Acta Scientiarum Polonorum. Biotechnologia 2, 2008

(1)

ACTA SCIE

Czasopismo naukowe za

Bydg

Pozna

Ĕ Si

ENTIARUM POLONORUM

ało

Īone w 2001 roku przez polskie uczelnie rolnicz

Biotechnologia

7(2) 2008

goszcz Kraków Lublin Olsztyn

iedlce Szczecin Warszawa Wrocław

(2)

Rada Programowa Acta Scientiarum Polonorum

Kazimierz Banasik (Warszawa), Janusz Falkowski (Olsztyn),

Florian GambuĞ (Kraków), Franciszek Kluza (Lublin), Edward NiedĨwiecki (Szczecin), Janusz PrusiĔski (Bydgoszcz), Jerzy Sobota (Wrocław) – przewodniczący,

Stanisław Socha (Siedlce), Waldemar Uchman (PoznaĔ) Rada Naukowa serii Biotechnologia

Danuta Witkowska (Wrocław) – przewodnicząca, Włodzimierz Bednarski (Olsztyn), Włodzimierz Grajek (PoznaĔ), Anna Maraz (Budapeszt, WĊgry),

Zdzisław TargoĔski (Lublin), Vesna Zechner-Krpan (Zagrzeb, Chorwacja)

Korekta: Janina Szydłowska mgr ElĪbieta Winiarska-Grabosz Łamanie Halina Sebzda Projekt okładki Daniel MorzyĔski ISSN 1644–065X

Wydanie publikacji dofinansowane ze Ğrodków Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu

Redaktor Naczelny – prof. dr hab. Andrzej Kotecki ul. Sopocka 23, 50–344 Wrocław, tel./fax (71) 328–12–77

e-mail: wyd@up.wroc.pl http://www.up.wroc.pl Nakład 200 + 16 egz. Ark. druk. 2,75 Druk i oprawa: Wydawnictwo Tekst Sp. z o.o.

(3)

Acta S

BIOSYNTEZA KWA

Z PORAFINACYJNY

PRZEZ ASPERGILL

PÓŁCI

ĄGŁYCH*

Izabela Musiał, Walde

Uniwersytet Przyrodniczy

Streszczenie. Celem pracy j

dynamikĊ i wydajnoĞü proc sów tłuszczowych przez szc Īonego pH do 4,0. StĊĪenie biomasy, stĊĪenie kwasu sz cyklach hodowlanych hodo zróĪnicowany i wynosiło o i 1,5 gdm-3 NH4NO3. Najw

w hodowli zawierającej w p dajnoĞü 1,97 gg-1 osiągniĊto ObjĊtoĞciowa szybkoĞü prod od 1,8 do 6,78 gdm-3d-1.

Słowa kluczowe: kwas szcz

WPROWADZENIE WłaĞciwoĞci redukujące wany w przemyĞle, głównie m z minerałów oraz rud [Ambi i in. 1994]. Kwas szczawiow jego syntezy najczĊĞciej sto ogrzewania powstają odpowi siarkowego. Kwas szczawiow dów (głównie celulozy) za po

*Badania realizowane w ramac KBN w latach 2004–2006. Adres do korespondencji – C i Mikrobiologii ĩywnoĞci, Uni 50–375 Wrocław, e-mail: Izabel

Sci. Pol., Biotechnologia 7(2) 2008, 3-11

ASU SZCZAWIOWEGO

YCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH

LUS NIGER W HODOWLACH

emar Rymowicz, Danuta Witkowska

we Wrocławiu

1

jest ocena wpływu stĊĪenia N i P w podłoĪu hodowlanym na cesu produkcji kwasu szczawiowego z porafinacyjnych kwa-zep A. niger XP w hodowlach półciągłych w warunkach obni e N i P w podłoĪu hodowlanym miało wpływ na koncentracjĊ zczawiowego i wydajnoĞü kwasu szczawiowego w kolejnych owli półciągłej. StĊĪenie biomasy kształtowało siĊ w sposób od 6,5 do 30,5 gdm-3, gdy w podłoĪu było odpowiednio 0,5 wyĪsze stĊĪenie kwasu szczawiowego (56,2 gdm-3) uzyskano

odłoĪu 1 gdm-3 NH4NO3 i 0,5 gdm -3

KH2PO4. NajwyĪszą

wy-w cyklu 1 hodowy-wli wy-w podłoĪu zawierającym 0,5 g/l NH4NO3

dukcji kwasu szczawiowego wahała siĊ w szerokich granicach

zawiowy, Aspergillus niger, hodowle półciągłe

kwasu szczawiowego sprawiają, Īe jest on szeroko sto metalurgicznym, jako czynnik ługujący tlenki metali ciĊĪk ikadevi i Lalithambika 2000, Mulligan i in. 2004, Stra wy produkowany jest obecnie metodami chemicznymi, a osuje siĊ sole kwasu mrówkowego, z których w wyn iednie tlenki, znajdujące siĊ z kolei pod wpływem kw wy moĪe równieĪ powstaü w reakcji utleniania polisach omocą kwasu azotowego [Ambikadevi i Lalithambika 200

ch projektu badawczego nr 2PO6T 11326 finansowanego p

Corresponding author: Izabela Musiał, Katedra Biotechno iwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, ul. C.K. Norwida 25 la.Musial@wnoz.up.wroc.pl a -Ċ h b 5 o -. h oso-kich asser a do niku wasu hary-00]. przez ologii 5/27,

(4)

I. Musiał i in.

Acta Sci. Pol.

4

W celu obniĪenia kosztów produkcji i ochrony Ğrodowiska naturalnego szuka siĊ no-wych dróg otrzymywania kwasu szczawiowego. DuĪe zainteresowanie wzbudzają me-tody biotechnologiczne. Jednym z najbardziej efektywnych producentów kwasu szcza-wiowego są grzyby z gatunku Aspergillus niger [Guru i in. 2001]. Biosynteza kwasu szczawiowego przez grzyby A. niger zaleĪy od odczynu Ğrodowiska hodowlanego i w podłoĪach zawierających cukry jako Ĩródło wĊgla zachodzi najintensywniej w od-czynie bliskim neutralnemu. W takich warunkach dochodzi do indukcji hydrolazy szczawiooctanowej, która rozkłada szczawiooctan do kwasu szczawiowego i octowego [Kubicek i in 1988]. W pH kwaĞnym głównym produktem metabolizmu A. niger jest kwas cytrynowy [Leangon i in. 1999, Santoro i in. 1999]. W naszych wczeĞniejszych badaniach stwierdzono, Īe niektóre szczepy A. niger produkują duĪe iloĞci kwasu szczawiowego z substratów tłuszczowych w pH w zakresie 4–5 [Musiał i in. 2005, Musiał i in. 2006, Rymowicz i Lenart 2003, Rymowicz i Lenart 2004A, Rymowicz i Lenart 2004B]. W wiĊkszoĞci prac poĞwiĊconych biosyntezie kwasu szczawiowego surowcem do jego produkcji są wĊglowodany, takie jak sacharoza, glukoza, laktoza oraz wĊglowodanowe surowce odpadowe z przemysłu spoĪywczego i z rolnictwa, jak melasa buraczana, serwatka czy słodkie ziemniaki [Guru i in. 2001, Leangon i in. 1999, Santoro i in. 1999, Strasser i in. 1994]. Główny problem przy produkcji kwasu szcza-wiowego z uĪyciem sacharozy i glukozy polega na tym, Īe duĪa czĊĞü uĪytego cukru zostaje zamieniona w kwas glukonowy, który jest niepoĪądanym produktem ubocznym [Cameselle i in. 1998, Santoro i in. 1999]. Dobrym Ĩródłem wĊgla do produkcji kwasu szczawiowego okazała siĊ laktoza, z której A. niger produkował tylko kwas szczawiowy w przeciwieĔstwie do procesu z uĪyciem sacharozy, gdzie syntetyzowany był zarówno kwas glukonowy, jak i cytrynowy, co powodowało obniĪenie wydajnoĞci procesu do 0,3 gg-1. W procesach fermentacji laktozy kwas szczawiowy stanowił jedyny produkt fermentacji, przez co wydajnoĞü kwasu szczawiowego była dwukrotnie wiĊksza w po-równaniu z sacharozą [Bohlmann i in. 1998, Santoro i in. 1999]. NajwyĪsze iloĞci kwa-su szczawiowego uzyskiwano w hodowlach z kwa-substratów lipidowych. W procesach na oleju rzepakowym grzyby A. niger XP, w ciągu 7-dobowych hodowli wgłĊbnych, pro-dukowały wysokie iloĞci kwasu szczawiowego dochodzące do 68 gdm-3

. Ponadto, pro-ces taki charakteryzował siĊ wysoką homogennoĞcią, a produktywnoĞü i wydajnoĞü kwasu szczawiowego z substratów tłuszczowych była znacznie wyĪsza w porównaniu do procesów prowadzonych w podłoĪach z dodatkiem sacharydów i z udziałem innych szczepów produkcyjnych A. niger [Rymowicz i Lenart 2003]. Bohlman i wsp. [1998] wykazali, Īe obecnoĞü 25 g/l kwasu szczawiowego w początkowej fazie procesu bio-syntezy tego kwasu z serwatki – obniĪała produktywnoĞü kwasu o 50%, zaĞ 45 g/l w podłoĪu całkowicie hamowało proces. Wysokie stĊĪenia kwasu szczawiowego w podłoĪu produkcyjnym zawierającym lipidy nie powodują inhibicji biosyntezy tego kwasu [Rymowicz i Lenart 2003, Rymowicz i Lenart 2004A, Rymowicz i Lenart 2004B]. Wszystkie opisane dotychczas badania procesu biosyntezy kwasu szczawiowe-go z substratów tłuszczowych dotyczą procesów okresowych [Musiał i in. 2005, Musiał i in. 2006, Rymowicz i Lenart 2003, Rymowicz i Lenart 2004A, Rymowicz i Lenart 2004B]. Dlatego podjĊto próbĊ opracowania przyjaznej Ğrodowisku technologii produk-cji kwasu szczawiowego w hodowli półciągłej, ograniczającej zuĪycie wody i tym samym iloĞci powstających Ğcieków.

(5)

Biosynteza kwasu szczawiowego ...

