Rola biofilmu bakteryjnego w patogenezie wysiękowego zapalenia ucha środkowego

Pełen tekst

(1)CHOROB Y NARZ¥DU CHOROBY S£UCHU Niedzielski A, Kozio³-Montewka www.mediton.pl  Otorynolaryngologia, M, Niedzielska 2006,G 5(3), i wsp.: 19-23 Rola biofilmu bakteryjnego w patogenezie wysiêkowego zapalenia S£ …UCHU. 103. www.mediton.pl  Otorynolaryngologia, 2006, 5(3), 103-106. Rola biofilmu bakter yjnego w patogenezie bakteryjnego wysiêkowego zapalenia ucha œrodkowego The role of bacterial biofilms in the pathogenesis of otitis media with effusion ARTUR NIEDZIELSKI 1/, MARIA KOZIO£ -MONTEWKA 2/, GRA¯YNA NIEDZIELSKA 1/ , AGNIESZKA B OGUT 2/, J OLANTA PALUCH-OLEŒ 2/, MICHA£ K OTOWSKI 1/, MACIEJ MONTEWKA 2/, B EATA K ASZTELEWICZ 2/ 1/ 2/. Katedra i Klinika Otolaryngologii Dzieciêcej, Foniatrii i Audiologii AM w Lublinie Katedra i Zak³ad Mikrobiologii Lekarskiej AM w Lublinie. Ostre wysiêkowe zapalenie ucha œrodkowego (OME) jest najczêœciej skutkiem przemijaj¹cej dysfunkcji tr¹bki s³uchowej wskutek obrzêku b³ony œluzowej i nadmiaru wydzieliny. Wysiêkowe zapalenie ucha œrodkowego czêsto rozwija siê w nastêpstwie ostrego zapalenia ucha œrodkowego wywo³anego przez Gram-ujemne i Gramdodatnie bakterie, g³ównie Haemophilus influnzae , Streptococcus pneumoniae i Moraxella catarrhalis . Powy¿sze obserwacje sugeruj¹, ¿e OME ma etiologiê zakaŸn¹, jednak¿e hodowle aspiratów ucha œrodkowego s¹ pozytywne tylko w 20-40% przypadków tej choroby. Wiêkszoœæ wysiêków w OME pozostaje bakteryjnie negatywna, oporna na leczenie antybiotykami, lecz podatna na wiele zapalnych czynników poœrednicz¹cych. Przewlek³e zapalenie ucha œrodkowego z wysiêkiem przez d³ugi czas by³o uwa¿ne za sterylny proces zapalny. Zastosowanie technologii diagnostyki molekularnej sugeruje obecnoœæ ¿ywych bakterii tworz¹cych kompleksowe zbiorowoœci znane jako biofilmy œluzówkowe. Gromadzenie siê bakterii w biofilmie jest interesuj¹c¹ hipotez¹ spo³ecznoœci bakterii, w której organizmy te przywieraj¹ do powierzchni lub do siebie nawzajem, co w nastêpstwie prowadzi do ich zredukowanej aktywnoœci metabolicznej oraz wy¿szej odpornoœci na antybiotyki. Badania eksperymentalne dostarczaj¹ dowodów sugeruj¹cych, ¿e formacja biofilmu mo¿e byæ wa¿nym czynnikiem w patogenezie OME.. Acute otitis media with effusion (OME) most often results from temporal disfunction of the Eustachian tube due to oedema of mucous membrane and excess of secretion. OME is often a consequence of acute otitis media caused by Gram-negative and Gram-positive bacteria, mainly Haemophilus influnzae, Streptococcus pneumoniae i Moraxella catarrhalis . This suggests that the etiology of OME is infectious, however bacterial cultures from a middle ear effusion are positive only in 20-40% of cases. The majority of middle ear effusions in cases of OME remain culture-negative, resistant to antibiotics, but susceptible to many inflammatory mediators. Chronic otitis media with effusion has been considered for a long time as a sterile inflammatory