this type of health problems in Europe. This microorganism is halophilic, and its presence in seawaters is closely connected with seasonality. Only about 1% of V. parahaemolyticus occurring in the natural environment is pathogenic for people. The strains belonging to pandemic serotypes O3:K6, O1:KUT, O1:K25, O4:K68 are considered as the most pathogenic bacteria. The major sources of pathogenic strains are fish and seafood. Infection usually results from eating contaminated food, especially raw or undercooked food of marine origin. Man can be an asymptomatic carrier, and bacteria excreted with stool cause secondary environmental contamination. Clinical symptoms connected with gastroenteritis usually include severe watery diarrhoea, nausea and abdominal cramps. In the acute form of the disease, hemorrhagic gastroenteritis occurs. Moreover, severe infections may lead to complications connected with septicemia, which sometimes lead to death. Extraintestinal V. parahaemolyticus infections are rare and usually occur as wound infections. Culture methods that are commonly used for the identification of V. parahaemolyticus are laborious and time-consuming, and their results are not always clear. Recently, several DNA-based methods of detecting pathogenic V. parahaemolyticus have been developed. They are highly sensitive and specific, as well as faster than traditional microbiological analyses.
chlorku sodu w rodowisku (2). Pa³eczki V. para-haemolyticus s¹ oksydazo-ujemne, indolo-dodatnie, wykazuj¹ zdolnoæ dekarboksylacji lizyny i ornityny, nie rozk³adaj¹ sacharozy, natomiast fermentuj¹ glukozê bez wytwarzania gazu i H2S (3).
Ze wzglêdu na zró¿nicowan¹ budowê antygenu somatycznego O oraz polisacharydowego antygenu otoczkowego K w obrêbie gatunku V. parahaemoly-ticus wyró¿niono kilkadziesi¹t grup serologicznych, z których tylko nieliczne s¹ chorobotwórcze dla cz³o-wieka. Do tej pory zidentyfikowano 12 antygenów O i ponad 70 antygenów K, tworz¹cych serotyp V. para-haemolyticus (4). Za najbardziej chorobotwórcze uwa-¿a siê: O3:K6, O4:K68, O1:KUT, O1:K25. O1:K56, O4:K11 i O4:K12 (5, 7, 19, 21).
Zatrucia pokarmowe na tle V. parahaemolyticus Bakterie V. parahaemolyticus po raz pierwszy zo-sta³y zidentyfikowane jako przyczyna zatruæ pokar-mowych w 1951 r. w Japonii (8). W miecie Osaka odnotowano wówczas 272 przypadki zachorowañ po spo¿yciu sardynek, w tym 20 zejæ miertelnych. Do pocz¹tku lat 70. XX wieku drobnoustrój ten by³ ju¿ znany na ca³ym wiecie jako patogen przenoszony przez ¿ywnoæ pochodzenia morskiego. Najwiêcej za-chorowañ obserwuje siê w krajach azjatyckich, gdzie wystêpuje endemicznie, oraz w USA (1, 23).
W Japonii w latach 1996-1998 zanotowano 1710 ognisk epidemii wywo³anych chorobotwórczymi szcze-pami V. parahaemolyticus (g³ównie serotypem O3:K6), obejmuj¹cych w sumie 24 373 osób. Na Tajwanie w latach 1981-2003 patogen ten by³ przyczyn¹ oko³o 69% wszystkich zatruæ pokarmowych, z czego w wiêk-szoci przypadków izolowano szczep pandemiczny serotypu O3:K6. Liczba infekcji pokarmowych wywo-³anych przez ten serotyp od 1996 r. wykazuje tenden-cjê wzrostow¹ równie¿ w Indiach, Tajlandii i Bangla-deszu. Po raz pierwszy V. parahaemolyticus grupy O3:K6 zosta³ stwierdzony w Kalkucie w 1996 r. u pa-cjentów hospitalizowanych z objawami ostrej biegun-ki. Chorobotwórcze szczepy nale¿¹ce do serotypów: O1:K41, O1:K56, O3:K6, O3:K75, O4:K8, O4:K12 i O4:KUT by³y identyfikowane u pacjentów z zabu-rzeniami uk³adu pokarmowego w Wietnamie, Chinach i Korei. W ostatnich latach w wielu krajach Azji V. parahaemolyticus zosta³ uznany za najczêciej wy-stêpuj¹c¹ przyczynê zatruæ pokarmowych (2, 19, 23). W Stanach Zjednoczonych patogen ten po raz pierw-szy zosta³ wykryty w 1971 r. jako jeden z czynników etiologicznych zapalenia ¿o³¹dka i jelit. W trzech ogni-skach stwierdzono wówczas 425 przypadków zacho-rowañ po spo¿yciu krabów, poddanych niew³aciwej obróbce termicznej. W latach 1973-1998 zanotowano oko³o 40 epidemii na tle zaka¿eñ pa³eczkami V. para-haemolyticus, obejmuj¹cych ³¹cznie ponad 1000 przy-padków chorobowych. Wiêkszoæ z nich mia³a miej-sce w miesi¹cach letnich, g³ównie po spo¿yciu suro-wych ostryg. redni¹ zachorowalnoæ u ludzi
szaco-wano wówczas na oko³o 56%. Pierwsza epidemia w USA wywo³ana pandemicznym szczepem O3:K6 mia³a miejsce w 1998 r., gdzie u 416 pacjentów w 13 stanach wyst¹pi³y objawy zapalenia ¿o³¹dka i jelit po zjedzeniu ostryg pochodz¹cych z Zatoki Galveston w Teksasie. Latem 2004 r. u 14 pasa¿erów statku rej-sowego u wybrze¿y Alaski wyst¹pi³y objawy ostrego zatrucia pokarmowego. Czynnikiem etiologicznym tych zaka¿eñ okaza³y siê bakterie V. parahaemolyti-cus (19, 23).