Biotechnologia 7(2) 2008

5 Celem niniejszej pracy jest ocena wpływu stĊĪenia azotu i fosforu na dynamikĊ oraz wydajnoĞü procesu biosyntezy kwasu szczawiowego przez szczep A. niger XP z porafi-nacyjnych kwasów tłuszczowych w hodowlach półciągłych.

MATERIAŁ I METODY BADAē

Mikroorganizmy. W badaniach wykorzystano szczep A. niger XP – mutant UV, który pochodził z kolekcji Akademii Ekonomicznej we Wrocławiu. Szczep przecho-wywano na skosach ziemniaczanych w temp. 4°C.

PodłoĪa hodowlane. PodłoĪe inokulacyjne zawierało (gdm-3): porafinacyjne kwasy tłuszczowe [produkt odpadowy przemysłu tłuszczowego zawierający % (w/w) wolne kwasy tłuszczowe: 9,4 C16:0, 3,3 C18:0, 48,1 C18:1, 31,2 C18:2, 5,3 C18:3, 0,8 C20:1, 0,8 C22:1] – 30; KH2PO4 – 2; NH4NO3 – 1; MgSO4⋅ 7H2O – 0,3; metanol 15; wodĊ wodociągową 1 dm3. PodłoĪe do produkcji kwasu szczawiowego zawierało (gdm-3): porafinacyjne kwasy tłuszczowe – 30; KH2PO4 – od 0,25 do 0,75; NH4NO3 – od 0,5 do 1,5; MgSO4⋅ 7H2O – 0,3; FeSO4 · 7H2O – 0,248; MnSO4 · 7H2O – 0,038; Span 20 – 0,75; wodĊ destylowaną 1 dm3

.

Techniki hodowlane. PodłoĪe inokulacyjne szczepiono zawiesiną zarodników spo-rządzoną w 0,9% NaCl zawierającym 0,1% Tween 80, tak aby w 1 cm3podłoĪa było ok. 106 zarodników.

Hodowle inokulacyjne prowadzono przez 3 doby w kolbach stoĪkowych o objĊtoĞci 300 cm3, zawierających 50 cm3 podłoĪa inokulacyjnego, na wstrząsarce typu G-10 firmy New Brunswick, w temp. 30oC i przy szybkoĞci mieszania 160 rpm. Tak przygo-towanym inokulum szczepiono podłoĪa produkcyjne w bioreaktorze. Hodowle produk-cyjne prowadzono w 5-litrowym bioreaktorze typu BIOFLO III firmy New Brunswick, zawierającym 2,5 dm3_{podłoĪa produkcyjnego, przy szybkoĞci mieszania 500 rpm,} szybkoĞci napowietrzania 1 vvm i pH 4,0, utrzymywanym automatycznie za pomocą 40% KOH.

Po zakoĔczeniu hodowli stacjonarnej (cykl 1) odbierano 1,0 dm3_{podłoĪa wraz} z komórkami grzybni i uzupełniono taką samą objĊtoĞcią ĞwieĪego podłoĪa. W ten sposób przeprowadzono trzy nastĊpne cykle hodowlane (cykl 2., 3. i 4.).

Metody analityczne. BiomasĊ oznaczano wagowo. Porafinacyjne kwasy tłuszczowe oznaczano wagowo, w tym celu 10 cm3zawiesiny komórek poddawano dwukrotnej ekstrakcji eterem naftowym, wirowano (5 min, 4000 rpm) i frakcjĊ eterową zawierającą kwasy tłuszczowe przenoszono do naczyniek wagowych. Po odparowaniu eteru nafto-wego w temp. 50°C, naczyĔka dosuszano w wagosuszarce w temp. 105°C. Kwasy or-ganiczne (kwas szczawiowy, cytrynowy) oznaczano techniką HPLC na kolumnie Ami-nex HPX87H, połączonej z detektorem UV, przy długoĞci fali 210 nm. SzybkoĞü prze-pływu fazy ciekłej (20 mM H2SO4) przez kolumnĊ wynosiła 0,6 cm3min-1. Oznaczenia prowadzono w temperaturze pokojowej.

WYNIKI I DYSKUSJA

Przeprowadzono trzy półciągłe procesy produkcji kwasu szczawiowego z porafina-cyjnych kwasów tłuszczowych przez szczep A. niger XP. W celu zwiĊkszenia iloĞci biomasy pleĞni A. niger XP w kolejnych hodowlach dodawano zróĪnicowane iloĞci

(6)

I. Musiał i in.

Acta Sci. Pol.

6

Ĩródła azotu i fosforu w podłoĪu hodowlanym, odpowiednio: w pierwszej hodowli 0,5 gdm-3 NH4NO3 i 0,25 gdm-3 KH2PO4; w drugiej hodowli 1,0 gdm-3 NH4NO3 i 0,5 gdm-3 KH2PO4 i w trzeciej hodowli 1,5 gdm-3 NH4NO3 i 0,75 gdm-3 KH2PO4. Kwasy tłuszczowe dodawano w dwóch porcjach: na początku hodowli 15 g/l oraz po 24 h hodowli równieĪ 15 g/l. Pierwsza hodowla trwała 28 dni, co siedem dni wymieniano litr podłoĪa. Druga i trzecia trwały po 17 dni, w tym cykl 1. trwał 5 dób, a w trzech kolejnych cyklach podłoĪe wymieniano co 4 doby.

JednoczeĞnie ze wzrostem stĊĪenia N i P w podłoĪu hodowlanym wzrastała iloĞü biomasy w zakresie od 6,5 do 30,5 gdm-3(rys. 1). TakĪe koncentracja biomasy w kolej-nych cyklach półciągłej hodowli była zróĪnicowana i wahała siĊ w wariancie A od 6,5 do 9,7 gdm-3, od 18,0 do 20,3 gdm-3 w wariancie B i w wariancie C od 20,7 do 30,5 gdm-3. A B 0 10 20 30 40 50 60 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 X, PKT, O A , C A [gdm -1 ]

X biomass PKT post-rafining fatty acids

OA oxalic acid CA citric acid

0 10 20 30 40 50 60 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 X, PK T , OA , C A [ g d m -1 ]

(7)

7 C

Rys. 1. Przebieg procesu biosyntezy kwasu szczawiowego przez szczep A. niger XP w hodow-lach półciągłych w podłoĪu zawierającym 30 gdm-3 porafinacyjnych kwasów tłuszczo-wych i (A) 0,5 gdm-3_NH

4NO3 i 0,25 gdm-3 KH2PO4, (B)1,0 gdm-3 NH4NO3 i 0,5 gdm-3

KH2PO4, (C) 1,5 gdm-3 NH4NO3 i 0,75 gdm-3 KH2PO4

Fig. 1. Course of oxalic acid biosynthesis by A. niger XP in semicontinuous culture in medium with 30 gdm-3 post-refining fatty acids and (A) 0,5 gdm-3 NH4NO3 and 0,25 gdm-3

KH2PO4, (B)1,0 gdm-3 NH4NO3 and 0,5 gdm-3 KH2PO4, (C) 1,5 gdm-3 NH4NO3 and

0,75 gdm-3 KH2PO4

Kwas szczawiowy stanowił główny produkt biosyntezy we wszystkich trzech pół-ciągłych hodowlach (rys. 1). Maksymalne stĊĪenie kwasu szczawiowego 56,2 gdm-3 uzyskano w 4. cyklu hodowlanym, w którym dodawano 1,0 gdm-3NH4NO3 i 0,5 gdm-3 KH2PO4. Rymowicz i Lenart [2003] po przeprowadzeniu siedmiodobowego okresowego procesu biosyntezy kwasu szczawiowego z wykorzystaniem surowego oleju rzepako-wego i porafinacyjnych kwasów tłuszczowych, w pH = 4,0 i stĊĪeniu substratu tłusz-czowego 50 gdm-3, uzyskali stĊĪenie kwasu szczawiowego 68,1 g/dm-3. Natomiast pod-czas zmiany pH do 5,0 nastąpiło niewielkie obniĪenie iloĞci szczawianu do 66,1 gdm-3

. W badaniach własnych szybkoĞü objĊtoĞciowa produkcji kwasu szczawiowego zmniejszała siĊ w kolejnych cyklach pierwszej hodowli, a w dwóch pozostałych hodow-lach obniĪała siĊ od 3 cyklu produkcyjnego (tab. 1). Wahała siĊ w szerokich granicach od 1,8 do 7,0 gdm-3d-1. Według Rymowicza i Lenart [2003] produktywnoĞü kwasu szczawiowego z surowego oleju rzepakowego i porafinacyjnych kwasów tłuszczowych w hodowlach okresowych liczyła odpowiednio: 9,4 i 9,6 gdm-3d-1. W hodowlach okre-sowych prowadzonych w podłoĪach z wĊglowodanami szybkoĞü objĊtoĞciowa produkcji kwasu szczawiowego równieĪ była wyĪsza i wynosiła od 3,9 do 9,0 gdm-3

d-1 [Bohl-mann i in. 1998, Cameselle i in. 1998, Strasser i in. 1994].

Poprzednie nasze badania wykazały, Īe zastosowanie substratów tłuszczowych do produkcji kwasu szczawiowego pozwala na uzyskanie wysokiej czystoĞci procesu [Mu-siał i in. 2005, Rymowicz i Lenart 2003, Rymowicz i Lenart 2004A, Rymowicz i Lenart 2004B]. NajwyĪszą czystoĞcią (100%) charakteryzował siĊ proces biosyntezy kwasu szczawiowego, gdzie zastosowano najniĪsze iloĞci azotu i fosforu (rys. 1). ZwiĊkszenie iloĞci azotu w podłoĪu produkcyjnym powodowało wzrost zawartoĞci kwasu cytryno-wego, ubocznego produktu w tym procesie, do 7 gdm-3 (rys. 1) i obniĪenie współczyn-nika selektywnoĞci do 0,93 (tab. 2).

0 10 20 30 40 50 60 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 X, PKT, O A , C A [gdm -1 ]

(8)

I. Musiał i in.

Acta Sci. Pol.