process. However, the use of molecular diagnostic techniques suggests the presence of live bacteria forming communities known as mucosal biofilms. A biofilm is a community in which bacteria adhere to a surface or to each other, resulting in reduced metabolism and higher resistance to antibiotics. Some experimental results prove that biofilm formation may be a crucial factor in the pathogenesis of OME. Key words: biofilm, otitis media with effusion, bacterial culture, PCR. S³owa kluczowe: biofilm, wysiêkowe zapalenie ucha œrodkowego, hodowla bakteryjna, PCR. Nades³ano: 10.03.2006 Oddano do druku: 19.07.2006. Adres do korespondencji / Address for correspondence Artur Niedzielski Katedra i Klinika Otolaryngologii Dzieciêcej, Foniatrii i Audiologii AM, 20-093 Lublin, ul. Witolda ChodŸki 2 tel/fax:+48 81 7416173; e-mail: ped-orl@dsk.lublin.pl. Przewlek³e wysiêkowe zapalenie ucha œrodkowego (otitis media with effusion – OME) jest definiowane jako obecnoœæ p³ynu w uchu œrodkowym bez objawów ostrej infekcji ucha. G³ównym objawem chorobowym jest niedos³uch przewodzeniowy, który mo¿e byæ przyczyn¹ opóŸnionego rozwoju mowy w populacji dzieciêcej. W z³o¿onej patogenezie tego schorzenia uwzglêdnia siê wiele czynników, czêsto wzajemnie nak³adaj¹cych siê. Ostre wysiêkowe zapalenie ucha œrodkowego najczêœciej towarzyszy przemijaj¹cej dysfunkcji tr¹bki.

(2) 104. s³uchowej bêd¹cej skutkiem obrzêku b³ony œluzowej i nadmiaru wydzieliny. Nieodwracalne zmiany, np. zwê¿enie tr¹bki s³uchowej powoduj¹ przewlek³e lub nawracaj¹ce zapalenia ucha œrodkowego. Oprócz dysfunkcji tr¹bki s³uchowej istotn¹ rolê w patogenezie OME odgrywa równie¿ dyfuzja gazów w obrêbie wyœcielaj¹cych ucho œrodkowe tkanek, unaczynienie i pneumatyzacja wyrostka sutkowatego. Rola bakterii w patogenezie OME Analizuj¹c problem udzia³u drobnoustrojów w powstaniu OME, które jest czêsto nastêpstwem ostrego zapalenia ucha œrodkowego, brane s¹ pod uwagê wyniki hodowli i ocen z zastosowaniem technik PCR oraz mo¿liwoœci infekcji wywo³anej przez specyficzne formy-L bakterii lub wzrost bakterii w postaci biofilmu. Najczêœciej izolowanymi drobnoustrojami z ucha œrodkowego metod¹ hodowli s¹ Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae i Moraxella catarrhalis, rzadziej izolowane s¹ Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus lub stwierdzane s¹ zaka¿enia mieszane. Wyniki, podobnie jak w zaka¿eniach nosogard³a, s¹ zbli¿one zarówno w badaniach populacji dzieci z Polski jak i innych krajów [1-4]. Powy¿sze obserwacje sugeruj¹, ¿e OME ma etiologiê zakaŸn¹, jednak¿e hodowle aspiratów ucha œrodkowego s¹ pozytywne tylko w 20-40% przypadków OME [4].Wiêkszoœæ wysiêków w OME pozostaje bakteryjnie negatywna, oporna na leczenie antybiotykami, aczkolwiek równoczeœnie stwierdza siê podwy¿szone stê¿enia cytokin prozapalnych IL-1, TNF-α, IL-8, IFN-γ i innych wskaŸników aktywacji miejscowego odczynu zapalnego [5, 6, 7]. Bior¹c pod uwagê, ¿e przyczyn¹ negatywnych wyników w hodowli mo¿e byæ zbyt ma³a