W Europie przypadki zatruæ po spo¿yciu ¿ywnoci pochodzenia morskiego, zawieraj¹cej chorobotwórcze szczepy V. parahaemolyticus, wystêpuj¹ najczêciej sporadycznie, niemniej odnotowano te¿ kilka zacho-rowañ o charakterze epidemicznym. W 1997 r. we Francji stwierdzono 44 przypadki zaburzeñ ¿o³¹dko-wo-jelitowych zwi¹zanych z konsumpcj¹ krewetek importowanych z Azji, za w 1999 r. w Hiszpanii u 64 pacjentów wykazano zaka¿enia tymi bakteriami, po-twierdzone badaniami laboratoryjnymi. Przyczyn¹ za-chorowañ by³ serotyp O4:K11 (5, 23). W lipcu 2004 r. w jednej z hiszpañskich restauracji wykryto du¿e ogni-sko chorobowe. Hospitalizowano wówczas 80 goci weselnych, u których wyst¹pi³y objawy ostrego zatru-cia pokarmowego (13). W latach 2004-2005 w Wiel-kiej Brytanii zanotowano 57 zachorowañ wywo³anych przez V. parahaemolyticus, z czego w wiêkszoci przy-padków do zaka¿enia dosz³o podczas podró¿y na te-reny endemiczne (27). W 2007 r. we W³oszech opisa-no dwa przypadki zaka¿eñ pokarmowych po spo¿yciu ¿ywych ma³¿y blaszkoskrzelnych, których przyczyn¹ by³ wysoce patogenny serotyp O3:K6, za w 2008 r. jeden przypadek wywo³any serowarem O1:KUT, któ-ry ma bliski filogenetyczny zwi¹zek z klonem O3:K6 (17). Od 1995 r. wiêkszoæ klinicznych szczepów V. parahaemolyticus, izolowanych od chorych w wie-lu krajach, nale¿y do serotypu O3:K6. Bior¹c pod uwagê szybkoæ rozprzestrzeniania siê tego serotypu na wiecie oraz jego w³aciwoci patogenne, zosta³ on uznany za szczep pandemiczny. Dane dotycz¹ce wy-stêpowania w Europie zatruæ pokarmowych na tle V. parahaemolyticus wskazuj¹, ¿e najwiêksza ich licz-ba notowana jest w Hiszpanii, Francji, Wielkiej Bry-tanii i we W³oszech. Kraje te posiadaj¹ liczne obszary hodowli ma³¿y blaszkoskrzelnych i obserwuje siê w nich najwiêksze spo¿ycie owoców morza (5, 23). W Polsce do tej pory nie stwierdzono ¿adnego przy-padku zaka¿eñ wywo³anych chorobotwórczymi szcze-pami V. parahaemolyticus, niemniej wzrastaj¹ce w na-szym kraju spo¿ycie owoców morza mo¿e stanowiæ pewien czynnik ryzyka.
Wystêpowanie i ród³a zaka¿enia
G³ównym rezerwuarem V. parahaemolyticus jest rodowisko morskie. Drobnoustroje te stanowi¹ natu-raln¹ florê bakteryjn¹ wód przybrze¿nych i ujæ rzek, mog¹ równie¿ przylegaæ do chityny skorupiaków i zooplanktonu. Izolowane by³y od miêczaków, ryb
morskich i s³odkowodnych, a nawet od morskich ssa-ków. Opisano równie¿ przypadki ich wystêpowania w wodach rzek i jezior, które, jak siê przypuszcza, musia³y posiadaæ wysok¹ koncentracjê chlorku sodu, niezbêdn¹ do prze¿ycia bakterii (9). Ponad 99% bytu-j¹cych w rodowisku naturalnym V. parahaemolyticus to szczepy niepatogenne dla ludzi (1, 2). Cz³owiek mo¿e byæ ich bezobjawowym nosicielem, a bakterie wydalane z ka³em s¹ przyczyn¹ wtórnego zanieczysz-czenia rodowiska.