8

Tabela 1. Wpływ składu podłoĪa produkcyjnego na szybkoĞü objĊtoĞciową produkcji i szybkoĞü właĞciwą produkcji kwasu szczawiowego przez A. niger XP w kolejnych cyklach hodowli półciągłych

Table 1. Effect of the medium composition on the volumetric production rate and specific production rate of oxalic acid by A. niger XP in cycles of semicontinuous cultures

Cykl 1 Cycle 1 Cykl 2 Cycle 2 Cykl 3 Cycle 3 Cykl 4 Cycle 4 StĊĪenie NH4NO3 w podłoĪu [gdm-3_] Concentration NH4NO3 in medium [gdm-3_] QOA [gdm-3d-1] 0,5 5,80 3,70 1,90 1,80 1,0 5,78 7,00 4,64 4,00 1,5 5,50 6,78 3,92 2,74 QOA [gg-1d-1] 0,5 0,59 0,37 0,23 0,28 1,0 0,31 0,35 0,22 0,22 1,5 0,27 0,25 0,13 0,09

Tabela 2. SelektywnoĞü procesu biosyntezy kwasu szczawiowego z porafinacyjnych kwasów tłuszczowych przez A. niger XP w hodowlach półciągłych

Table 2. Selectivity of oxalic acid biosynthesis from pos-refining fatty acids by A. niger XP in semicontinuous cultures StĊĪenie NH4NO3 w podłoĪu [gdm-3_] Concentration NH4NO3 in medium [gdm-3_] (OA/(OA+CA))* Cykl 1 Cycle 1 Cykl 2 Cycle 2 Cykl 3 Cycle 3 Cykl 4 Cycle 4 0,5 1,00 1,00 1,00 1,00 1,0 1,00 0,99 0,97 0,93 1,5 1,00 0,99 0,98 0,98

* współczynnik selektywnoĞci procesu biosyntezy liczony jako stosunek stĊĪenia kwasu szczawiowego (OA) do sumy stĊĪeĔ kwasu szczawiowego i cytrynowego (CA)

factor of selectivity of oxalic acid (OA) biosynthesis as a ratio the oxalic acid concentration to the sum oxalic and citric acids(CA) concentrtions

StĊĪenie azotu i fosforu w podłoĪu hodowlanym miało istotny wpływ na wydajnoĞü kwasu szczawiowego. W zaleĪnoĞci od wariantu hodowli i cyklu hodowlanego para-metr ten był w zakresie od 0,27 do 1,36 gg-1 (tab. 3). Według Rymowicza i Lenart [2003] wydajnoĞü procesu biosyntezy kwasu szczawiowego z substratów tłuszczowych przez szczep A. niger XP w hodowlach okresowych była wyĪsza i wynosiła 1,66 gg-1

. Natomiast w porównaniu z procesami prowadzonymi w podłoĪach zawierających wĊ-glowodany wydajnoĞü procesu biosyntezy kwasu szczawiowego z kwasów tłuszczo-wych była około trzykrotnie wyĪsza. Według Bohlmann i in. [1998] oraz Santoro i in. [1999] w hodowlach prowadzonych w podłoĪu zawierającym laktozĊ wydajnoĞü kwasu szczawiowego wynosiła odpowiednio 0,54 i 0,4 gg-3.

(9)

9

Tabela 3. Wpływ składu podłoĪa na wydajnoĞü produkcji kwasu szczawiowego przez A. niger XP w kolejnych cyklach hodowli półciągłych

Table 3. Effect of the medium composition on the oxalic acid yield in relation to the consuming substrate and the oxalic acid yield in relation to the initial substrate concentration in cycles of semicontinuous cultures of A. niger XP

Cykl 1 Cycle 1 Cykl 2 Cycle 2 Cykl 3 Cycle 3 Cykl 4 Cycle 4 StĊĪenie NH4NO3 w podłoĪu [gdm-3_] Concentration NH4NO3 in medium [gdm-3_] Y* [gg -1_] 0,5 1,97 1,03 0,81 0,44 1,0 1,03 1,20 0,96 0,99 1,5 0,93 1,11 1,00 0,42 YC** [gg-1] 0,5 1,36 0,78 0,38 0,27 1,0 0,96 1,11 0,72 0,64 1,5 0,92 0,97 0,63 0,40

* Y – wydajnoĞü kwasu szczawiowego (g kwasu szczawiowego/g zutylizowanego substratu) Y – yield of oxalic acid (g oxalic acid/g oil consumed)

** YC – wydajnoĞü całkowita kwasu szczawiowego (g kwasu szczawiowego/g wprowadzonego substratu)

YC – total yield of oxalic acid (g oxalic acid/g oil added)

Podczas kolejnych wymian podłoĪa produkcyjnego w hodowlach półciągłych synte-za kwasu szcsynte-zawiowego uległa synte-zahamowaniu. Analisynte-za wyników pozwala na stwierdze-nie, Īe dla procesu produkcji kwasu szczawiowego z substratów tłuszczowych bardziej efektywne wydają siĊ byü hodowle okresowe i okresowe z zasilaniem. ObniĪenie ak-tywnoĞci kwasotwórczej grzybni A. niger XP w hodowlach półciągłych mogło byü spowodowane zniszczeniem komórek grzybni w tak długim procesie, jak równieĪ na-gromadzeniem kwasu szczawiowego czy innych szkodliwych metabolitów. Najnowsze doniesienia przedstawiają nowe moĪliwoĞci intensyfikacji produkcji kwasu szczawio-wego. Mandal i in. [2005] unieruchamiali zarodniki szczepu A. niger NCIM548 w pian-ce poliuretanowej, technika ta pozwoliła na zwiĊkszenie produkcji kwasu szczawiowe-go z glukozy w hodowlach wstrząsanych w stosunku do procesów z wolnymi komór-kami. Autorzy ci wykazali, Īe unieruchomione formy A. niger NCIM548 zachowują zdolnoĞü do biosyntezy kwasu w trakcie 7 cykli hodowlanych, z których kaĪdy trwał 10 dni. Wyniki te zachĊcają do dalszych badaĔ dotyczących opracowania efektywnego półciągłego systemu hodowlanego z wykorzystaniem immobilizowanych form grzybni do biosyntezy kwasu szczawiowego z substratów lipidowych lub zastosowania bioreak-tora membranowego.

(10)

I. Musiał i in.

Acta Sci. Pol.

10

PIĝMIENNICTWO

Ambikadevi V.R., Lalithambika M., 2000. Effect of organic acids on ferric iron removal from iron – stained kaolinite, Appl. Clay Science, 16, 133–145.

Bohlmann J.T., Cameselle C., Núñez M. J., Lema J.M., 1998. Oxalic acid production by

Aspergil-lus niger, part II: Optimisation of fermentation with milk whey as carbon source, Bioprocess

Engineering, 19, 337–342.

Cameselle C., Bohlmann J.T., NúĔez M. J., Lema J.M., 1998. Oxalic acid production by

Aspergil-lus niger, part I: Influence of sucrose and milk whey as carbon source, Bioprocess

Engi-neering, 19, 247–252.

Cunningham J.E., Kuiack C., 1992. Production of citric and oxalic acid and solubilization of calcium phosphate by Penicilluim bilaii, Applied Environmental Microbiology, 58 (5), 1451– 1458.

Guru M., Bilgesu A.Y., Pamuk V., 2001. Production of oxalic acid from sugar beet molasses by formed nitrogen oxides, Bioresource Technol., 77, 81–86.

Kubicek C., Schreferl – Kunar G., Wohrer W., Rohr M., (1988. Evidence for a cytoplasmic path-way of oxalate biosynthesis in Aspergillus niger, Applied and Environmental Microbiology, 3, 633–637.

Leangon S., Maddox I. S., Brooks J. D., 1999. Influence of the glycolytic rate on production of citric acid and oxalate acid by Aspergillus niger in solid state fermentation, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 15, 493–495.

Mandal S.K., Banerjee P. C., 2005. Submerged production of oxalic acid from glucose by immo-bilized Aspergillus niger , Process Biochemistry, 40, 1605–1610.

Mulligan C.N., Kamali M., Gibbs B.F., 2004. Bioleaching of heavy metals from a low – grade mining ore using Aspergillus niger, J. Hazardous Materials, 110, 77–84.

Musiał I., Rymowicz W., Lenart D., Witkowska D., 2005. Wykorzystanie porafinacyjnych kwa-sów tłuszczowych do biosyntezy kwasu szczawiowego przez Aspergillus niger w warunkach obniĪonego pH. Biotechnologia, 2(2), 37–45.

Musiał I., Rymowicz W., Witkowska D., 2006. Effect of Span 20 concentration on oxalic acid production from post-refining fatty acids by Aspergillus niger XP. Chemical Papers, 60(5), 388–390.

Pernet J.C. 1991. Oxalic acid [In:] Encyclopedia of Chemical Technology. Ed. Kirk, R.E., Othmer D.F., 9, 661–674, New York: Interscience Publisher Inc.

Rymowicz W., Lenart D., 2003. Oxalic acid production from lipids by a mutant of Aspergillus

niger at different pH, Biotechnology Letters, 25, 955–958.

Rymowicz W., Lenart D., 2004. Comparison of different strains of Aspergillus niger for oxalic acid production from lipid substrates, Electronic Journal of Polish Agricultural Universities, Biotechnology, Volume 7, Issue 2.

Rymowicz W., Lenart D., 2004. Enhanced production of oxalic acid in Aspergillus niger by the addition of methanol, Electronic Journal of Polish Agricultural Universities, Biotechnology, Volume 7, Issue 2.

Santoro R., Cameselle, S. Rodriguez – Couto S., Sanromán Á., 1999. Influence of milk whey, nitrogen and phosphorus concentration on oxalic acid production by Aspergillus niger, Bio-process Engineering, 20, 1–5.

Strasser H., Burgstaller W., Schinner F., 1994. High – yield production of oxalic acid for metal leaching processes by Aspergillus niger, FEMS Microbiol. Lett., 119, 365–370.