liczba bakterii w p³ynie wysiêkowym lub obecnoœæ form L, które nie wzrastaj¹ na pod³o¿ach hodowlanych, czy te¿ obecnoœæ bakterii wolno namna¿aj¹cych siê lub o wyj¹tkowych wymaganiach wzrostowych, przeprowadzono liczne badania z zastosowaniem metod molekularnych [8]. Przeprowadzone badania przy u¿yciu reakcji ³añcuchowej polimerazy (PCR) wykaza³y obecnoœæ bakteryjnego DNA w wysiêku w ponad 80%, co zaprzecza hipotezie, ¿e wysiêk w OME to wysiêk sterylny [9, 10]. Jednoznacznoœæ wyników PCR poddawano jednak pod w¹tpliwoœæ, jako ¿e wykrycie pojedynczych genów mo¿e byæ wynikiem obecnoœci jedynie przetrwa³ych fragmentów DNA lub „skamienia³ymi pozosta³oœciami bakterii”, jak stwierdzi³ Cantekin [11]. Z³o¿one relacje zachodz¹ce w uchu œrodkowym pomiêdzy patogenem a gospodarzem mog¹ byæ równie¿ przyczyn¹ ujemnych wyników uzyskanych w tradycyjnej metodzie hodowlanej. Jedna z nich dotyczy mo¿liwoœci powstania szczególnych form bakterii L. Te warianty bakteryjne trac¹ zdolnoœæ do syntetyzowania warstwy peptydoglikanowej nowej œciany komórkowej, przez. Otorynolaryngologia, 2006, 5(3), 103-106. co zmieniaj¹ nie tylko swój oryginalny kszta³t, ale staj¹ siê odporne na antybiotyki beta-laktamowe oraz wymagaj¹ szczególnych warunków do hodowli [12]. Wzrost bakterii w postaci biofilmu Rozwijana w ci¹gu ostatnich lat hipoteza, która mog³aby wyjaœniæ nietypowe zachowanie siê wskaŸników infekcji podczas wysiêkowego zapalenia ucha œrodkowego, wskazuje na wzrost drobnoustrojów w specyficznych wielowarstwowych zespo³ach zwanych biofilmem. Bakterie wykazuj¹ wówczas inne w³aœciwoœci ni¿ drobnoustroje wzrastaj¹ce planktonicznie. Tworz¹ one bakteryjne spo³ecznoœci, w których drobnoustroje przywieraj¹ do powierzchni za pomoc¹ fimbrii lub nawzajem do siebie. Otoczone s¹ wydzielan¹ substancj¹ polisacharydow¹ typu matriks, wykazuj¹ zredukowan¹ aktywnoœæ metaboliczn¹, co miêdzy innymi skutkuje wy¿sz¹ opornoœci¹ na czynniki antybakteryjne i ujemnymi wynikami posiewów p³ynu wysiêkowego. Wzrost bakterii w postaci biofilmu, lub pozbawionych œciany komórkowej form L bakterii mo¿e byæ spowodowany terapi¹ antybiotykow¹ lub immunologiczn¹ reakcj¹ gospodarza. Dodatkowo, formy L bakterii lub mikroorganizmy w biofilmie charakteryzuj¹ siê mniejsz¹ aktywnoœci¹ metaboliczn¹ i reprodukcyjn¹ w porównaniu z bakteriami planktonowymi. Uwa¿ane s¹ za czêœciowo odpowiedzialne za przewlek³e zapalenie i przed³u¿aj¹ce siê wysiêki w uchu œrodkowym u dzieci. Bakterie rozwijaj¹ce siê jako biofilm reprezentuj¹ odmienny fenotyp ni¿ wolno ¿yj¹ce bakterie, posiadaj¹ one nie tylko znacznie zredukowan¹ aktywnoœæ metaboliczn¹, co czyni je niemal ca³kowicie niepodatnymi na leczenie przeciwbakteryjne, ale równie¿ wytwarzana na zewn¹trz biofilmu egzopolisacharydowa matriks chroni je przed fagocytoz¹ oraz innymi mechanizmami obronnymi gospodarza. Obni¿ona aktywnoœæ metaboliczna oraz czêstotliwoœæ podzia³u bakterii w biofilmie w du¿ym stopniu wyjaœniaj¹ nieskutecznoœæ antybiotyków podczas leczenia infekcji u