Monika ASZTEMBORSKA
Instytut Chemii Fizycznej PAN ul. Kasprzaka 44/52, 01-224 Warszawa
ZASTOSOWANIE METOD SEPARACYJNYCH
W BADANIU ENANCJOMERYZACJI
WPROWADZENIE
Zwi zki chiralne s w naturze bardzo powszechne. Najbardziej istotne dla ycia biopolimery tj. bia ka i DNA s zbudowane z chiralnych aminokwa-sów i cukrów.
Wiele innych substancji nale cych do grupy flawonoidów, alkaloidów,
terpenoidów i steroidów jest zwi zkami optycznie czynnymi. Co ciekawsze
wi kszo z tych naturalnych substancji jest biosyntezowana tylko w postaci
jednej z dwu mo liwych form. O takich zwi zkach mówi si , e s homochi-ralne. Homochiralne s peptydy i DNA zbudowane z L-aminokwasów i D-cukrów. Flawanony syntezowane w wiecie ro linnym s lewoskr tne.
Taki wysoki stopie homochiralno ci w ywych organizmach jest en-tropowo niekorzystny. Proces racemizacji homochiralnej substancji prowadzi do wzrostu entropii systemu. Tak wi c wraz ze mierci organizmu homochi-ralne substancje powinny racemizowa powoduj c wzrost nieuporz dkowa-nia systemu.
W zale no ci od struktury chiralnej biomoleku y proces racemizacji mo e by bardzo szybki jak w przypadku atropiny [1] lub wystarczaj co po-wolny jak w przypadku kwasu aspartamowego [2] aby by u ytecznym w wyznaczaniu wieku organizmów. Czasami jest te tak, e cz steczka zo-staje roz o ona lub zdegradowana zanim ulegnie racemizacji.
Innym istotnym problemem zwi zanym ze zwi zkami chiralnymi jest fakt, e dwa enancjomery chiralnej substancji chocia tak podobne pod
wzgl dem budowy chemicznej mog mie drastycznie ró n aktywno
biolo-giczn . Nie jest to szczególnie dziwne gdy u wiadomimy sobie, e organizmy ywe zbudowane z chiralnych bia ek i cukrów stanowi chiralne rodowisko rozró niaj ce dwa enancjomery tej samej substancji. Szczególnie istotne jest to w przypadku leków. Znanych jest wiele chiralnych substancji farmakolo-gicznych z których tylko jeden z enancjomerów ma w a ciwo ci lecznicze, drugi w najlepszym przypadku mo e by nieaktywny a w najgorszym mo e si okaza toksyczny. Np. atropina jest komercyjnie dost pna jako mieszanina racemiczna (DL-hioscyamina) jednak e tylko L-hioscyamina ma aktywno farmakologiczn . D-hioscyamina jest nieefektywna i powstaje jako produkt ra-cemizacji podczas ekstrakcji L-hioscyaminy z surowców ro linnych.
Znajomo stabilno ci konfiguracyjnej substancji staje si wi c
dopuszczaj ce leki jak np. FDA nie tylko kontroluj sprzeda leków race-micznych ale wymagaj jednoznacznych danych na temat konfiguracyjnej stabilno ci czystych enancjomerów. W konsekwencji producenci leków s zobowi zani do oszacowania stereochemicznej trwa o ci enancjomerów i zbadania ich potencjalnej podatno ci na konwersj .
Z drugiej strony znajomo szybko ci reakcji enancjomeryzacji substancji wyst puj cych naturalnie mo e by wykorzystana praktycznie do sprawdzania jako ci, stopnia wie o ci i zafa szowa produktów spo ywczych.
Stopie racemizacji aminokwasów w bia kach z bów (g ównie jest to kwas aspartamowy) jest np. wykorzystywany do oznaczenia wieku denata w naukach s dowych [3, 4]. Jest on równie wykorzystywany w oznaczaniu wieku próbek archeologicznych i geochemicznych [5, 6]. Ma równie zasto-sowanie w paleotermometrii [7].
Znajomo barier racemizacji substancji chiralnych mo e wi c by
istotna z punktu widzenia zastosowa praktycznych.
DEFINICJE
Przez enancjomeryzacj rozumiemy mikroskopowy proces odwracal-nej interkonwersji enancjomerów.
R
S
kenant kenant
Racemizacja to z kolei makroskopowy proces nieodwracalnej transformacji
enancjomerycznie wzbogaconej lub czystej próbki do mieszaniny racemicznej.