(11)

11 OXALIC ACID PRODUCTION FROM POST-REFINING FATTY ACIDS BY ASPERGILLUS NIGER IN SEMICONTINUOUS CULTURE

Abstract. The aim of the studies was to evaluate the influence of N and P concentrations

on dynamic and yield of oxalic acid biosynthesis from post-refining fatty acids by

Aspergillus niger XP in semicontinuous cultures at low pH 4,0. Three semicontinuous

cultures were carried out with A. niger XP, in media containing post-refining fatty acids as the only carbon and energy source. Ability of oxalate biosynthesis in media containing different levels of NH4NO3 and KH2PO4was evaluated. In all cultures ability of

utiliza-tion of post-refining fatty acids and producutiliza-tion of oxalic acid were observed, however with different dynamics and yield. Biomass concentration in cultures varied from 6,5 gdm-3 in media containing 0,5 gdm-3 NH4NO3 to 30,5 gdm-3 in media containing

1,5 gdm-3 NH4NO3. The highest concentration of oxalic acid 56,2 gdm-3 was obtained in

medium with 1 gdm-3_NH

4NO3 and 0,5 gdm-3 KH2PO4. The highest yield 1,97 gg-1 was

obtained in 1st cycle in medium with 0,5 g/l NH4NO3. Volumetric oxalic acid production

rate varied significantly from 1,8 do 7,0 gdm-3_d-1_.

Key words: oxalic acid, Aspergillus niger, semicontinuous culture

Zaakceptowano do druku – Accepted for print: 30.06.2008

Do cytowania – For citation:. Musiał I., Rymowicz W., Witkowska D., 2008. Biosynteza kwasu szczawiowego z porafinacyjnych kwasów tłuszczowych przez Aspergillus niger w hodowlach półciągłych. Acta Sci. Pol. Biotechnol. 7(2), 3–11.

(12)

(13)

Acta S

FERMENTACJA W

Z ARONII I WIESIO

OTRZYMYWANIA P

FENOLOWYCH

Hanna Miszkiewicz, A

Politechnika Łódzka

Streszczenie. W pracy bada

kowatych Rhizopus oligosp wych z mieszanin wytłoków róĪniące siĊ zawartoĞcią ba sunku wagowym 9:1, a złoĪ zawartoĞci fenoli rozpuszcza P5) oraz dwukrotny wzrost rodników DPPH, dla obydw fermentacji przez R. oligosp z cukrami. Fenole zawarte w wowały α-amylazĊ trzustko Ğciowsze niĪ dotychczas wy tłoki z aronii i wiesiołka.

Słowa kluczowe: przeciwu

oligosporu

WSTĉP

Zintegrowane biorafinerie Ğrodowiska naturalnego) kon roĞlinnej) w róĪnorodne prod te surowce odnawialne, które jak dotąd kłopotliwy odpad z owoców i warzyw. Tematy skupia siĊ właĞnie na odpado Wytłoki aroniowe są odp nii. Zawierają one Ğrednio ok

Adres do korespondencji – C Technicznej, Politechnika Łódzk

Sci. Pol., Biotechnologia 7(2) 2008, 13-25

STAŁYM ZŁO

ĩU WYTŁOKÓW

OŁKA JAKO METODA

PRZECIWUTLENIACZY

Andrzej Jakubowski

1

ano moĪliwoĞü wykorzystania SSF przy udziale grzybów nit

porus jako metody pozyskiwania przeciwutleniaczy fenolo

w z aronii i wiesiołka. Fermentacji poddano dwa warianty złóĪ adanych surowców: złoĪe P9 zawierało ww. składniki w sto Īe P5 – 5:5. W wyniku fermentacji uzyskano ok. 67% wzros alnych w wodzie (druga doba, złoĪe P9 i czwarta doba, złoĪe

ich aktywnoĞci przeciwutleniającej wzglĊdem syntetycznych wu wariantów złoĪa. ȕ-Glukozydaza syntetyzowana w procesie

porus uwalniała przeciwutleniacze fenolowe z ich kompleksów

w próbach fermentacyjnych z wczesnej fazy procesu inakty-ową. Przedstawiony sposób postĊpowania pozwala na warto ykorzystanie badanych surowców odpadowych, takich jak wy

utleniacze fenolowe, wytłoki z aronii i wiesiołka, Rhizopus

us, SSF

e umoĪliwiają kompleksową i bezodpadową (neutralną nwersjĊ tanich, odnawialnych surowców (głównie biom dukty o wartoĞci dodanej. Pozwalają one takĪe wykorzy e pomimo zawartoĞci szeregu cennych składników stano d po produkcji ĪywnoĞci. NaleĪą do nich m.in. wyt yka badaĔ, których wyniki przedstawia niniejsza publika owych surowcach, takich jak wytłoki z aronii i z wiesiołk padem pochodzącym z przemysłowej obróbki owoców

k. 90,8% s.m. Wszystkie składniki włókna roĞlinnego t

Corresponding author: Hanna Miszkiewicz, Instytut Bioch ka, ul. B. Stefanowskiego 4/10, 90-924 ŁódĨ

-Ī, -t e h e w -s ą dla masy ystaü owią tłoki acja, ka. aro-tych hemii

(14)

H. Miszkiewicz, A. Jakubowski

Acta Sci. Pol.

14

wytłoków stanowią 95,8% suchej masy. NajwiĊcej jest celulozy (33,14%), niewiele mniej hemicelulozy (32,08%). ZawartoĞü lignin wynosi 23,03% a pektyn 7,52% [Nawirska i in. 2004]. Wykorzystuje siĊ je do produkcji barwników antocyjanowych lub składuje na wysypiskach Ğmieci, gdzie stanowią duĪy problem ekologiczny [Onesiak 2000].

Wytłoki z wiesiołka to odpad produkcyjny po tłoczeniu oleju wiesiołkowego. Za-wierają one w suchej masie: ok. 23,9% białka, 23,1% błonnika, 5,5% tłuszczu, 6,6% popiołu i 40,9% wyciągowych związków bezazotowych. Z uwagi na znaczną zawartoĞü białka mogą byü wykorzystane jako Ĩródło azotu [Kulasek i in.1998].

Na drodze biologicznej konwersji odpadów owocowych i warzywnych, zawierają-cych rozpuszczalne cukry i inne podatne na hydrolizĊ składniki oraz błonnik, moĪna otrzymaü szereg bardziej wartoĞciowych produktów, bogatych w polifenole roĞlinne [Correia i in. 2004a, c].

Fenolowe składniki roĞlinne mają właĞciwoĞci prozdrowotne i moĪna uwaĪaü je za potencjalne przeciwutleniacze, które charakteryzują siĊ m.in. zdolnoĞcią zmiatania wolnych rodników oraz chelatowania jonów metali katalizujących peroksydacjĊ tłusz-czów [Bravo 1998].

Diety bogate w warzywa i owoce (Ĩródła fenolowych składników roĞlinnych) obni-Īają wystĊpowanie chorób degeneracyjnych, nowotworowych i układu krąĪenia [Kris- -Etherton i in. 2002]. RoĞlinne fenole wystĊpują w formie glikozydów o niskiej aktyw-noĞci biologicznej. Enzymatyczna hydroliza uwalnia aglikony tych związków, które są bardziej aktywne niĪ glikozydowo związane fenole [Zheng 2000]. HydrolizĊ wiązaĔ glikozydowych katalizuje m.in. ȕ-glukozydaza, produkowana przez grzyby, bakterie i roĞliny [Murashima i in. 2002].

Grzyby z gatunku Rhizopus oligosporus, znane równieĪ jako pleĞĔ tempe, posiadają status GRAS i są powszechnie stosowane do produkcji ĪywnoĞci fermentowanej, gdyĪ dobrze rosną na resztkach owocowych. WczeĞniejsze badania wykazały, Īe wytwarzają one z dobrą wydajnoĞcią ȕ-glukozydazĊ, dziĊki czemu są zdolne do hydrolizy glikozy-dów fenolowych, zwiĊkszając tym samym ich wartoĞü biologiczną [Zheng i in. 1998].

CEL PRACY

Celem prezentowanej pracy było zbadanie moĪliwoĞci wykorzystania fermentacji w stałym złoĪu (SSF – Solid State Fermentation) przy udziale grzybów strzĊpkowych R. oligosporus jako metody pozyskiwania przeciwutleniaczy fenolowych z wytłoków aroniowych, połączonych z wytłokami z wiesiołka.

MATERIAŁ I METODY

Surowiec

Prowadzono biologiczną konwersjĊ dwóch odpadowych surowców naturalnych: wy-tłoków z aronii i wiesiołka („Agro-Pharm”Sp. z o.o. w Tuszynie).

(15)

Fermentacja w stałym złoĪu wytłoków z aronii i wiesiołka ...

15 Materiał biologiczny

W procesie fermentacji stosowano grzyby strzĊpkowe z gatunku Rhizopus oligospo-rus NRRL 2710. Szczep przechowywano na skosach dekstrozowo-agarowych (PDA) w temp. 4°C. Kultury uaktywniano przez przesiew ich na ĞwieĪe podłoĪe PDA i inku-bacjĊ w temp. 37°C w czasie 7 dób.

Warunki procesu

FermentacjĊ prowadzono w stałym złoĪu o gruboĞci 1,5 cm i wilgotnoĞci 65% (temp. 37°C, czas 12 dób). Przygotowano dwa warianty złóĪ, róĪniące siĊ zawartoĞcią wytłoków z aronii i wiesiołka: złoĪe P9 zawierało ww. składniki w stosunku wagowym 9:1, a złoĪe P5 – 5:5. Dodatkowo uzupełniono je ekstraktem sojowym Difco i CaCO3 (po 5%). Sterylne złoĪe szczepiono zawiesiną spor o gĊstoĞci 106 jtk/cm3 w iloĞci 1%.

Próby z kaĪdego wariantu hodowli pobierano co 2 doby i liofilizowano. Ekstrakty wodne

1 g liofilizowanej próbki fermentacyjnej zawieszano w 10 cm3 wody destylowanej, homogenizowano przez 1 min i odwirowywano w wirówce firmy Beckman (15000 rpm, 4°C, 20 min). Przed wykonaniem oznaczenia supernatant dializowano 48 godz. wobec wody destylowanej, w temp. 4ºC.

Oznaczanie aktywnoĞci Į-amylazy

AktywnoĞü Į-amylazy oznaczano metodą Worthington [McCue 2003]. 0,5 cm3 eks-traktu wodnego po dializie i 0,5 cm3 1% roztworu skrobi rozpuszczalnej w 0,1 M bufo-rze cytrynianowym o pH 4,8 inkubowano w temp. 50ºC w czasie 20 minut. ReakcjĊ przerywano przez dodanie 1 cm3 roztworu DNS, całoĞü inkubowano 5 min we wrzącej łaĨni wodnej. Po schłodzeniu uzupełniano wodą destylowaną do objĊtoĞci 10 cm3, dokładnie mieszano i absorbancjĊ mierzono przy długoĞci fali Ȝ 540 nm, wobec próby odczynnikowej, zawierającej wodĊ destylowaną zamiast ekstraktu. Krzywą wzorcową wykonano dla maltozy. Za jednostkĊ aktywnoĞci Į-amylazy przyjĊto taką iloĞü enzymu, która uwalnia 1 ȝmol maltozy z substratu w czasie 1 min w standardowych warunkach reakcji.

Oznaczanie aktywnoĞci ȕ-glukozydazy

AktywnoĞü ȕ-glukozydazy oznaczano inkubując w czasie 15 min w temp. 50°C, 0,5 cm3 roztworu salicyny (Aldrich S30-5, Niemcy) w 0,05 M buforze octanowym o pH 4,5 z 0,5 cm3 odpowiednio rozcieĔczonego w tym buforze ekstraktu po dializie. ReakcjĊ przerywano przez dodanie 1 cm3 alkalicznego roztworu DNS, całoĞü inkubowano przez 5 min we wrzącej łaĨni wodnej. Po schłodzeniu uzupełniano wodą destylowaną do objĊtoĞci 10 cm3_{, dokładnie mieszano i absorbancjĊ mierzono przy długoĞci fali Ȝ 540} nm, wobec próby odczynnikowej, zawierającej wodĊ destylowaną zamiast ekstraktu. Krzywą wzorcową wykonano dla glukozy. Za jednostkĊ aktywnoĞci ȕ-glukozydazy przyjĊto taką iloĞü enzymu, która uwalnia z substratu 1 ȝmol cukrów redukujących w przeliczeniu na glukozĊ w czasie 1 min, w standardowych warunkach reakcji.

(16)

Acta Sci. Pol.

16

Oznaczanie aktywnoĞci lakkazy

AktywnoĞü lakkazy oznaczano przez pomiar przyrostu absorbancji formy utlenionej czerwieni fenolowej, bĊdącej produktem reakcji. Do mieszaniny reakcyjnej zawierającej 0,1 cm3 0,1% roztworu czerwieni fenolowej, 0,1 cm3 1mM roztworu MnSO4 i 0,5 cm3 0,05 M buforu cytrynianowego o pH 4,5 dodawano 0,2 cm3 ekstraktu. AbsorbancjĊ mierzono przy długoĞci fali Ȝ 610 nm, w odstĊpach 1-minutowych przez 10 min, wobec próby kontrolnej, zawierającej wodĊ destylowaną zamiast ekstraktu. Za jednostkĊ aktywnoĞci lakkazy przyjĊto przyrost absorbancji o 0,01 w czasie 1 minuty. Wynik podawano w przeliczeniu na 1 g próby.

Oznaczanie polifenoli ogółem

ZawartoĞü polifenoli ogółem w ekstraktach wodnych prób fermentacyjnych ozna-czano metodą zmodyfikowaną przez Shetty [Vatem i in. 2002]. 1 cm3

odpowiednio rozcieĔczonego ekstraktu mieszano z 1 cm3

95% etanolu, 5 cm3 wody destylowanej i 0,5 cm3 50% (v/v) odczynnika Folin-Ciocalteau. Próby mieszano i inkubowano 5 min w temp. pokojowej, nastĊpnie dodawano 1 cm3

Na2CO3 i inkubowano 60 min w ciem-nym miejscu. AbsorbancjĊ mierzono przy długoĞci fali Ȝ 725 nm, wobec próby kontrol-nej zawierającej zamiast ekstraktu wodĊ destylowaną. ZawartoĞü polifenoli ogółem przeliczano na podstawie krzywej wzorcowej sporządzonej dla katechiny i wyraĪano w mg katechiny/g s.m.

Oznaczanie aktywnoĞci przeciwutleniającej polifenoli z DPPH [Vattem i in. 2002] Miarą aktywnoĞci przeciwutleniającej fenoli jest stopieĔ redukcji wolnych, synte-tycznych rodników DPPH (1,1-difenylo-2-pikrylohydrazyl, Sigma D-9132) w próbie badanej wyraĪony w %. Do 3 cm3_{60 ȝM DPPH w 95% etanolu dodawano 0,5 cm}3 ekstraktu wodnego i wykonywano pomiar absorbancji przy długoĞci fali Ȝ 517 nm. Odczyty porównywano z próbą kontrolną, która zawierała 0,5 cm3

etanolu zamiast ekstraktu. Próby badane oraz próbĊ kontrolną mierzono wobec etanolu. StopieĔ redukcji DPPH w % obliczano według wzoru (absorbancja próby kontrolnej – absorbancja próby badanej)/(absorbancja próby kontrolnej) x 100.

Oznaczanie aktywnoĞci przeciwutleniającej polifenoli z ȕ-karotenem [Vattem i in. 2002]

1 cm3 roztworu ȕ-karotenu w chloroformie, o stĊĪeniu 0,2 mg/cm3, wprowadzano do okrągłodennych odbieralników. Chloroform odparowywano na wyparce próĪniowej w 40ºC przez 5 minut. ȕ-Karoten przylegający do Ğcianek rozpuszczano w 20 ȝl czyste-go kwasu linoloweczyste-go i 184 ȝl Tween 40. NastĊpnie dodawano 50 cm3

50 mM roztworu nadtlenku wodoru i mieszano energicznie aĪ do wytworzenia emulsji. Po 5 cm3

tej emulsji przenoszono do probówek zawierających po 100 ȝl badanego ekstraktu wodnego. Próby mieszano 1 min i inkubowano w 50ºC przez 30 minut. NastĊpnie odczytywano absorbancjĊ przy Ȝ 470 nm i porównywano z próbą kontrolną, która zawierała 100 ȝl wody destylowanej zamiast ekstraktu. AktywnoĞü przeciwutleniającą (APF – Antioxi-dant Protection Factor) obliczano jako iloraz absorbancji próby właĞciwej i kontrolnej. Oznaczanie wpływu składników fenolowych na aktywnoĞü Į-amylazy trzustkowej Wpływ zawartych w fermentowanych wytłokach składników fenolowych na aktyw-noĞü Į-amylazy trzustki wieprzowej badano, inkubując 0,25 ml ekstraktu badanej próby

(17)

17 fermentacyjnej, poddanej 15 min. autoklawowaniu (w celu inaktywacji enzymów obec-nych w ekstraktach) z 0,25 ml preparatu Į-amylazy (65 mg Kreonu – preparatu farma-ceutycznego enzymów trzustkowych o aktywnoĞci Į-amylazy 8000 j. Ph. Eur. niemiec-kiej firmy Solvay Pharmaceuticals Gmbh, rozpuszczonego w 25 ml 0,02 M buforu fosforanowego o pH 6,9), w czasie 30 min w temp. 37ºC. NastĊpnie próby rozcieĔczano 50 razy. AktywnoĞü Į-amylazy zarówno wyjĞciową, jak i po działaniu związków feno-lowych oznaczano metodą Worthington [McCue i in. 2003].

WYNIKI I DYSKUSJA

W celu zbadania moĪliwoĞci wykorzystania wytłoków z aronii i wiesiołka do pro-dukcji wartoĞciowych dodatków do ĪywnoĞci o podwyĪszonej zawartoĞci przeciwutle-niaczy fenolowych przeprowadzono 12-dobowe fermentacje w stałym złoĪu przy udziale R. oligosporus. Stosowano dwa warianty podłóĪ: podłoĪe P9 (9 g wytłoków z aronii i 1 g wytłoków z wiesiołka) oraz podłoĪe P5 (5 g wytłoków z aronii i 5 g wytłoków z wiesiołka). Proces prowadzono na płytkach Petriego w temp. 37ºC. Z uwagi na niską zawartoĞü białka rozpuszczalnego w surowcu (0,32 mg/g s.m.) dla lepszego wzrostu R. oligosporus – złoĪa fermentacyjne wzbogacono Ĩródłem azotu w formie ekstraktu sojowego Difco.

Wytłoki z aronii i wiesiołka okazały siĊ dobrym Ĩródłem składników pokarmowych dla R. oligosporus. JuĪ po drugiej dobie inkubacji obserwowano intensywny jego wzrost. Jasnoszara grzybnia pokrywała całą powierzchniĊ złoĪa i przerastała je na całej gruboĞci. Po czwartej dobie grzybnia przybierała kolor brudnoszary i w miarĊ upływu czasu ciemniała.

Zmiany zawartoĞci wolnych fenoli w złoĪu fermentacyjnym

Zmiany zawartoĞci fenoli ogółem w ekstraktach wodnych prób fermentacyjnych ilu-struje rysunek 1. Niska zawartoĞü wolnych fenoli w złoĪach przed fermentacją sugeruje, Īe naturalne polifenole wystĊpują w wiĊkszoĞci w formie związanej (nierozpuszczal-nej). Po dwóch dobach fermentacji złoĪa P9 całkowita zawartoĞü polifenoli wzrosła o 68% (od 6,8 mg/g s.m. do 11,4 mg/g s.m.). Po czterech dobach w złoĪu P5 uzyskano wzrost o 66% (od 3,0 mg/g s.m. do 5,0 mg/g s.m.). NastĊpnie obserwowano gwałtowny ich spadek poniĪej wartoĞci wyjĞciowych w czwartej (do 4,7 mg/g s.m. złoĪe P9) i szó-stej (do 2,6 mg/g s.m. złoĪe P5) dobie fermentacji. Po dwunastu dobach procesu zawar-toĞü fenoli w badanych złoĪach wynosiła odpowiednio 3,1 mg/g s.m. i 1,6 mg/g s.m.

Dwukrotnie niĪsza zawartoĞü fenoli w złoĪu P5 w stosunku do złoĪa P9 wynika z prawie dwukrotnie niĪszej zawartoĞci wytłoków z aronii w tym złoĪu.

(18)

Acta Sci. Pol.