pacjentów. Leczenie za pomoc¹ antybiotyków niszczy bakterie na peryferiach, natomiast g³êboko po³o¿one organizmy pozostaj¹ i dzia³aj¹ na zasadzie gniazda warunkuj¹cego ponowny rozwój oraz wzrost, a tak¿e periodyczny rozsiew planktoniczny, który mo¿e byæ przyczyn¹ przewlek³ego stanu zapalnego i infekcji uk³adowych. Powy¿szy charakter biofilmu móg³by wyjaœniaæ dlaczego antybiotyki nie s¹ skuteczne w leczeniu OME. Hipoteza biofilmu jest tak¿e spójna z obserwacj¹, ¿e najefektywniejszym leczeniem wysiêkowego zapalenia ucha jest umieszczanie tubek wentylacyjnych przez b³onê bêbenkow¹. Procedura ta pozwala na „by-pass” przep³ywu powietrza przez dysfunkcyjn¹ tr¹bkê Eustachiusza, pozwalaj¹c na wentylacjê przestrzeni ucha œrodkowego. Niskowentylowane ucho œrodkowe jest idealnym œrodowiskiem dla formowania siê biofilmu, jako ¿e wczeœniejsza infekcja wirusowa i utrzymuj¹ce siê niedotlenienie.

(3) Niedzielski A, Kozio³-Montewka M, Niedzielska G i wsp.: Rola biofilmu bakteryjnego w patogenezie wysiêkowego zapalenia …. narz¹du mog³y zaburzyæ mechanizmy obronne. Prawid³owa b³ona œluzowa ucha œrodkowego sk³ada siê z komórek nab³onkowych urzêsionych, bior¹cych udzia³ w usuwaniu bakterii. Zosta³o udowodnione, ¿e nab³onek w OME jest prawie ca³kowicie pozbawiony rzêsek, a iloœæ komórek wydzielniczych zwiêksza siê. Umieszczenie tubek wentylacyjnych jest efektywne w leczeniu OME dziêki rewentylacji przestrzeni ucha œrodkowego oraz zwiêkszenie natê¿enia tlenu, które potencjalnie zmienia fenotyp biofilmu. Odessanie wysiêku po myryngotomii rozrywa i zmniejsza biofilm. Rewentylacja, wskutek dotlenienia, przywraca mechanizmy obronne b³ony œluzowej ucha œrodkowego, u³atwia odrost nab³onka rzêskowego i redukuje iloœæ komórek wydzielniczych. Myryngotomia z aspiracj¹ p³ynu oraz za³o¿enie tubki wentylacyjnej jest œwietnym sposobem na gromadzenie materia³u do monitoringu mikrobiologicznego wysiêkowego zapalenia ucha œrodkowego, który okreœli³by lokalne trendy opornoœci na pewne antybiotyki. Chocia¿ OME jest czêsto i z powodzeniem leczone za pomoc¹ chirurgicznie zak³adanych tubek wentylacyjnych, niekiedy zabieg ten jest powi¹zany z niepowodzeniem. Badania Post’a wykaza³y, ¿e u 17% dzieci jakoœæ ¿ycia po obustronnym za³o¿eniu tubek zmieni³a siê nieznacznie, a u 4% znacznie obni¿y³a siê, g³ównie z powodu utrzymuj¹cego siê wysiêku [8]. Literatura przedmiotu wykazuje, ¿e bakterie, poprzez mechanizmy adhezji, przywieraj¹ do ró¿norodnych implantów, co mo¿e staæ siê Ÿród³em przewlek³ej infekcji. Kilka prac prezentuje formacjê biofilmów na tubkach wentylacyjnych. Z tego powodu klinicyœci nie s¹ w pe³ni zadowoleni z istniej¹cych terapii i poszukuj¹ ulepszonych metod leczenia opartych na naukowym zrozumieniu problemu. Sugestie okreœlaj¹ce obecnoœæ sterylnych procesów zapalnych powoduj¹cych OME wydaj¹ siê byæ nieaktualne, a stwierdzana obecnoœæ endotoksyn i zapalnych cytokin mo¿e byæ wynikiem aktywnego procesu zapalnego, za który odpowiedzialne mog¹ byæ drobnoustroje wzrastaj¹ce