Obecnoæ drobnoustrojów w wodach morskich jest cile zwi¹zana z sezonowoci¹, a najwy¿szy poziom V. parahaemolyticus stwierdza siê w miesi¹cach let-nich. Zim¹, gdy temperatura wód spada, bakterie te mog¹ prze¿yæ w osadzie na dnie morza. W temperatu-rze poni¿ej 15°C ich wzrost jest zahamowany, za w temperaturach ni¿szych mog¹ gin¹æ (23). Najwiê-cej zatruæ pokarmowych wywo³anych przez V. para-haemolyticus przypada na okres letni, ze szczytem zachorowañ na prze³omie lipca i sierpnia. Obserwuje siê wówczas znaczny wzrost zanieczyszczenia ¿yw-noci pochodzenia morskiego tymi bakteriami, niekie-dy znacznie przekraczaj¹cy poziom 103 jtk/g (2, 9).
G³ównym ród³em zaka¿enia cz³owieka s¹ ryby i owoce morza. Filtruj¹c du¿e iloci wody, mog¹ one kumulowaæ chorobotwórcze szczepy V. parahaemo-lyticus. Do zaka¿enia cz³owieka dochodzi najczêciej drog¹ pokarmow¹, g³ównie po spo¿yciu surowej lub poddanej niedostatecznej obróbce cieplnej ¿ywnoci pochodzenia morskiego. Dawka zakana dla cz³owie-ka wynosi 105-107 drobnoustrojów (1, 19). Bardzo
wa¿nym czynnikiem w epidemiologii zatruæ pokarmo-wych na tle V. parahaemolyticus jest istniej¹cy w wie-lu krajach zwyczaj jedzenia surowych ryb i miêcza-ków. Japonia jest krajem, w którym stwierdzono naj-wiêksz¹ liczbê infekcji pokarmowych o charakterze epidemii po spo¿yciu surowej ¿ywnoci pochodzenia morskiego.
Pozajelitowe zaka¿enia V. parahaemolyticus s¹ sto-sunkowo rzadkie i wystêpuj¹ w postaci infekcji przy-rannych. Do zaka¿eñ tych dochodzi najczêciej pod-czas obróbki ryb i owoców morza, a tak¿e na skutek bezporedniego kontaktu uszkodzonej skóry z zanie-czyszczon¹ drobnoustrojami wod¹. Bakterie te izolo-wane by³y równie¿ z krwi, do której przenikaj¹, wy-wo³uj¹c posocznicê (1, 19).
Czynniki chorobotwórczoci
Wiêkszoæ szczepów V. parahaemolyticus izolowa-nych ze rodowiska lub ¿ywnoci pochodzenia mor-skiego nie wykazuje w³aciwoci patogennych. W od-ró¿nieniu od nich izolaty kliniczne pochodz¹ce od ludzi z zaburzeniami przewodu pokarmowego charak-teryzuj¹ siê du¿¹ inwazyjnoci¹ do komórek gospo-darza, jak równie¿ zdolnoci¹ produkowania toksyn. Do najwa¿niejszych czynników chorobotwórczoci V. parahaemolyticus nale¿¹ termostabilna hemolizy-na (thermostable direct hemolysin TDH) oraz
he-molizyna antygenowo spokrewniona z TDH (TDH--related hemolysin, TRH). Obie toksyny wykazuj¹ w³aciwoci hemolityczne, enterotoksyczne i cytotok-syczne (18). Termostabilna hemolizyna jest enzymem o masie 46 kDa, wystêpuj¹cym w postaci homodime-ru z³o¿onego z dwóch jednakowych peptydów. W³a-ciwoci hemolityczne TDH oceniane s¹ na specjalnym pod³o¿u z dodatkiem krwi (agar Wagatsuma). Obec-noæ hemolizy na po¿ywce okrelana jest jako zja-wisko Kanagawy (Kanagawa phenomenon KP). Prawie wszystkie szczepy kliniczne V. pararahaemo-lyticus wykazuj¹ aktywnoæ hemolityczn¹ typu â, po-woduj¹c ca³kowite zniszczenie krwinek czerwonych wokó³ rosn¹cej kolonii bakteryjnej. Ponad 90% KP--dodatnich izolatów klinicznych charakteryzuje siê obecnoci¹ termostabilnej hemolizyny. W przeciwieñ-stwie do nich tylko 1-2% szczepów rodowiskowych, w wiêkszoci KP-ujemnych, posiada zdolnoæ wytwa-rzania TDH (19). Mechanizm hemolizy erytrocytów oparty jest na wi¹zaniu hemolizyny z bia³kiem po-wierzchniowym krwinek czerwonych, po której do-chodzi do uszkodzenia b³ony komórkowej erytrocytu (19). Udowodniono, ¿e dwa aminokwasy Trp65 i Leu66 odgrywaj¹ znacz¹c¹ rolê w aktywnoci hemo-litycznej TDH (25). W³aciwoci cytotoksyczne i en-terotoksyczne hemolizyny zwi¹zane s¹ z zaburzeniem homeostazy Ca2+ w komórkach nab³onka jelitowego.
