Med. Weter. 2014, 70 (6) 326
Artykuł przeglądowy Review
Występowanie grzybic narządowych u pacjentów poddanych terapii przeciwnowotworowej nie było dotychczas w literaturze weterynaryjnej dokładniej opisane. W ciągu kilkunastu ostatnich lat obserwuje się znaczny wzrost liczby wtórnych inwazyjnych zakażeń grzybiczych IFI (invasive fungal infections). Jest to głównie efekt znacznego postępu wynikającego zarówno ze stosowania coraz nowszych metod diagno-stycznych, terapeutycznych, jak również podawania antybiotyków o coraz szerszym spektrum działania. Zakażenia grzybicze dzielimy na powierzchowne, które dotyczą skóry i błon śluzowych, oraz narządowe.
Grzybice narządowe, zwane inaczej układowymi lub głębokimi, dotyczą narządów wewnętrznych i mogą przybierać postać zakażenia uogólnionego często z to-warzyszącą fungemią (ryc. 1). Wśród nich wyróżnia się grzybice egzogenne, które rozwijają się w wyniku zakażenia z zewnątrz i endogenne, wywoływane przez florę saprofityczną. Przyczyną grzybic głębokich są grzyby oportunistyczne rozpowszechnione w otaczają-cym środowisku oraz grzyby bezwzględnie patogenne mające ograniczony zasięg geograficzny. Zakażenia oportunistyczne wywoływane są najczęściej przez grzyby z rodzaju Candida spp., Aspergillus spp. oraz
Cryptococcus.
W pracy postanowiono przybliżyć problem zagro-żenia wtórnymi grzybicami narządowymi u zwierząt towarzyszących wynikający ze stosowania leków przeciwnowotworowych oraz przedstawić drogi po-stępowania diagnostycznego i możliwe metody zapo- biegania zakażeniom.
Grzybice układowe są najczęściej wywoływane przez grzyby należące do rodzajów: Aspergillus,
Absidia, