Teresa Cegielska-Taras, Laurencja Szała, Magdalena Trybus*
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Zakład Roślin Oleistych w Poznaniu * Akademia Medyczna w Poznaniu, Zakład Immunologii
Określanie ploidalności androgenicznych
młodych roślin rzepaku ozimego (Brassica napus L.)
za pomocą cytometrii przepływowej
Estimation of ploidy level of a young specimen of an androgenic winter
oilseed rape (Brassica napus L.) with flow cytometry
Słowa kluczowe: Brassica napus L., androgeniczne rośliny, określanie ploidalności, cytometria przepływowa, fluorochrom jodek propidyny
Key words: Brassica napus L., androgenic plants, ploidy determination, flow cytometry, propidium iodide fluorochrom
Metodę cytometrii przepływowej wykorzystano do określenia ploidalności roślin otrzymanych z zarodków mikrosporowych rzepaku ozimego. Praca zawiera opis izolowania w buforze całych jąder komórkowych oraz wybarwiania ich jod-kiem propidyny jako specyficznym dla DNA fluorochromem. Wybarwione jodkiem propi-dyny jądra analizowano cytometrem przepły-wowym FACScan (Becton-Dickinson). Metoda ta pozwala na szybkie klasyfikowanie dużej liczby androgenicznych roślin na różne grupy w zależności od zawartości DNA w ich komór-kach (do ich zbliżonej liczby chromosomów): ha-ploidy, diploidy oraz inne struktury genomowe.
Flow cytometric method was applied to the in vitro microspore-derived plants of winter oilseed rape in order to estimate their ploidy level. The paper describes the preparation of suspensions of intact nuclei in an appropriate buffer and the staining of the nuclei DNA with propidium iodide as a specific DNA fluorochrome. Propidium iodide-stained nuclei were analysed with FACScan flow cytometer (Becton-Dickinson). The method allows a quick classification of a large number of androgenic plantlets into different groups according to the DNA content in their cells (to their approximate chromosome number): haploids, diploids or other genomic structures.
Wstęp
Izolowane mikrospory rzepaku (Brassica napus L.) mogą być indukowane w kulturze in vitro do rozwoju w zarodki haploidalne i dalej w rośliny. Wpro-wadzenie kolchicynowania mikrospor zaraz po ich izolacji w celu podwojenia liczby chromosomów w połączeniu z bezpośrednim otrzymywaniem roślin z zarodków mikrosporowych (MDE) znacznie usprawniło i przyspieszyło otrzymywanie dowolnej liczby podwojonych haploidów (DH) z różnych form
wyjściowych (Cegielska-Taras, Szała 1998). Wczesna identyfikacja i możliwość eliminacji haploidalnych zarodków czy młodych roślin przed kwitnieniem, szcze-gólnie w przypadku rzepaku ozimego, bardzo obniża koszty uzyskania linii DH. Do kwitnienia i zawiązania nasion doprowadzane są jedynie podwojone haploidy. Natomiast identyfikacja haploidalnej natury zarodków na poziomie in vitro pozwala przy wczesnej selekcji na kolchicynowanie otrzymanych z nich młodych roślin, co bardzo skraca czas uzyskania nasion z wybranych genotypów (Cegielska-Taras i in. 1997, 1999).
Pomiar zawartości DNA w pojedynczym jądrze komórkowym rośliny dokonany przy pomocy cytometru przepływowego (FCM = flow cytometry), ze specyficznym dla DNA fluorochromem, jest wykorzystywany do określenia jej ploidalności. Posługując się tą metodą można analizować prawie każdy rodzaj materiału roślinnego: zarodki, siewki, liście, korzenie, kwiaty, nasiona i skórkę owoców. Pomiar nie wymaga preparacji i wybarwiania chromosomów meta-fazowych oraz czasochłonnych obserwacji mikroskopowych (Doleżel 1997). Metoda ta jest łatwa (przygotowanie prób jest proste), szybka (w ciągu jednego dnia można wykonać kilkaset prób), a w ciągu jednej minuty można prze-analizować miliony jąder. Próbę można przygotować z kilku miligramów tkanki, co nie powoduje większych uszkodzeń zarodka czy organu rośliny.
Niniejsza praca poświęcona jest adaptacji metody oznaczania ilościowego DNA jądrowego przy pomocy cytometru przepływowego do wczesnego określenia ploidalności androgenicznych zarodków i młodych roślin rzepaku ozimego.