Wysoka koncentracja termostabilnej hemolizyny po-woduje wzrost liczby tworzonych kana³ów w b³onie komórkowej, w wyniku czego dochodzi do masowej ucieczki jonów wapnia do przestrzeni miêdzykomór-kowej. Zostaje zaburzona równowaga osmotyczna, co w konsekwencji prowadzi do nieodwracalnych zmian w strukturze komórek i do ich mierci. TDH uszkadza naturaln¹ barierê komórek nab³onka jelitowego, u³at-wiaj¹c bakteriom inwazjê komórek gospodarza (20). Termostabilna hemolizyna kodowana jest przez gen tdh zlokalizowany w chromosomie. Wszystkie KP--dodatnie izolaty V. parahaemolyticus zawieraj¹ dwie kopie tego genu tdh1 i tdh2, które w 97% wykazuj¹ homologiê nukleotydow¹ (15). W odró¿nieniu od nich szczepy, które daj¹ s³ab¹ hemolizê na agarze Waga-tsuma, posiadaj¹ pojedyncz¹ kopiê genu tdh. Toksyna TDH kodowana przez gen pochodz¹cy od KP-ujem-nych V. parahaemolyticus jest bardzo podobna struk-turalnie do hemolizyn kodowanych przez gen tdh1 i tdh2 obecnych w szczepach KP-dodatnich (19).
Drugim bardzo wa¿nym czynnikiem wirulencji u V. parahaemolyticus jest hemolizyna antygenowo spokrewniona z TDH (TRH). Po raz pierwszy zosta³a ona wykryta w 1988 r. podczas epidemii na Maledi-wach. U KP-ujemnych szczepów odpowiedzialnych za ostre zapalenie ¿o³¹dka i jelit zidentyfikowano wów-czas gen trh, przy jednoczesnym braku obecnoci tdh (10). Pod wzglêdem biologicznym, immunologicznym i fizykochemicznym toksyna TRH jest podobna, ale nie identyczna z termostabiln¹ hemolizyn¹. TRH jest kodowana przez chromosomalny gen trh wystêpuj¹cy
w dwóch wariantach trh1 i trh2, które wykazuj¹ 84% homologii w sekwencji nukleotydowej (12). Szczepy posiadaj¹ce trh prawie zawsze produkuj¹ ureazê, któ-rej zdecydowana wiêkszoæ pa³eczek V. parahaemo-lyticus nie wytwarza (16). Ostatnio coraz czêciej wy-krywane s¹ szczepy ureazo-dodatnie izolowane z kli-nicznych przypadków w Azji oraz Ameryce P³n. i P³d. Zale¿noæ miêdzy produkcj¹ ureazy kodowanej przez gen ureC a posiadaniem trh jest zwi¹zana z obecno-ci¹ tych markerów w jednej wyspie patogennoci zlo-kalizowanej w chromosomie (16).
Badania polegaj¹ce na sekwencjonowaniu genomu klinicznego szczepu V. parahaemolyticus RIMD2210633 wykaza³y obecnoæ dwóch odrêbnych systemów sek-recji typu III, obecnych w chromosomie du¿ym chr1 (TTSS1) i w chromosomie ma³ym chr2 (TTSS2). Chromosom ma³y zawiera wiêcej genów gatunkowo specyficznych. TTSS2 obecny w chromosomie 2 jest w³¹czony w du¿¹ wyspê patogennoci, która obejmu-je oba geny tdh. Podobnie jak tdh, równie¿ gen trh obejmu-jest zwi¹zany z systemem sekrecji typu III. TTSS jest g³ów-nym czynnikiem wirulencji u drobnoustrojów wywo-³uj¹cych biegunkê, np. Shigella, Salmonella, entero-patogenne E. coli i Vibrio (18, 19).
Kliniczne szczepy V. parahaemolyticus, które nie produkuj¹ ¿adnej hemolizyny, mog¹ posiadaæ inne czynniki wirulencji. Schorzenia wywo³ane przez ta-kie izolaty maj¹ zwykle zwi¹zek z adhezj¹ i inwazj¹ komórek nab³onka jelitowego. Do takich czynników potencjalnie chorobotwórczych nale¿¹: proteinowa kinaza tyrozynowa, proteaza serynowa (proteaza A) oraz polisacharyd otoczkowy (CPS), który odgrywa wa¿n¹ rolê w przyleganiu komórek bakteryjnych do nab³onka jelita (19, 21).