w postaci biofilmu. Potwierdzeniem hipotezy, ¿e skupiska bakteryjne zwane biofilmami s¹ odpowiedzialne za utrzymywanie siê wysiêku w uchu œrodkowym, by³y badania doœwiadczalne Post’a na hodowli szynszyli. Autor potwierdzi³ obecnoœæ biofilmu za pomoc¹ mikroskopu elektronowego po wprowadzeniu transtympanalnym H. influenzae. Koncepcja biofilmu mo¿e pomóc w rozwi¹zaniu w¹tpliwoœci zwi¹zanych z patogenez¹ i leczeniem OME. Mo¿e dostarczyæ odpowiedzi na pytanie, dlaczego wyniki hodowli s¹ ujemne, gdy preparaty barwione metod¹ Grama, badania na. 105. obecnoœæ endotoksyny oraz neuraminidazy, a tak¿e diagnostyka molekularna wykazuj¹ obecnoœæ bakterii w „sterylnych” wysiêkach? Dlaczego mimo stwierdzanej obecnoœci bakterii w leczeniu zawodz¹ antybiotyki? W jaki sposób wysiêk utrzymuje siê przez d³ugi czas w przypadku braku ¿ywych bakterii? Bakterie biofilmu s¹ trudne do wyhodowania metod¹ planktoniczn¹, s¹ oporne na leczenie antybiotykami i stanowi¹ preferencyjny fenotyp o znamionach niebolesnej, d³ugofalowej obecnoœci. Biofilmy w nosowej czêœci gard³a oraz w innych odcinkach drogi oddechowo-pokarmowej mog¹ powodowaæ nawracaj¹ce zaostrzenia zapalenia ucha œrodkowego. Badania kliniczne wykaza³y, ¿e wyciêcie migda³ka gard³owego przynosi efekty w leczeniu ostrego zapalenia ucha, co mo¿e wi¹zaæ siê z faktem eliminacji biofilmu. Perspektywy terapii Bior¹c pod uwagê, ¿e drobnoustroje w strukturach biofilmu s¹ zdolne do porozumiewania siê za pomoc¹ okreœlonych sygna³ów okreœlaj¹cych ich liczebnoœæ „quorum sensing”, aktywacji genów odpowiedzialnych za wirulencjê i reguluj¹ koordynacjê procesów ¿yciowych w wytworzonych strukturach biofilmu, rozwa¿ane s¹ ca³kiem inne mo¿liwoœci terapeutyczne. Cz¹stkami sygnalizacyjnymi w systemie „quorum sensing” s¹ laktony N-acetyl-homoseryny (AHLs). Ca³kowity system sygnalizacyjny zawiera cz¹stki AHL, syntetazê cz¹stek sygnalizacyjnych typu LuxI, receptory dla odbioru sygna³u LuxR i geny docelowe [13]. Stê¿enie tych sygnalizacyjnych cz¹stek pozwalaj¹cych na wzajemne porozumiewanie siê „cross-talk” drobnoustrojów w wytworzonej spo³ecznoœci, odzwierciedla gêstoœæ bakteryjnej populacji na okreœlonej przestrzeni oraz indukuje, poprzez wewn¹trzkomórkowy system sygnalizacji, ekspresjê ró¿norodnych genów reguluj¹cych procesy metaboliczne, jak i wirulencje bakterii. Poznanie systemu cz¹stek sygnalizacyjnych pozwoli w przysz³oœci stworzyæ nowe strategie w dzia³aniu antybakteryjnym; by³yby to inhibitory syntezy AHL, czynniki hamuj¹ce rozprzestrzenianie siê sygna³u AHL i zahamowanie odbierania sygna³u przez blokadê odpowiednich receptorów. Poznanie molekularnych procesów miêdzykomórkowego systemu sygnalizacyjnego w biofilmie daje szanse na alternatywne leczenie antybakteryjne nie tylko w przypadku wysiêkowego zapalenia ucha œrodkowego, lecz równie¿ wielu innych postaci zaka¿eñ o charakterze biofilmu. Ma to szczególne znaczenie w okresie narastaj¹cej opornoœci bakterii na antybiotyki i rozprzestrzenianiu siê szczepów wieloopornych..