Materiał i metody
Rośliny androgeniczne otrzymywano z izolowanych mikrospor różnych dawców poprzez ich regenerację z zarodków mikrosporowych: rzepaku wysoko-erukowego niskoglukozynolanowego o symbolu ER1, ER2, ER5 (Cegielska-Taras i in. 1999), mieszańca o symbolu R22 rzepaku pomiędzy różnymi podwójnie ulepszonymi męskoniepłodnymi liniami CMS ogura i restorującą linią z wysoką zawartością glukozynolanów (Cegielska-Taras i in. 1997) oraz F1 mieszańca rzepaku podwójnie ulepszonego o symbolu H5 (Cegielska-Taras, Szała 1997).
Do analizy pobierano około półcentymetrowe kawałki liścia młodych roślin, bądź fragment jednego liścienia z mikrosporowego zarodka w kulturze in vitro. Materiał roślinny rozdrabniano poprzez nacinanie go żyletką (unikając przy tym rozgniatania) w 1 ml buforu do izolacji jąder z komórek (Śliwińska i in. 1999). Następnie do zawiesiny rozdrobnionych fragmentów tkanki dodawano 50 µl roztworu rybonukleazy (Doleżel i in. 1992) oraz 50 µl roztworu jodku propidyny (Doleżel i in. 1992). Po kilku sekundach i delikatnym wymieszaniu całą mieszaninę przesączano przez gazę Nytex o wielkości oczek 40 µm do probówki,
w której dokonywano oznaczenia. Do czasu wykonania analizy probówki z zawie-siną jąder umieszczano w ciemności, w lodówce. Próby były mierzone godzinę po izolacji jąder z komórek na cytometrze przepływowym w Zakładzie Immunologii AM w Poznaniu. Aparat FACScan (Becton-Dickinson) wyposażony jest w laser argonowy jonowy 15 MW (488 nm — światło wzbudzenia). Fluorescencja jodku propidyny mierzona jest detektorem przy długości fali światła 585 nm. Płyn płuczący stabilizowany jest azydkiem sodu o pH 7,4. Liczba komórek możliwa do zliczenia od 10 do 2x105 /ml. Warunki pomiaru fluorescencji do 3000 zliczeń w 1024 kanałach fluorescencji dla wszystkich prób. Rejestrowano krzywą obrazu-jącą częstotliwość komórek o różnej fluorescencji oraz określano powierzchnię pod poszczególnymi pikami charakterystycznymi dla różnych stopni ploidalności.
Na początku każdej serii kalibrowano aparat wykonując pomiary ilości DNA jądrowego dla diploidalnej rośliny rzepaku ozimego odmiany Bor lub Marita, bądź linii DH O-120.
Bufor do izolacji jąder komórkowych (Śliwińska i in. 1999):
12,1 g TRIS, 0,5 g chlorku magnezu sześciowodnego, 5,0 g chlorku sodo-wego, 1,0 ml Tritonu X-100 i 700 ml wody destylowanej. Po doprowadzeniu pH do 7,0 przy pomocy kwasu octowego roztwór uzupełniano do 1000 ml. Tak przy-gotowany bufor zamrażano w porcjach ok. 100 ml.
Bufor do izolacji jąder komórkowych LBO1 (Doleżel i in. 1989):
15 mM TRIS, 2 mM Na2EDTA, 0,5 mM sperminy, 80 mM KCl, 20 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 7,5. Przygotowany bufor przesączano przez filtr 0,22 µm, a następnie dodawano 15 mM merkaptoetanolu. Przechowywano zamro-żone porcje.
Roztwór rybonukleazy (Doleżel i in. 1992):
Rozpuszczano 25 mg RNA-zy (Sigma R-5000) w 25 ml dejonizowanej wody, następnie inaktywowano DNA-zę przez ogrzewanie 15 min w temp. 90°C, po ochłodzeniu przesączano przez filtr 0,22 µm. Roztwór podzielony na porcje 500 µl zamrażano.
Roztwór jodku propidyny (Doleżel i in. 1992):
Rozpuszczano 25 mg jodku propidyny (Sigma P-4170) w 25ml dejonizowanej wody, przesączano przez filtr 0,22 µm. Roztwór podzielony na porcje 500 µl zamrażano.
Wyniki i dyskusja
Klasyczne liczenie chromosomów w mikroskopie świetlnym w celu okreś-lenia ploidalności w interfazowych komórkach jest bardzo czasochłonne i wymaga
prób zawierających komórki w mitotycznej aktywności. Wygodniejszą metodą jest analiza FCM zawartości jądrowego DNA (Doleżel 1997). Pomiar cytometrem przepływowym oparty jest na użyciu specyficznego dla DNA fluorochromu i iloś-ciowym przeliczeniu względnej intensywności emitowanej przez DNA fluores-cencji. W rezultacie otrzymuje się histogram z pikiem dominującym, odpowia-dającym jądrom w fazie G1 cyklu komórkowego i mniejszy pik dla jąder w fazie G2.