Obraz kliniczny
Zaka¿enia wywo³ane przez patogenne szczepy V. parahaemolyticus zwi¹zane s¹ przede wszystkim z zapaleniem ¿o³¹dka i jelit (gastroenteritis). Objawy pojawiaj¹ siê zwykle po 12-24 h od spo¿ycia zanie-czyszczonej ¿ywnoci pochodzenia morskiego, cho-cia¿ okres inkubacji choroby mo¿e trwaæ od 4 do 90 h, zale¿nie od liczby spo¿ytych komórek bakteryjnych i wra¿liwoci osobniczej (1). Dominuj¹cym objawem jest gwa³towna, wodnista biegunka, której towarzy-sz¹ nudnoci i bóle brzucha. Wymioty, gor¹czka, bóle g³owy i dreszcze pojawiaj¹ siê zdecydowanie rzadziej. W ostrym przebiegu choroby czêsto dochodzi do krwo-tocznego zapalenia ¿o³¹dka i jelit, czego wynikiem jest krwawa biegunka. Choroba ustêpuje zwykle po 1-7 dniach. U wiêkszoci pacjentów nie dochodzi do prze-³amania bariery jelitowej i dlatego obserwuje siê sa-moograniczaj¹cy i koñcz¹cy siê samowyleczeniem proces infekcji. Zaka¿enia o ciê¿kim przebiegu klinicz-nym wystêpuj¹ rzadko i mog¹ prowadziæ do gronych w skutkach powik³añ. Dotycz¹ one g³ównie osób z grupy podwy¿szonego ryzyka, tzn. dzieci, osób star-szych, kobiet w ci¹¿y oraz osób z niedoborami
immu-nologicznymi, u których sporadycznie mo¿e dojæ na-wet do zejæ miertelnych. Dane epidemiologiczne wskazuj¹, ¿e hospitalizacja pacjentów jest konieczna w oko³o 7% przypadków (2).
Stosunkowo rzadkie infekcje pozajelitowe prowa-dz¹ do posocznicy i zwi¹zanego z ni¹ uogólnionego procesu chorobowego. Pojawia siê wówczas gor¹cz-ka, niepokój oraz zawroty g³owy. Niekiedy mo¿e dojæ do zapalenia ucha zewnêtrznego (otitis externa) lub ga³ki ocznej (panophthalmitis) (1, 19). Opisano rów-nie¿ przypadki wyst¹pienia rumienia wielopostacio-wego (erythema multiforme), anemii hemolitycznej oraz reaktywnego zapalenia stawów (arthritis) (8).
Identyfikacja V. parahaemolyticus
Rutynowa metoda wykrywania obecnoci V. para-haemolyticus zosta³a zawarta w normie ISO/TS 21872-1. Opisano w niej cztery kolejne etapy postêpowania, z których pierwsze dwa to namna¿anie w p³ynnej po-¿ywce selektywnej zasadowej wodzie peptonowej z 2% NaCl, najpierw przez 6 h, a nastêpnie przez kolej-ne 18 h. Trzeci etap identyfikacji to posiew hodowli na dwie sta³e po¿ywki selektywne: agar z tiosiarcza-nem, cytryniatiosiarcza-nem, ¿ó³ci¹ i sacharoz¹ (TCBS) oraz agar z chlorkiem trifenylotetrazolu i tryptonem sojowym (TSAT) lub agar z siarczanem dodecylu, polymyksy-n¹ i sacharoz¹ (SDSPS). Czwarty, ostatni etap wykry-wania obecnoci V. parahaemolyticus polega na wy-konaniu biochemicznych testów potwierdzaj¹cych, okrelaj¹cych przynale¿noæ gatunkow¹ (3).
W ostatnich latach do identyfikacji V. parahaemo-lyticus coraz czêciej wykorzystywane s¹ chromogenne pod³o¿a. Po¿ywki te pozwalaj¹ wykrywaæ aktywnoæ enzymatyczn¹ drobnoustroju, co jest cile zwi¹zane z jego genotypem. W zale¿noci od produkowanych enzymów bakterie rosn¹ce na p³ytkach rozk³adaj¹ od-powiednie substraty chromogenne, co powoduje wy-barwianie rosn¹cych kolonii na odpowiednie kolory. Przyk³adem mo¿e byæ ChromID Vibrio (VID), na któ-rym typowe kolonie V. parahaemolyticus wybarwiaj¹ siê na ró¿owo i s¹ ³atwo odró¿niane od zielonych ko-lonii V. cholerae oraz od niebieskich koko-lonii charakte-rystycznych dla V. vulnificus. Po¿ywki chromogenne charakteryzuj¹ siê wysok¹ czu³oci¹ i specyficznoci¹ oraz pozwalaj¹ w prosty i szybki sposób ró¿nicowaæ wiele gatunków nale¿¹cych do rodzaju Vibrio. Nowa generacja pod³o¿y chromogennych pozwala na bez-poredni¹ identyfikacjê drobnoustrojów ju¿ po 18-24 h inkubacji.