R
kracrac
kracS
Przy czym sta a szybko ci racemizacji jest dwukrotnie wi ksza od sta ej
szybko ci enancjomeryzacji (kenant=2krac). Mo na to wyt umaczy w ten
spo-sób, e na ka d cz steczk (-) utworzon z cz steczki (+) dwie moleku y ulegaj racemizacji, jako, e utworzona w ten sposób cz steczka (-)
równo-wa y skr calno optyczn innej nie przekszta conej cz steczki (+).
Diastereomeryzacja to z kolei molekularny proces transformacji jednego
dia-stereomeru w drugi, przy czym sta e szybko ci diastereomeryzacji nie s
sobie równe (kdiastAB kdiastBA)
Diast A
Diast B
kdiastAB kdiastBA
Do badania kinetyki enancjomeryzacji i diastereomeryzacji substancji mo na stosowa wiele ró nych metod m.in. polarymetria, dichroizm ko owy
(CD), dyspersja zdolno ci skr caj cej (ORD), protonowy rezonans
magne-tyczny 1H-NMR [8].
W ród tych metod istotne miejsce zajmuj metody chromatograficzne (wysokosprawna chromatografia cieczowa, chromatografia gazowa) oraz tody elektroforezy kapilarnej, które ogólnie mo na nazwa analitycznymi me-todami separacyjnymi. Ze wzgl du na pewne uproszczenia czasami obie techniki b d okre lane jako techniki chromatograficzne, chocia metoda elektroforezy kapilarnej zasadniczo zalicza si do technik elektromigracyjnych.
Metody separacyjne s u ce do badania barier enancjomeryzcji mo
-na w zasadzie podzieli -na dy-namiczne metody separacyjne [9-13] i metody separacyjne z zatrzymanym przep ywem (stopped-flow) [14-16].
Wykorzystanie metod separacyjnych do wyznaczania barier enancjo-meryzacji labilnych enancjomerów zapocz tkowano w latach 80-tych ubie-g eubie-go wieku wraz z rozwojem enancjoselektywnych metod separacyjnych. Oba rodzaje metod zosta y opisane w pracach przegl dowych [17, 18].
Przy pomocy DHPLC mo na mierzy bariery enancjomeryzacji w gra-nicach 65-105 kJ/mol, DGC 70-130 kJ/mol, natomiast przy pomocy SFMDGC 70-180 kJ/mol a SFMDCE 100-130 kJ/mol.
DYNAMICZNE METODY SEPARACYJNE
Chromatografia dynamiczna jest definiowana jako metoda s u ca do
badania procesów odwracalnej interkonwersji zachodz cych w czasie chro-matografowania.
Zosta a ona wykorzystana do wyznaczania barier enancjomeryzacji. W chromatografii enancjoselektywnej szybka interkonwersja enan-cjomerów powoduje tworzenie si plateau pomi dzy rozdzielonymi pikami. Przy dostatecznie szybkiej reakcji obserwuje si nak adanie si pików.
Minutes
20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5 23.0 23.5 24.0 24.5 25.0 25.5 26.0 26.5 27.0 27.5 28.0 28.5 29.0
Rys. 1. Przyk adowy chromatogram z widocznym plateau tworz cym si pomi dzy rozdziela-nymi enancjomerami
W przypadku przeprowadzania analizy enancjoselektywnej zjawiska
te s niepo dane i stanowi komplikacje, które likwiduje si poprzez
doda-tek modyfikatora organicznego b d zmian chiralnej fazy stacjonarnej. W dynamicznej chromatografii natomiast charakterystyczny profil piku nie tylko stanowi ród o diagnostyczne zachodz cego w kolumnie procesu inter-konwersji enancjomerów ale jest warunkiem do ilo ciowego wyznaczenia bariery enancjomeryzacji.
Sta e szybko ci oraz bariery enancjomeryzacji wyznacza si poprzez porównanie symulowanych komputerowo profilów elucji z uzyskanymi eks-perymentalnie chromatogramami [19, 20].
Rys. 2. Schemat równowag zachodz cych w kolumnie w czasie procesu chromatograficznego
Odwracalna pseudo-pierwszorz dowa reakcja enancjomeryzacji na
kolumnie przebiega z ró nymi sta ymi szybko ci ks w fazie stacjonarnej i km
w fazie ruchomej. Dla enancjomerów sta e szybko ci reakcji enancjomery-zacji w achiralnej fazie ruchomej s jednakowe dla obu enancjomerów. W chiralnej fazie stacjonarnej sytuacja si zmienia sta e szybko ci enancjo-meryzacji s ró ne dla obu enancjomerów z uwagi na tworzenie si diaste-romerycznych kompleksów pomi dzy rozdzielanymi enancjomerami i chiral-nym selektorem. Nie obserwujemy jednak w rezultacie enancjomerycznego wzbogacenia próbki gdy enancjomer który reaguje wolniej przebywa d u ej w fazie stacjonarnej.