Zawartość DNA w jądrze komórkowym określona bez trudu za pomocą cytometrii przepływowej wymaga jednak porównania z odpowiednim wzorcem, rośliną z tego samego gatunku, ale o znanej ploidalności. Lokalizację piku G1 na histogramie zawartości DNA należy porównać z pikiem rośliny kontrolnej. W prezentowanej pracy były to, każdorazowo na początku i w połowie wykonywanej serii oznaczeń, próby z roślin diploidalnych z odmiany Bor, Marita lub z linii DH O-120, przykład takiego pomiaru przedstawiono na rysunku 1. Wykonywano także pomiary roślin haploidalnych, których ploidalność wcześniej została stwierdzona w fazie ich kwitnienia, przykład takiego pomiaru przedstawia rysunek 2.
W pierwszych seriach oznaczeń ploidalności androgenicznych roślin o sym-bolach ER1, ER2, ER5, R22, cytometrem przepływowym do izolacji jąder używano buforu LBO1 (Doleżel in. 1989). Bufor ten zawiera w swoim składzie kosztowne odczynniki (np. sperminę). W dalszej części prowadzonych badań na roślinach o symbolu H5, używano buforu o składzie zaproponowanym przez Śliwińską i in. (1999). Przy stosowaniu tych dwóch buforów nie zaobserwowano różnic w ilości wyizolowanych jąder komórkowych oraz w kształcie histogramów, przede wszystkim dla roślin wzorcowych. W rutynowym oznaczaniu ploidalności opisywaną metodą stosowany jest obecnie bufor proponowany przez Śliwińską i in. 1999.
Jodek propidyny jest fluorochromem specyficznym dla DNA oraz RNA (Doleżel i in. 1992). Dlatego przed wybarwianiem DNA jądrowego dodawana jest rybonukleaza, dla rozłożenia wyizolowanego wcześniej RNA. Po usunięciu w ten sposób RNA jodek propidyny wiąże się stechiometrycznie tylko z DNA.
Ilość uzyskanych roślin haploidalnych z różnych mieszańców – dawców mikrospor była różna, wahała się od 0 do ponad 36% (tab. 1). Ponieważ w stosowanej metodyce uzyskiwania linii podwojonych haploidów rzepaku włączony jest proces kolchicynowania mikrospor, liczba indukowanych DH jest duża. Natomiast jak wynika z pracy Foisset i in. 1997, ilość spontanicznie podwojonych haploidów wahała się od 10 do 35%. W przeprowadzonych bada-niach uzyskano niewielką liczbę roślin o zwiększonej ploidalności — 2 tetraploidy na 195 analizowanych roślin. Zgodne jest to z innymi pracami (Foisset i in. 1997), gdzie ilość osobników o stwierdzonej innej niż n lub 2n liczbie chromosomów nie przekraczała 6%.
G2 G1
Rys 1. Histogram rośliny diploidalnej rzepaku ozimego — Histogram of diploid plant of winter oilseed rape
G2 G1
Rys. 2. Histogram rośliny haploidalnej rzepaku ozimego — Histogram of haploid plant of winter oilseed rape
Tabela 1 Charakterystyka androgenicznych roślin otrzymanych z różnych dawców mikrospor rzepaku ozimego, których ploidalność oznaczono metodą cytometrii przeływowej
Characteristics of winter oilseed rape androgenic plants obtained from different donor plants which ploidy level was estimated using flow cytometry
Symbol roślin dawcy mikrospor Symbol of microspore donor plants Liczba roślin No of plants
Wynik analizy cytometrycznej: stopień ploidalności [%]
Cytometric analysis: ploidy level in %
Typ roślin: płodne lub niepłodne
Type of plants: fertile (F) or non fertile (NF) ER1 11 20 1 n — 34,4 2n — 62,5 4n — 3,1 niepłodne (NF) płodne (F) płodna (F) ER2 23 2n — 100 płodne (F) ER5 7 33 n — 17,5 2n — 82,5 niepłodne (NF) płodne (F) R22 7 1 11 n — 36,8 n — 5,3 2n — 57,9 niepłodne (NF) płodne (F) płodne (F) H5 2 4 74 1 n — 2,5 n — 4,9 2n — 91,4 4n — 1,2 niepłodne (NF) płodne (F) płodne (F) płodne (F)
Oznaczenia ploidalności pojedynczej androgenicznej rośliny wykonywano w omawianych badaniach jeden raz. Zgodność odczytu ploidalności z histogramów z rzeczywistą naturą osobników była dość duża (tab. 1). Wśród roślin dawców R22 i H5, w niektórych przypadkach odczyt cytometryczny wskazywał na haploidy, jednak w rzeczywistości były one płodne i zawiązywały nasiona. Rośliny z tych form wyjściowych wyprowadzone zostały poprzez zastosowanie wtórnej embrio-genezy zarodków mikrosporowych. Możliwe jest więc sektorialne podwojenie liczby chromosomów. Czasami obserwuje się roślinę o pędzie haploidalnym i diploidalnym, fragment liścia pobranego do badań mógł pochodzić z sektora haploidalnego. Zdarzało się także, że otrzymywane histogramy były „niejedno-znaczne”, tzn. trudne do określenia: haploid, diploid czy inny. W badaniach innych autorów (Doleżel in. 1997) zwraca się uwagę na możliwość występowania pewnych trudności w interpretacji histogramów. Jest to związane z występo-waniem takich zjawisk, jak np. zlepianie się jąder (gdy od momentu izolacji do pomiaru upłynie zbyt długi czas), mogą również występować zakłócenia w kali-bracji samego aparatu. W takim przypadku należy nawet kilkakrotnie powtórzyć badaną próbę z rośliny. Jeśli natomiast występują trudności z określeniem właś-ciwej ploidalności można wykonać pomiary mieszaniny zawiesiny jąder: badanej
próby oraz próby wzorcowej o znanej ploidalności i na tej podstawie interpretować histogram.