18

Rys. 1. Zmiany zawartoĞci fenoli ogółem w próbach fermentacyjnych złoĪa P9 i P5 Fig. 1. Changes in total phenolics content for substrates P9 and P5

Dynamika biosyntezy enzymów przez badany szczep R. oligosporus w procesie fermentacji w złoĪu P9 i P5

W badanych warunkach fermentacji szczep R. oligosporus NRRL 2710 w złoĪu P9 w drugiej dobie syntetyzował z najwyĪszą wydajnoĞcią: Į-amylazĊ i β-glukozydazĊ (rys. 2). W czwartej dobie procesu obserwowano spadek aktywnoĞci ww. enzymów, zaĞ w szóstej dobie najwyĪszą wydajnoĞü biosyntezy lakkazy i niewielki przyrost aktywno-Ğci Į-amylazy i β-glukozydazy. Ósma doba fermentacji charakteryzowała siĊ obniĪe-niem wydajnoĞci biosyntezy Į-amylazy, β-glukozydazy i lakkazy.

Rys. 2. Dynamika biosyntezy enzymów R. oligosporus w procesie fermentacji złoĪa P9 Fig. 2. Dynamics of biosynthesis of R. oligosporus enzymes during fermentation of substrate P9

Pod koniec procesu (dwunasta doba) obserwowano wzrost wydajnoĞci biosyntezy β-glukozydazy.

Podobnie kształtowała siĊ dynamika biosyntezy (choü z około dwukrotnie niĪszą wydajnoĞcią) Į-amylazy i β-glukozydazy do czwartej doby hodowli na złoĪu P5 (rys. 3).

0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 Za wa r to Ğü f e n o li [mg/g s. m. ] T o tal ph e n o lic s c o n te n t [mg/g d. w .]

Czas fermentacji [doby] Fermentation time [days]

P9 P5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 0 2 4 6 8 10 12 Ak ty w n oĞü e n zy m u [J/g s. m. ] E n zy me ac tivity [U /g d. w .]

(19)

Fermentacja w stałym złoĪu wytłoków z aronii i wiesiołka ... Biotechnologia 7(2) 2008 19 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 0 2 4 6 8 10 12 Ak ty w n oĞü en zym u [ J /g s .m .] E n zy m e activit y [U /g d.w .]

Alfa-amylaza – alfa-amylase Beta-glukozydaza – beta-glucosidase

Lakkaza – laccase

Rys. 3. Dynamika biosyntezy enzymów R. oligosporus w procesie fermentacji złoĪa P5 Fig. 3. Dynamics biosynthesis R. oligosporus enzymes during fermentation substrate P5

W przyjĊtych warunkach fermentacji R. oligosporus syntetyzował z maksymalną wydajnoĞcią badane enzymy w dziesiątej dobie procesu. AktywnoĞü Į-amylazy w złoĪu P5 była prawie trzykrotnie wyĪsza w porównaniu do aktywnoĞci w złoĪu P9 i utrzymy-wała siĊ na tak wysokim poziomie aĪ do koĔca hodowli.

Niska zawartoĞü azotu w złoĪu P9 oraz po wykorzystaniu go przez grzyb w złoĪu P5 mogła byü powodem intensywnej biosyntezy glikozydaz odpowiednio w drugiej i dzie-siątej dobie fermentacji, gdyĪ dziĊki tym enzymom zastosowany szczep R. oligosporus mógł wykorzystaü glikozydy do uzyskania niezbĊdnej energii. Energia ta posłuĪyła do syntezy enzymów katalizujących polimeryzacjĊ fenoli, której efektem był wzrost ak-tywnoĞci przeciwutleniającej. TakĪe Vatterm i Shetty sugerowali, Īe polimeryzacja fenoli podczas pleĞniowego bioprocesu moĪe byü spowodowana stresem związanym z wykorzystaniem składników odĪywczych [Vattem i in. 2002].

Korelacja pomiĊdzy zawartoĞcią fenoli ogółem w ekstraktach wodnych prób fermentacyjnych i biosyntezą wybranych enzymów Rhizopus oligosporus

Wzrost zawartoĞci fenoli ogółem w złoĪu P9 pokrywał siĊ z najwyĪszą wydajnoĞcią biosyntezy β-glukozydazy w drugiej dobie procesu (rys. 4). Dobra korelacja zawartoĞci fenoli rozpuszczalnych w wodzie z najwyĪszą aktywnoĞcią β-glukozydazy sugeruje, Īe enzym ten uwalnia fenole z ich glikozydów w fermentowanych wytłokach. Gwał-townemu spadkowi zawartoĞci fenoli w czwartej dobie procesu towarzyszyła biosynteza lakkazy. W tej fazie procesu rozpoczĊła siĊ remobilizacja aglikonów fenolowych (dime-ryzacja) do funkcjonalnych difenyli.

(20)

Acta Sci. Pol.

20

Rys. 4. Korelacja pomiĊdzy zawartoĞcią fenoli ogółem w złoĪu P9 i biosyntezą wybranych enzymów R. oligosporus

Fig. 4. Correlation between total phenolics content for substrate P9 and biosynthesis of selected

R. oligosporus enzymes

Niektóre wolne fenole mogą byü toksyczne dla wzrostu grzybów i wówczas uru-chamiają one biosyntezĊ lakkazy, która powoduje ich detoksyfikacjĊ poprzez utlenianie i polimeryzacjĊ do form polimerów fenolowych, łatwiej utylizowanych przez grzyby strzĊpkowe. Powstałe polimery fenolowe były trudniej rozpuszczalne w wodzie. Na koĔcowym etapie fermentacji β-glukozydaza wykazywała aktywnoĞü na duĪo niĪszym poziomie, ale nadal brała udział w remobilizacji polimerów fenolowych substratu.

Podobny poziom wzrostu zawartoĞci związków fenolowych w złoĪu P5 obserwowa-no o dwie doby póĨniej. Towarzyszyła mu wydajna biosynteza β-glukozydazy (rys. 5).

Rys. 5. Korelacja pomiĊdzy zawartoĞcią fenoli ogółem w złoĪu P5 i biosyntezą wybranych enzymów R. oligosporus

Fig. 5. Correlation between total phenolics content for substrate P5 and biosynthesis of selected

R. oligosporus enzymes 0 1 2 3 4 5 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 Ak ty w n oĞü e n zy m u [J/g s. m. ] E n zy me ac tivity [U /g d. w .] Za wa r to Ğü f e n o li o g ó łe m [mg/g s. m. ] T o tal ph e n olic s c o n te n t [mg/g d. w .]

Czas fermentacji [doby] Fermentation time [days] Polifenole-H20 – poliphenols-H2O

Beta-glukozydaza – beta-glucosidase Lakkaza – laccase

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 Ak ty w n oĞü e n zy m u [J/g s. m. ] E n zy me ac tivity [U /g d. w .] Za wa r to Ğü f e n o li o g ó łe m [mg/g s. m. ] T o tal ph e n o lic s c o n te n t [mg/g d. w .]

Czas fermentacji [doby] Fermentation time [days] Polifenole-H2O – poliphenols-H2O

(21)

21 Szczep R. oligosporus dopiero w dziesiątej dobie procesu syntetyzował z najwyĪszą wydajnoĞcią lakkazĊ (była ona niĪsza w porównaniu do wydajnoĞci uzyskanej na złoĪu P9) i β-glukozydazĊ.

Po wyczerpaniu siĊ obecnych w wytłokach aroniowych łatwiej przyswajalnych gli-kozydów oraz składników lipidowych – badany szczep R. oligosporus syntetyzował β-glukozydazĊ z wiĊkszą wydajnoĞcią (8–10 doba) w celu wykorzystania trudniej przy-swajalnych glikozydów wiesiołka. NajwyĪsza w tej fazie fermentacji aktywnoĞü lakka-zy była związana z detoksyfikacją rozpuszczalnych w wodzie wolnych fenoli poprzez ich utlenianie i polimeryzacjĊ do trudno rozpuszczalnych polimerów fenolowych.

Wyniki te sugerują, Īe β-glukozydaza odgrywała waĪną rolĊ w mobilizowaniu wol-nych fenoli produkowawol-nych podczas biokonwersji odpadów z aronii i wiesiołka w sta-łym złoĪu przy udziale R. oligosporus. Podobne trendy obserwowano podczas hodowli R. oligosporus w stałym złoĪu na odpadach z przetwórstwa ananasa [Correia i in. 2004c], guavy [Correia i in. 2004a] i Īurawiny [Vattem i in. 2002].

Korelacja pomiĊdzy zawartoĞcią fenoli ogółem w ekstraktach wodnych prób fermentacyjnych i ich aktywnoĞcią przeciwutleniającą

AktywnoĞü przeciwutleniającą polifenoli wyekstrahowanych wodą z prób fermenta-cyjnych oceniano dwiema metodami. W metodzie z DPPH mierzono zdolnoĞü otrzyma-nych ekstraktów do zmiatania wolotrzyma-nych, syntetyczotrzyma-nych rodników DPPH (DRI – DPPH Radical Inhibition). Natomiast w metodzie z β-karotenem okreĞlano zdolnoĞü przeciwu-tleniaczy do ochrony β-karotenu przed utlenianiem (APF – Antioxidant Protection Fac-tor) i moĪliwoĞü działania przeciwutleniacza na granicy faz lipid-woda.

AktywnoĞü fenoli zawartych w wodnych ekstraktach prób fermentacyjnych złoĪa P9, w wygaszaniu wolnych rodników DPPH, wykazywała do szóstej doby procesu silną tendencjĊ wzrostową (od 36,9% do ok. 75,5%), po czym wzrost tej aktywnoĞci był nieco słabszy. Po dwunastu dobach fermentacji osiągnĊła ona wartoĞü 74,1%, czyli około 2-krotnie wyĪszą w stosunku do próby wyjĞciowej (rys. 6). Z dynamicznym wzrostem aktywnoĞci przeciwrodnikowej dobrze korelował gwałtowny spadek zawarto-Ğci fenoli rozpuszczalnych w wodzie.

AktywnoĞü przeciwutleniająca ww. fenoli, mierzona wzglĊdem β-karotenu wzrasta-ła do czwartej doby procesu (od 0,17 do 0,25), po czym nastĊpował jej spadek do war-toĞci zbliĪonej do wyjĞciowej oraz ponowny wzrost do warwar-toĞci maksymalnej (0,3) w dwunastej dobie procesu.