Technik¹ rutynowo stosowan¹ do oznaczania licz-by V. parahaemolyticus jest metoda najbardziej praw-dopodobnej liczby (NPL) (4, 26). Oparta jest ona na posiewie szeregu trzech probówek z selektywn¹ po-¿ywk¹ namna¿aj¹c¹ (zasadowa woda peptonowa z 2% NaCl) dla ka¿dego z nastêpuj¹cych po sobie rozcieñ-czeñ. Najbardziej prawdopodobna liczba bakterii V. parahaemolyticus wyznaczana jest na podstawie liczby probówek z po¿ywk¹ namna¿aj¹c¹, które po
przesiewie na po¿ywkê TCBS tworz¹ charakterystycz-ne zielocharakterystycz-ne kolonie, a w badaniach potwierdzaj¹cych wykazuj¹ cechy typowe dla tych drobnoustrojów. Me-toda ta jest czasoch³onna i wymaga przeprowadzenia testów potwierdzaj¹cych, dlatego te¿ w ostatnim cza-sie opracowano szybkie techniki wykrywania i ozna-czania liczby V. parahaemolyticus oparte na po³¹cze-niu metody NPL z polimerazow¹ reakcj¹ ³añcuchow¹ (MPN-PCR) (14, 26). Zasada metody jest identyczna jak w przypadku standardowej procedury oznaczania NPL V. parahaemolyticus, z t¹ ró¿nic¹, ¿e potwier-dzenie obecnoci tych drobnoustrojów przeprowadza-ne jest przy u¿yciu metody PCR. Z ka¿dej probówki z selektywn¹ po¿ywk¹ namna¿aj¹c¹ izolowane jest DNA, a nastêpnie w reakcji PCR oznaczane s¹ cha-rakterystyczne dla V. parahaemolyticus geny toxR, tl (koduje termolabiln¹ hemolizynê) lub markery wiru-lencji tdh i trh (6, 11, 14, 24). NPL V. parahaemoly-ticus okrelana jest na podstawie liczby probówek z po¿ywk¹ namna¿aj¹c¹, które po potwierdzeniu me-tod¹ PCR wykazuj¹ obecnoæ specyficznych genów, charakterystycznych dla tych bakterii.
Do identyfikacji genów chorobotwórczoci V. pa-rahaemolyticus stosowane s¹ techniki biologii mole-kularnej oparte na polimerazowej reakcji ³añcuchowej lub hybrydyzacji DNA. Metoda polegaj¹ca na ampli-fikacji okrelonych genów za pomoc¹ PCR jest bar-dziej czu³a, swoista i szybsza w porównaniu z trady-cyjnymi analizami mikrobiologicznymi. Opracowano wiele testów pozwalaj¹cych na identyfikacjê drobno-ustrojów V. parahaemolyticus, w tym wykrywanie obecnoci genów toxR i tl, które s¹ gatunkowo specy-ficzne (6, 11). Opisano równie¿ metody oznaczania markerów wirulencji V. parahaemolyticus tdh i trh, koduj¹cych hemolizyny (6, 24). Dla oznaczenia kilku wybranych genów jednoczenie stosowana jest reak-cja multiplex PCR. Opracowano testy wykrywaj¹ce zarówno gatunkowo specyficzny marker tl, jak rów-nie¿ geny chorobotwórczoci tdh i trh metod¹ m-PCR (6). W ostatnich latach coraz czêciej przeprowadza siê identyfikacjê czynników wirulencji metod¹ real--time PCR (PCR w czasie rzeczywistym) (22).
Dla identyfikacji V. parahaemolyticus zosta³y opra-cowane równie¿ testy oparte o metodê hybrydyzacji z wykorzystaniem sond komplementarnych do chromo-somalnych genów wirulencji tdh, trh oraz do gatun-kowo specyficznego genu tl (4, 23). W metodzie tej stosowane s¹ sondy znakowane fosfataz¹ alkaliczn¹. Test hybrydyzacji pozwala nie tylko na detekcjê cz¹s-teczek o komplementarnych sekwencjach, ale tak¿e mo¿e byæ wykorzystywany jako pomiar ich iloci. Technika hybrydyzacji DNA nie wymaga izolacji czys-tych kultur, jest bardzo czu³a, swoista oraz stosunko-wo szybka, jednak¿e relatywnie wysokie koszty ogra-niczaj¹ stosowanie tej metody w rutynowej diagnos-tyce mikrobiologicznej V. parahaemolyticus.