Zaprezentowana metoda oznaczania ploidalności roślin przy pomocy cyto-metru przepływowego polega na porównaniu ilości jądrowego DNA z zawartością DNA w jądrach rośliny tego samego gatunku, o znanym stopniu ploidalności. W przeprowadzonych badaniach metoda wykazała dużą precyzję w rozróżnianiu stopnia ploidalności roślin otrzymanych na drodze androgenezy in vitro. Ułatwia to uzyskiwanie dużej liczby linii DH. Jest to ważne, ponieważ linie homozygotyczne znajdują coraz szersze wykorzystanie w programach hodowlanych i badaniach genetycznych. Różne modyfikacje opisanej metody są stosowane w wielu światowych ośrodkach zajmujących się podwojonymi haploidami. W wyniku przeprowadzonych badań, także i w Zakładzie Roślin Oleistych do selekcji podwojonych haploidów rzepaku wprowadzono cytometryczny pomiar jądrowego DNA roślin uzyskanych z mikrospor w procesie kultury in vitro.
Podziękowanie
Autorzy składają serdeczne podziękowanie Panu Prof. dr hab. Janowi Żeromskiemu, Kierownikowi Katedry i Zakładu Immunologii Akademii Medycznej w Poznaniu, za umożliwienie wykonania niniejszych badań przy wykorzystaniu cytometru przepływowego.
Literatura
Cegielska-Taras T., Szała L. 1997. Regeneracja roślin z mikrosporowych zarodków rzepaku ozimegoBrassica napus L. Rośliny Oleiste, XVIII: 21-30.
Cegielska-Taras T., Szała L., Gazecka B., Liersch A., Popławska W., Bartkowiak-Broda I. 1997. Wczesna selekcja androgenicznych linii rzepaku ozimego z genem restorerem dla systemu CMS ogura i niską zawartością glukozynolanów. Zeszyty Naukowe Akademii Rolniczej w Krakowie 250: 325-328.
Cegielska-Taras T., Szała L. 1998. Metoda bezpośredniego uzyskiwania podwojonych haploidów z mikrosporowych zarodków rzepaku ozimego (Brassica napus L.). Rośliny Oleiste, XIX (2): 353-357.
Cegielska-Taras T., Szała L., Nałęczyńska A., Kołodziej K., Ogrodowczyk M. 1999. In vitro selection for high erucic acid content in microspore-derived embryos of winter oilseed rape (Brassica napus L.). J. Appl Genet., (w druku).
Doleżel J. 1997. Application of flow cytometry for the study of plant genomes. J. Appl. Genet., 38: 285-302.
Doleżel J., Binarova P., Lucretti S. 1989. Analysis of nuclear DNA content in plant cells by flow cytometry. Biologia Plantarum, 31: 113-120.
Doleżel J., Sgorbati S., Lucretti S. 1992. Comparison of three DNA fluorochromes for flow cytometric estimation of nuclear DNA content in plants. Physiol. Plant, 85: 625-631.
Foisset N., Delourme R., Lucas M.O., Renard M. 1997. In vitro androgenesis and segregation distortion in Brassica napus L.: spontaneous versus colchicine-doubled lines. Plant Cell Reports, 16: 464-468.
Śliwińska E., Hai-Chun Jung, Job C., Job D., Bergervoet J.H.W., Bino R.J., Groot S.P.C. 1999. Effect of harvest time and soaking treatment on cell cycle activity in sugarbeet seeds. Seed Science Research, 9: 91-99.