KS i KR s wspó czynnikami podzia u enancjomerów R i S pomi dzy
faz ruchom i stacjonarn .
Z danych chromatograficznych mo emy wyliczy pozorne sta e szyb-ko ci enancjomeryzacji, które s rednimi wa onymi sta ych szybszyb-ko ci w fa-zie stacjonarnej i ruchomej. Sta e szybko ci w fafa-zie ruchomej mo na wyzna-czy niezale nie za pomoc innych metod.
Dynamiczna chromatografia gazowa [21-23], dynamiczna chromato-grafia cieczowa [24-27], dynamiczna elektroforeza kapilarna oraz micelarna elektrokinetyczna chromatografia cieczowa [28, 29] jak równie dynamiczna chromatografia w stanie nadkrytycznym [30] zosta y wykorzystane do wy-znaczania barier enancjomeryzacji wielu stereolabilnych zwi zków.
0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 [min]
METODY SEPARACYJNE Z ZATRZYMANYM PRZEP YWEM
W metodach chromatograficznych z zatrzymanym przep ywem race-miczna mieszanina jest wst pnie rozdzielana na kolumnie z faz chiraln w temperaturze, w której nie obserwuje si procesu enancjomeryzacji. W momencie gdy wiadomo, e enancjomery zosta y rozdzielone zostaje za-trzymany przep yw fazy ruchomej i kolumna jest ogrzewana w okre lonej temperaturze przez okre lony czas. Nast puje wtedy enancjomeryzacja rozdzielonych pików w rodowisku chiralnym. Nast pnie sch adza si ko-lumn do temperatury analizy, przywraca si przep yw fazy ruchomej i kon-tynuuje si analiz . Na uzyskanym chromatogramie oprócz rozdzielonych enancjomerów pojawiaj si dodatkowe piki pochodz ce z ulegaj cych enancjomeryzacji rozdzielonych zwi zków.
Rys. 3. Przyk adowy chromatogram rozdzielania enancjomerów otrzymany za pomoc chroma-tografii z zatrzymanym przep ywem
W metodach chromatografii wielowymiarowej z zatrzymanym prze-p ywem, racemiczna mieszanina jest wst prze-pnie rozdzielana na chiralnej fazie stacjonarnej, nast pnie jeden z enancjomerów jest kierowany do achiralnej kolumny reakcyjnej gdzie podczas podgrzewania nast puje enancjomeryza-cja w achiralnym rodowisku. Potem zenancjomeryzowana próbka jest kie-rowana na drug chiraln kolumn w celu rozdzielana jej na enancjomery. Zalet tej metody jest to, e enancjomeryzacja zachodzi w warunkach achi-ralnego otoczenia a nie w rodowisku chiralnym.
S
R S
kolumna chiralna kolumna reakcyjna pompa HPLC detektor 0 .00 20 .0 0 40 .0 0 60 .0 0 80 .0 0 0 .00 5.0 0 10.00 15 .00 [m in ] kolumna chiralna kolumna reakcyjna pompa HPLC detektor -2 0 2 4 6 8 10 0 5 1 0 1 5 2 0 25 [m in ]
Rys. 4. Schemat wielowymiarowej chromatografii cieczowej z zatrzymanym przep ywem
Parametry kinetyczne reakcji enancjomeryzacji i diastereomeryzacji niestabilnych stereoizomerów zosta y równie wyznaczone za pomoc me-tod separacyjnych z zatrzymanym przep ywem, m. in. chromatografii cie-czowej z zatrzymanym przep ywem [31] oraz dwuwymiarowej chromatografii gazowej z zatrzymanym przep ywem [32].
PODSUMOWANIE
Podsumowuj c mo na powiedzie , e obydwie metody znajduj za-stosowanie do wyznaczania barier enancjomeryzacji. Pierwsza z nich to znaczy chromatografia dynamiczna wymaga bardziej skomplikowanych ob-róbki matematycznej i symulacji komputerowej za to nie wymaga dodatko-wego sprz tu chromatograficznego. W przypadku metody z zatrzymanym przep ywem wymagana jest bardziej skomplikowana aparatura za to same obliczenia s proste.