(4) 106. Otorynolaryngologia, 2006, 5(3), 103-106. Piœmiennictwo 1. Radzikowski A, Dobkowska M, Bochenek K i wsp. Bakteryjne zapalenie ucha œrodkowego u dzieci w latach 1995-98. Nowa Pediatr 1999; 3(4): 9-11. 2. Wê¿yk MT, Ma³afiej E, Makowski A, Woch G. Bakteriologiczna ocena p³ynu z ucha œrodkowego w przebiegu OMS u dzieci. Otolaryngol Pol 2000; 54(5): 541-546. 3. Zielnik-Jurkiewicz B, Kolczyñska M. Flora bakteryjna w nawracaj¹cym ostrym zapaleniu ucha œrodkowego u dzieci. Pol Merk Lek 2005; 18(104): 146-150. 4. Dingman JR, Rayner MG, Mishra S, Zhang Y, Ehrlich MD, Post JC, Ehrlich GD. Correlation between presence of viable bacteria and presence of endotoxin in middle-ear effusions. J Clin Microbiol 1998; 36(11): 3417-3419. 5. Yellon RF, Doyle WJ, Whiteside TL, Diven WF, March AR, Fireman P. Cytokines, immunoglobulins, and bacterial pathogens in middle ear effusions. Arch Otolaryngol Head Neck Surg., 1995; 121: 865-869. 6. Maxwell K, Leonard G, Kreutzer DL. Cytokine expression in otitis media with effusion. Tumor necrosis factor soluble receptor. Arch Orolaryngol Head Neck Surg 1997; 123: 984-988.. 7. Himi T, Suzuki T, Kodama H, Takezawa H, Kataura A. Immunologic characteristics of cytokines in otitis media with effusion. Ann Otol Rhinol Laryngol 1992; 101: 21-25. 8. Post Ch. Direct evidence of bacterial biofilms in otitis media. Laryngoscope 2001; 111: 2083-2094. 9. Post JC, Preston RA, Aul JJ, Larkins-Pettigrew M, RydquistWhite J, Anderson KW i wsp. Molecular analysis of bacterial pathogens in otitis media with effusion. JAMA 1995; 273: 15981604. 10. Post JC, White GJ, Aul JJ, Zavoral T, Wadowsky RM, Zhang Y, Preston RA, Ehrlich GD. Development and validation of a multiplex PCR-based assay for the upper respiratory tract bacterial pathogens Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, and Moraxella catarrhalis. Mol Diagn 1996; 1: 29-39. 11. Cantekin EI. Bacterial DNA fragments in otitis media with effusion. JAMA 1996; 275(3): 186. 12. Pereira MB, Pereira MR, Cantarelli V, Costa SS. Prevalence of bacteria in children with otitis media with effusion. J Pediatr (Rio J) 2004; 80(1): 41-48. 13. Hentzer M, Giskov M. Pharmacological inhibition of quorum sensing from the treatment of chronic bacterial infections. J Clin Invest 2003; 112: 1300-1307..

(5)