Uzyskane wyniki wskazują, Īe przeciwutleniacze z wczeĞniejszej fazy procesu mia-ły charakter hydrofobowy (4 doba). ĝwiadczy o tym wzrost aktywnoĞci przeciwutlenia-jącej wobec β-karotenu. ZdolnoĞü fenoli w ekstraktach wodnych prób fermentacyjnych złoĪa P5 do zmiatania wolnych rodników DPPH, do drugiej doby procesu, wykazywała tendencjĊ wzrostową (od 28,5% do ok. 34,6%), po czym do szóstej doby obserwowano spadek do 18,9% i ponowny jej wzrost, po dwunastu dobach, kiedy to osiągnĊła wartoĞü 55,4%, czyli około 2-krotnie wyĪszą w stosunku do wartoĞci wyjĞciowej (rys. 7).

(22)

Acta Sci. Pol.

22

Rys. 6. Korelacja pomiĊdzy zawartoĞcią fenoli ogółem w złoĪu P9 i ich aktywnoĞcią przeciw-utleniającą

Fig. 6. Correlation between total phenolics content for substrate P9 and their antioxidant activity

Rys. 7. Korelacja pomiĊdzy zawartoĞcią fenoli ogółem w złoĪu P5 i ich aktywnoĞcią przeciwu-tleniającą

Fig. 7. Correlation between total phenolics content for substrate P5 and their antioxidant activity

AktywnoĞü przeciwutleniająca polifenoli wystĊpujących w złoĪu P5, mierzona wzglĊdem β-karotenu, do szóstej doby procesu wzrastała (od 0,08 do 0,16), po czym obserwowano jej spadek do wartoĞci poniĪej wyjĞciowej, aĪ do dwunastej doby proce-su, kiedy osiągnĊła wartoĞü 0,04. W podłoĪu P5 bogatszym w składniki lipidowe, w szóstej dobie, obserwowano dwukrotny wzrost aktywnoĞci przeciwutleniającej wobec β-karotenu i wyraĨny spadek zawartoĞci fenoli rozpuszczalnych. Wraz ze zmianą Ğro-dowiska (wyczerpywaniem siĊ składników lipidowych) na bardziej hydrofilowe, natura

0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 Ak ty w n oĞü p r zeci wu tl e n ia ją ca A n tio x ida nt ac tivity Za wa r to Ğü f e n o li o g ó łe m [mg/g s. m. ] T o tal ph e n o lic s c o n te n t [mg/g d. w .]

Polifenole-H2O – Poliphenols-H2O DRI [%] APF x 1/100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 Ak ty w n oĞü p r zeci wu tl e n ia ją ca A n tio x ida nt ac tivity Za wa r to Ğü f e n o li o g ó łe m [mg/g s. m. ] T o tal ph e n o lic s c o n te n t [mg/g d. w .]

(23)

23 przeciwutleniaczy zmieniała siĊ i wówczas obserwowano wyraĨny wzrost aktywnoĞci przeciwrodnikowej wobec DPPH (dwunasta doba).

Polimery fenolowe słabo rozpuszczalne w wodzie wykazywały duĪo wyĪszą aktyw-noĞü przeciwutleniającą niĪ monomery. W zaleĪnoĞci od zmian zachodzących w podło-Īu podczas fermentacji zmieniał siĊ ogólny charakter przeciwutleniaczy, z hydrofobo-wego na hydrofilowy lub odwrotnie. Przeciwutleniacze obecne we wczesnej fazie wzro-stu były bardziej hydrofobowe i dlatego bardziej aktywne wobec β-karotenu. Podobne obserwacje opisali Correia i in. [2004c].

Wpływ fenoli obecnych w ekstraktach wodnych prób fermentacyjnych na aktywnoĞü α-amylazy trzustkowej w warunkach in vitro

W zaleĪnoĞci od struktury związków fenolowych mogą one reagowaü z enzymami, zmieniając ich rozpuszczalnoĞü i aktywnoĞü. Spadek aktywnoĞci enzymu zaleĪy od stĊĪenia, liczby i pozycji grup hydroksylowych związków fenolowych.

W prezentowanej pracy badano wpływ ekstraktów fenoli z fermentowanego złoĪa P9 na aktywnoĞü Į-amylazy trzustkowej. Na podstawie uzyskanych wyników stwier-dzono, Īe związki fenolowe zawarte w ekstraktach złoĪa P9, fermentowanego w czasie szeĞciu dób, hamowały aktywnoĞü Į-amylazy trzustkowej, podczas gdy fenole obecne w ekstraktach złoĪa fermentowanego dłuĪej (od 7 do 12 doby) aktywowały ten enzym (rys. 8).

Rys. 8. Wpływ fenoli ekstraktów wodnych prób fermentacyjnych złoĪa P9 na aktywnoĞü α-amylazy trzustkowej w warunkach in vitro

Fig. 8. Effect of phenolics occurring in aqueous extracts from fermented substrate P9 on the pancreas Į-amylase activity in vitro

Polifenole zawarte w próbach fermentacyjnych, otrzymanych po dwunastu dobach procesu, korzystnie wpływały na aktywnoĞü ww. enzymu, powodując wzrost jego ak-tywnoĞci o 15,4%. Stwierdzono równieĪ, Īe intensywnoĞü hamowania akak-tywnoĞci ba-danego enzymu była skorelowana z maksymalną zawartoĞcią fenoli ogółem i prawdo-podobnie była związana z ich strukturą. Nie była ona natomiast skorelowana z aktyw-noĞcią przeciwrodnikową, mierzoną wobec DPPH. Obserwacje te są zgodne z wynikami

86,8 95,6 101,4 107,6 115,4 113,2 0 20 40 60 80 100 120 140 0 2 4 6 8 10 12 Ak ty w n oĞü alf a -amyla zy w zgl Ċd n a [ % ] R e lative ly alf a -amylas e ac tivity [%]

(24)

Acta Sci. Pol.

24

badaĔ Correia i in. [2004b], którzy wskazują na moĪliwoĞü zastosowania naturalnych, fenolowych inhibitorów α-amylazy w walce z cukrzycą.

WNIOSKI

1. Podczas fermentacji wytłoków z aronii i wiesiołka w stałym złoĪu stwierdzono wyraĨną korelacjĊ pomiĊdzy zawartoĞcią fenoli ogółem i aktywnoĞcią β-glukozydazy, a takĪe pomiĊdzy stĊĪeniem polimerów fenolowych i wydajnoĞcią biosyntezy lakkazy.

2. Polimery fenolowe wykazywały wyĪszą aktywnoĞü przeciwutleniającą niĪ mono-mery.

3. Przeciwutleniacze powstające we wczeĞniejszej fazie procesu miały bardziej hy-drofobowy charakter niĪ przeciwutleniacze generowane w drugiej fazie fermentacji.

4. Biokonwersja wytłoków z aronii i wiesiołka przy udziale R. oligosporus powo-dowała ponad 2-krotny wzrost ich aktywnoĞci przeciwutleniającej.

5. Fenole zawarte w próbach fermentacyjnych z wczesnej fazy procesu inaktywowa-ły α-amylazĊ trzustkową, natomiast polifenole wykazujące znaczną aktywnoĞü przeci-wutleniającą aktywowały badany enzym.

6. Przeprowadzone badania wykazały moĪliwoĞü otrzymywania przeciwutleniaczy fenolowych – produktów o wartoĞci dodanej, z wytłoków z aronii połączonych z wytło-kami z wiesiołka na drodze SSF, co stwarza szansĊ na ich bardziej racjonalne niĪ do-tychczas wykorzystanie w zintegrowanej biorafinerii.

PIĝMIENNICTWO

Bravo L., 1998. Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism and nutritional significance. Nutr. Rev., 56, 317–333.

Correia R.T.P., McCue P., Magalhaes M.M.A., Macedo G.R., Shetty K., 2004a. Phenolic antioxi-dant enrichment of soy flour-suplemented guava waste by Rhizopus oligosporus – mediated solid-state bioprocessing Journal of Food Biochem., 28, 404–418.

Correia R.T.P., McCue P., Vattem D.A., Magalhaes M.M.A., Macedo G.R. Shetty K., 2004b. Amylase and Helicobacter pylori inhibition by phenolic extracts of pineapple wastes biopro-cessed by Rhizopus oligosporus. Journal of Food Biochemistry, 28, 419–434.

Correia R.T.P., McCue P., Magalhaes M.M.A., Macedo G.R., Shetty K., 2004c. Production of phenolic antioxidants by the solid-state bioconvertion of pineapple waste mixed with soy flour using Rhizopus oligosporus. Process Biochemistry, 39, 2167–2172.

Kulasek G., BałasiĔska B., 1998. Substancje biologicznie czynne beztłuszczowej masy nasion wiesiołka (Oenothera sp.). Zbiór prac III Sympozjum n.t.: Olej z nasion wiesiołka i inne oleje zawierające kwasy N-6 lub N-3 w profilaktyce i terapii. Sulejów 15–16 maja 1998. 150–153. Kris-Etherton P.M., Hocker K.D., Bonamone A., Coval S.M., Binkoski A.E., Hilpert K.F., et al.,

2002. Bioactive compounds in for solid-state fungal state bioprocessing of foods:their role in the prevention of cardiovascular disease and cancer. Am. J. Med., 113, 71–88.

Nawirska A., KwaĞniewska M., 2004. Frakcje błonnika w wytłokach z owoców. Acta Sci. Pol., Technol. Aliment., 3(1), 13–20.

McCue P., Shetty K., 2003a. Role of carbohydrate-cleaving enzymes in phenolic antioxidant mobilization from whole soybean fermented with Rhizopus oligosporus. Food Biotechnology, 17, 27–37.

(25)

25

Murashima K., Nishimura Y., Nakamura Y., Koga J., Moriya T., Sumida N., et al. 2002. Purifica-tion and characterizaPurifica-tion of new endo-1,4- ȕ-D-glucanases from Rhizopus oryzae. Enzyme Microbiol. Technol., 30, 319–326.

Onesiak K., 2000. Aronia i jej Īywieniowo-lecznicze znaczenie. ĩywnoĞü, ĩywienie, Prawo a Zdrowie. Nr 3, str. 326.