Obie metody posiadaj wiele zalet:
nie wymagaj substancji optycznie czystych lub wzbogaconych, ra-cemat wystarcza do bada ,
wymagana jest bardzo ma a ilo próbki ok. 10-8 g,
zanieczyszczenia s na ogó oddzielone od próbki na kolumnie w zwi zku z tym nie przeszkadzaj ,
w przypadku GC mog by badane próbki gazowe lub te bardzo lotne,
pomiary mog by prowadzone w szerokim zakresie dobrze kontro-lowanej temperatury,
metody s szybkie, proste a wyniki s powtarzalne.
Jednak metody chromatograficzne nie sk adaj si z samych zalet. Podstawow wad tych metod jest to, e konieczne jest do ich zastosowania uzyskanie bardzo dobrego rozdzielenia enancjomerów co oczywi cie w wie-lu przypadkach jest spraw trudn . Tam gdzie rozdzielenie enancjomerów jest wystarczaj ce do okre lenia czysto ci optycznej niekoniecznie jest wy-starczaj ce do wyznaczenia bariery enancjomeryzacji.
LITERATURA
1. A. Huhtikangas, T. Lehtola, R. Virtanen, P. Peura, Finn. Chem. Lett.,
5(1982)63.
2. S. Ritz, H. Schütz, J. Forensic Sci., 38(1993)633.
3. S. Ohtani, K. Yamamoto, J. Forensic Sci., 36(1991)792.
4. E. Waite, M. Collins, S. Ritz-Time, H. Schutz, C. Cattaneo, H. Borrman,
Forensic Sci. Int., 103(1999)113.
5. G. Goodfriend, M. Kashgarian, M. Harasevych, Cosmochim. Acta,
59(1995)1125.
6. M. Collins, E. Waite, A. van Duin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. B,
354(1999)51.
7. G. Miller, J. Magee, A. Jull, Nature, 385(1997)241.
8. M. Reist, B. Testa, P.-A. Carrupt, Enantiomer, 2(1997)147.
9. J. Veciana, M. Crespo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 30(1991)74.
10. F. Gasparrini, D. Misiti, M. Pierini, C. Villani, Tetrahedron Assym.,
8(1997)2069.
11. J. Oxelbark, S. Allenmark, J. Org. Chem., 64(1999)1483. 12. G. Schoetz, O. Trapp, V. Schurig, Anal. Chem., 72(2000)2758. 13. F. Gasparrini, M. Pierini, C. Villani, J. Org. Chem., 68(2003)3173. 14. K. Rossen, J. Sager, Y. Sun, Chem. Commun., 1(1998)115. 15. S. Reich, O. Trapp, V. Schurig, J. Chromatogr. A, 892(2000)487. 16. O. Trapp, G. Schoetz, V. Schurig, J. Pharm. Biomed. Anal.,
27(2002)497.
17. J. Krupcik, P. Oswald, P. Majek, P. Sandra, D.W. Armstrong, J.
Chro-matogr. A, 1000(2003)779.
18. Ch. Wolf, Chem. Soc. Rev., 34(2005)595.
19. M. Jung, V. Schurig, J. Am. Chem. Soc., 114(1992)529. 20. O. Trapp, V. Schurig, Chirality, 14(2002)465.
21. W. Bürkle, H. Karfunkel, V. Schurig, J. Chromatogr., 288(1984)1. 22. M. Jung, V. Schurig, J. Am. Chem. Soc., 114(1992)529.
23. D. Hochmuth, W. König, Tetrahedron Asymmetry, 10(1999)1089. 24. T. Nishikawa, Y. Hayashi, S. Suzuki, H, Kubo, H. Ohtani, J.
25. K. Lorenz, E. Yashima, Y. Okamoto, Angew. Chem. Int. Ed.,
37(1998)1922.
26. J. Oxelbark, S. Allenmark, J. Chem. Soc. Perkin Trans., 2(1999)1587. 27. J. Oxelbark, S. Claeson, S. Allenmark, Enantiomer, 5(2000)413.
28. D. Wistuba, O Trapp, N. Gel-Moreto, R. Galensa, V. Schurig, Anal.
Chem., 78(2006)3424.
29. G. Schoetz, O. Trapp, V. Schurig, Enantiomer, 5(2000)391.
30. Ch. Wolf, W. Pirkle, Ch. Welch, D. Hochmuth, W.A. König, G.-L. Chee, J. Charlton, J. Org. Chem., 62(1997)5208.
31. M. Asztemborska, J. ukowski, J. Chromatogr. A, 1134(2006)95. 32. Ph. Marriott, K. Aryusuk, R. Shellie, D. Ryan, K. Krisnangkura, V.