Molekularna analiza izolatów V. parahaemolyticus pozwala na okrelenie stopnia ich pokrewieñstwa
i za-obserwowanie rozprzestrzenienia siê patogennych szczepów. Wród metod typowania tych drobnoustro-jów najwiêksze zastosowanie znalaz³y: elektroforeza pulsacyjna w zmiennym polu magnetycznym (PFGE), metoda oparta o polimorfizm d³ugoci fragmentów restrykcyjnych (RFLP), rybotypowanie oraz stosowa-na ostatnio metoda MLST, polegaj¹ca stosowa-na sekwencjo-nowaniu fragmentów genomu. Najczêciej jest to kil-ka genów niezbêdnych do utrzymania podstawowego metabolizmu komórkowego, obecnych we wszystkich izolatach danego gatunku. Przeprowadzaj¹c analizê molekularn¹ szczepów V. parahaemolyticus metod¹ MLST poddano sekwencjonowaniu geny: gyrB, recA, dnaE i gnd (19). Techniki typowania izolatów V. pa-rahaemolyticus znalaz³y zastosowanie w epidemio-logii poprzez monitorowanie rozprzestrzeniania siê patogennych drobnoustrojów. Badania, których celem by³o porównanie pandemicznych szczepów nale¿¹cych do czterech ró¿nych serotypów (O3:K6, O1:KUT, O1:K25, O4:K68) zosta³y przeprowadzone w oparciu o technikê Arbitrary Primed PCR, rybotypowanie, PFGE i MLST. Wykazano, ¿e porównywane szczepy nale¿¹ce do ró¿nych serotypów wykazywa³y bardzo du¿e podobieñstwo i najprawdopodobniej pochodzi³y od tego samego szczepu (19).
Podsumowanie
W ostatnich 30 latach znaczenie V. parahaemolyti-cus, jako drobnoustroju chorobotwórczego dla cz³o-wieka, znacznie wzros³o. Ryzyko zaka¿enia tymi bak-teriami jest du¿e przede wszystkim tam, gdzie istnieje zwyczaj jedzenia surowych ryb i miêczaków. W kra-jach azjatyckich drobnoustroje te s¹ jedn¹ z najczêst-szych przyczyn zatruæ pokarmowych. W Europie przy-padki zachorowañ na tle V. parahaemolyticus wystê-puj¹ sporadycznie, ale z roku na rok ronie ich liczba. Najwiêksze zagro¿enie stanowi¹ wyj¹tkowo patogen-ne szczepy nale¿¹ce do pandemiczpatogen-nego serotypu O3:K6. Wydaje siê wiêc uzasadnione uznanie V. para-haemolyticus za potencjalne zagro¿enie zdrowia cz³o-wieka.
Pimiennictwo
1.Acha P. N., Szyfres B.: Zoonoses and communicable diseases common to man and animals. PAHO. Washington 2003.
2.Anon.: Institute of Environmental Science and Research Limited. Risk profile: Vibrio parahaemolyticus in seafood. Christchurch, New Zealand 2003. 3.Anon.: ISO/TS 21872-1:2007 + Cor 1:2008 Microbiology of food and
animal feeding stuffs. Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. Part 1: Detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae.
4.Anon.: U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 9: Vibrio. 2004.
5.Baker-Austin C., Stockley L., Rangdale R., Martinez-Urtaza J.: Environmen-tal occurrence and clinical impact of Vibrio vulnificus and Vibrio parahae-molyticus: a European perspective. Environ. Microbiol. Rep. 2010, 2, 7-18. 6.Bej A. K., Patterson D. P., Brasher C. W., Vickery M. C. L., Jones D. D., Kaysner Ch. A.: Detection of total and hemolysin-producing Vibrio para-haemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods 1999, 36, 215-225.
7.Chowdhury N. R., Chakraborty S., Ramamurthy T., Nischibuchi M., Yamasaki S., Takeda Y., Nair G. B.: Molecular evidence of clonal Vibrio parahaemolyticus pandemic strains. Emerg. Infect. Dis. 2000, 6, 631-636.
8.Daniels N. A., Ray B., Easton A., Marano N., Kahn E., McShan A. L., Rosario L. D., Baldwin T., Kingsley M. A., Puhr N. D., Wells J. G., Augulo F. J.: Emergence of a new O3:K6 Vibrio parahaemolyticus serotype in raw oysters. JAMA 2000, 284, 1541-1545.
9.DePaola A., Kaysner C. A., Bowers J., Cook D. W.: Environmental investi-gations of Vibrio parahaemolyticus in oystrs after outbreaks in Washington, Texas and New York (1997 and 1998). Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, 4649-4654.