Vattem D.A., Shetty K., 2002. Solid-state production of phenolic antioxidants from cranberry pomace by Rhizopus oligosporus. Food Biotechnol., 16, 189–210.

Zheng Z., Shetty K., 1998. Solid-state production of beneficial fungi as the indicator of growth. J. Agric. Food Chem., 46, 783–787.

Zheng Z., Shetty K., 2000. Solid-state bioconversion of phenolic from cranberry pomace and role of Lentinus edodesȕ-glucosidase. J. Agric. Food Chem., 48, 895–900.

SOLID-STATE PRODUCTION OF PHENOLIC ANTIOXIDANTS FROM MIXTURES OF ARONIA POMACE AND EVENING PRIMOSE WASTE

Abstract. This paper reports on application of SSF conducted by Rhizopus oligosporus

for production of phenolic antioxidants from mixtures of aronia pomace and evening pri-mose cake. The fungus was grown on two substrates: (P9) 9g of aronia pomace and 1 g of evening primose waste, and (P5) 5 g of aronia pomace and 5 g of evening primose cake. Changes in concentration of phenolics extractable with water were correlated with changes in ȕ-glucosidase activity and polymeric phenolics content was correlated with the yield of laccase biosynthesis. Antioxidant activity increased two-fold after 12 day fermen-tation of both P5 and P9. Phenolics produced in the early stage of the SSF process inhi-bited the porcine pancreatic Į-amylase while polymeric phenolics with high antioxidant capacity activated this enzyme. SSF, conducted under presented conditions, increased the value of aronia pomace and evening primose cake.

Key words: phenolic antioxidants, melanocarpa pomace, Rhizopus oligosporus, SSF

Zaakceptowano do druku – Accepted for print: 30.06.2008

Do cytowania – For citation: Miszkiewicz H, Jakubowski A., 2008. Fermentacja w stałym złoĪu wytłoków z aronii i wiesiołka jako metoda otrzymywania przeciwutleniaczy fenolowych. Acta Sci. Pol. Biotechnol. 7(2), 13–25.

(26)

(27)

Acta S

WZROST I ENZYM

W MLEKU RÓ

ĩNY

Marek Szołtysik, Mon

Maria Wojtatowicz, Jó

Uniwersytet Przyrodniczy

Streszczenie. Przedmiotem sphaerica FII7a oraz Yarro

stem pleĞniowym Rokpol. B i owczego w celu okreĞlenia magających w produkcji ser szczepione próby mleka ink monitorowano wzrost droĪd dniu inkubacji oceniono w m ne białek i lipidów. PróbĊ k Īe w kaĪdym mleku lepiej r

Y. lipolytica JII1c, które osi

populacja tego ostatniego We wszystkich rodzajach m zawartoĞci kwasu cytrynowe

Candida kefyr PII1b i Cand

toĞci kwasów: octowego, m białek mleka wykazano w p Proteazy tych droĪdĪy w ró jak i owczego. RównieĪ ich nych gatunków przeĪuwacz krótko- i ĞredniołaĔcuchow wzglĊdu szczep tych droĪd rodzaju mleka, zwłaszcza se

Słowa kluczowe: droĪdĪe, w

*Praca wykonana w ramach proje

Adres do korespondencji – Corr ców ZwierzĊcych i Zarządzani Norwida 25/27, 50–375 Wrocław

Sci. Pol., Biotechnologia 7(2) 2008, 27-41

MATYCZNA AKTYWNO

ĝû DROĩDĩY

CH GATUNKÓW PRZE

ĩUWACZY*

nika

ĩelazko, Xymena Połomska,

ózefa Chrzanowska

we Wrocławiu

1

badaĔ były szczepy droĪdĪy Candida kefyr PII1b, Candida

wia lipolytica JII1c wyizolowane z polskich serów z

przero-Badane droĪdĪe wprowadzono do mleka krowiego, koziego a ich cech technologicznych jako potencjalnych kultur wspo rów wytwarzanych z mleka róĪnych gatunków zwierząt. Za kubowano w temp. pokojowej przez 12 dni. Podczas inkubacj dĪy, pH, oraz poziom azotu rozpuszczalnego w pH 4,6. W 12 mleku poziom kwasów organicznych oraz zmiany

degradacyj-kontrolną stanowiło mleko bez dodatku droĪdĪy. Wykazano rozwijały siĊ droĪdĪe C. sphaerica FII7a i C. kefyr PII1b niĪ iągały liczebnoĞü na poziomie 107-108j.t.k.mL-1, podczas gdy szczepu była niĪsza Ğrednio o jeden rząd logarytmiczny mleka wzrost droĪdĪy Y. lipolytica JII1c wiązał siĊ spadkiem

ego. Natomiast podczas wzrostu dwóch pozostałych szczepów

dida sphaerica FII7a obserwowano niewielki przyrost zawar

mlekowego i propionowego. NajwiĊksze zmiany degradacyjne próbach, do których wprowadzono droĪdĪe Y. lipolytica JII1c ównym stopniu degradowały białka mleka krowiego, koziego h lipazy spowodowały najwiĊkszy rozkład tłuszczu mleka róĪ zy, uwalniając znaczne iloĞci wolnych kwasów tłuszczowych wych, a takĪe kwasu palmitynowego i oleinowego. Z tego dĪy moĪe byü wykorzystany do produkcji serów z kaĪdego erów miĊkkich.

wzrost, mleko, kwasy organiczne, proteoliza, lipoliza

ektu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa WyĪszego Nr 2 P06T 050

responding author: Marek Szołtysik, Katedra Technologii Su ia JakoĞcią, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, ul. w, e-mail: marek.szoltysik@up.wroc.pl a -o -i . -, Ī y y. m w -e c. o, -h o o 28. row-C.K.

(28)

M. Szołtysik i in.

Acta Sci. Pol.

28 WSTĉP

DroĪdĪe stanowią stały składnik mikroflory wielu produktów mleczarskich [Jacob-sen i Narvhus 1996, Mayoral i in. 2005, Gardini i in. 2006]. DostĊpnoĞü białka, tłusz-czu, cukru i soli mineralnych, a takĪe zdolnoĞü droĪdĪy do wzrostu w niskich tempera-turach i przy wysokim zasoleniu powodują, Īe mleko i jego przetwory są dobrym Ğro-dowiskiem do rozwoju tych mikroorganizmów [Mayoral i in. 2005]. Ich obecnoĞü nie pozostaje jednak bez wpływu na jakoĞü produktów [Fleet 1992, Addis i in. 2001]. Enzymy zewnątrzkomórkowe wydzielane przez droĪdĪe uczestniczą w degradacji bia-łek i lipidów mleka [Chrzanowska i Wojtatowicz 2001, Suzzi i in. 2001, Florez i Mayo 2006, Czajgucka i in. 2006]. Powstające w ten sposób wolne aminokwasy i kwasy tłuszczowe słuĪą jako substraty do syntezy związków aromatycznych [Jollivet i in. 1994, Molimard i in. 1996, Cichosz 1997, Gardini i in. 1999, Pandey i in. 1999, McSweeney i Sousa 2000]. Cukry i kwasy organiczne asymilowane w procesach fer-mentacji przekształcane są do wtórnych metabolitów, wydzielanych do Ğrodowiska, powodując zmiany kwasowoĞci. Przemiany te wpływają na kształtowanie siĊ cech or-ganoleptycznych, nadając produktom charakterystyczny smak i zapach. Z tego wzglĊdu od lat prowadzone są prace nad wykorzystaniem wyselekcjonowanych szczepów droĪ-dĪy jako serowarskich kultur wspomagających [van den Tempel i Jacobsen 2000, Ferre-ira i Viljoen 2003]. Zmiany zachodzące w mleku pod wpływem droĪdĪy mogą rzutowaü jednak na rozwój bakterii fermentacji mlekowej, wprowadzanej do mleka w postaci szczepionek [Eliskases-Lechner i Ginzinger 1995, Gadaga i in. 2001, Alwarez-Martin 2008]. Rozwój droĪdĪy moĪe prowadziü takĪe do powstawania wad, takich jak gorzki lub owocowy posmak, zmiana barwy oraz tekstury.

RóĪnice w składzie oraz dostĊpnoĞci poszczególnych komponentów obserwowane pomiĊdzy mlekiem krowim, kozim i owczym mogą wpływaü na rozwój mikroflory odpowiedzialnej za kształtowanie cech jakoĞciowych produktów mleczarskich. Wpro-wadzenie do praktyki przemysłowej wyselekcjonowanych szczepów droĪdĪy, jako potencjalnych kultur wspomagających, wymaga zatem oceny ich wzrostu i aktywnoĞci hydrolitycznej w mleku nie tylko krowim, ale i innych gatunków zwierząt, coraz czĊ-Ğciej wykorzystywanym takĪe w Polsce jako surowiec serowarski.

MATERIAŁ I METODY

Przedmiotem badaĔ były szczepy droĪdĪy Candida kefyr PII1b, C. sphaerica FII7a, oraz Yarrowia lipolytica JII1c wyizolowane z serów z przerostem pleĞniowym Rokpol [Wojtatowicz i in. 2001] i pochodzące z kolekcji Katedry Biotechnologii i Mikrobiolo-gii ĩywnoĞci Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu.

DroĪdĪe namnoĪono w 20 mL podłoĪa YCG zawierającego (g.L-1): ekstrakt dro Ī-dĪowy – 1,7; kazeinĊ – 2,0; glukozĊ – 10, w kolbach o objĊtoĞci 200 mL, na wytrząsar-ce w temp. 28oC przez 48 h. Po zakoĔczeniu hodowli oznaczano gĊstoĞü komórek, a nastĊpnie biomasĊ odwirowano i wprowadzono do sterylnego mleka do uzyskania koĔcowego stĊĪenia 105

j.t.k..mL-1. Zaszczepione próby mleka krowiego, koziego i owczego o objĊtoĞci 500 mL inkubowano w temp. pokojowej przez 12 dni. PróbĊ kontrolną stanowiło mleko bez dodatku droĪdĪy. Podczas inkubacji monitorowano wzrost droĪdĪy, pH oraz poziom azotu rozpuszczalnego i całkowitego. W 12. dniu in-kubacji oceniono ponadto poziom kwasów organicznych oraz zmiany degradacyjne