10.Honda T., Ni Y. X., Miwatani T.: Purification and characterization of a hemo-lysin produced by a clinical isolate of Kanagawa phenomenon-negative Vibrio parahaemolyticus and related to the thermostable direct hemolysin. Infect. Immun. 1988, 56, 961-965.
11.Kim Y. B., Okuda J., Matsumoto C., Takahashi N., Hashimoto S., Nishi-buchi M.: Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR gene. J. Clin. Microbiol. 1999, 37, 1173--1177.
12.Kishishita M., Matsuoka N., Kumagai K., Yamasaki S., Takeda Y., Nishi-buchi M.: Sequence variation in the termostable direct hemolysin-related hemolysin (trh) gene of Vibrio parahaemolyticus. Appl. Environ. Microbiol. 1992, 58, 2449-2457.
13.Martinez-Urtaza J., Simental L., Velasco D., DePaola A., Ishibashi M., Nakaguchi Y., Nishibuchi M., Carrera-Flores D., Rey-Alvarez C., Pousa A.: Pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6, Europe. Emerg. Infect. Dis. 2005, 11, 1319-1320.
14.Miwa N., Nishio T., Arita Y., Kawamori F., Masuda T., Akiyama M.: Evaluation of MPN metod combined with PCR procedure for detection and enumeration of Vibrio parahaemolyticus in seafood. J. Food Hyg. Soc. Japan. 2003, 44, 289-293.
15.Nishibuchi M., Kaper J. B.: Duplication and variation of the thermostable direct haemolysin (tdh) gene in Vibrio parahaemolyticus. Mol. Microbiol. 1990, 4, 87-99.
16.Okuda J., Ishibashi M., Abbott S. L., Janda J. M., Nishibuchi M.: Analysis of the termostable direct hemolysin (tdh) gene and the tdh-related hemolysin (trh) genes in urease-positive strains of Vibrio parahaemolyticus isolated on the west coast of the United States. J. Clin. Microbiol. 1997, 35, 1965-1971. 17.Ottaviani D., Leoni F., Rocchegani E., Santarelli S., Canonico C., Masini L.: First clinical repart of pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 infection in Italy. J. Clin. Microbiol. 2008, 46, 2144-2145.
18.Park K. S., Ono T., Rokuda M., Jang M. H., Okada K., Iida T., Honda T.: Functional characterization of two type III secretion systems of Vibrio para-haemolyticus. Infect. Immun. 2004, 72, 6659-6665.
19.Qadri F., Chowdhury N. R., Takeda Y., Nair G. B.: Vibrio parahaemolyticus seafood safety and associations with higher organisms. Oceans and Health: Pathogens in Marine Environment, New York 2005.
20.Raimondi F., Kao J. P., Fiorentini C., Fabbri A., Donneli G., Gasparini N., Rubino A., Fasano A.: Enterotoxicity and cytotoxicity of Vibrio parahaemo-lyticus thermostable direct hemolysin in vitro systems. Infect. Immun. 2000, 68, 3180-3185.
21.Ramamurthy T., Nair G. B.: Vibrio parahaemolyticus: the threat of another Vibrio acquiring pandemic potential. Conference on Microbiology of the Tropical Seas. National Institute of Oceanography, India 2004.
22.Robert-Pillot A., Copin S., Gay M., Malle P., Quilici M. L.: Total and patho-genic Vibrio parahaemolyticus in shrimp: fast and reliable quantification by real-time PCR. Int. J. Food Microbiol. 2010, 143, 190-197.
23.Su Y.-C., Liu Ch.: Vibrio parahaemolyticus: a concern of seafood safety. Food Microbiol. 2007, 24, 549-558.
24.Tada J., Ohashi T., Nishimura N., Shirasaki Y., Ozaki H., Fukushima S., Takano J., Nishibuchi M., Takeda Y.: Detection of the thermostable direct hemolysin gene (tdh) and the thermostable direct hemolysin-related hemo-lysin gene (trh) of Vibrio parahaemolyticus by PCR. Mol. Cell. Probes 1992, 6, 477-487.
25.Toda H., Sakiyama F., Yoh M., Honda T., Miwatani T.: Tryptophan 65 is essential for hemolytic activity of the thermostable direct hemolysin from Vibrio parahaemolyticus. Toxicon 1991, 29, 837-844.
26.Tunung R., Ghazali F. M., Noranizan M. A., Haresh K. K., Lesley M. B., Nakaguchi Y., Nishibuchi M., Son R.: Rapid detection and enumeration of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in raw vegetables from retail outlets. Int. Food Res. J. 2011, 18, 67-78.
27.Wagley S., Koofhethile K., Wing J. B., Rangdale R.: Comparison of Vibrio parahaemolyticus isolated from seafoods and cases of gastrointestinal disease in the UK. Int. J. Environ. Health Res. 2008, 18, 283-293. Adres autora: prof. dr hab. Jacek Osek, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: josek@piwet.pulawy.pl
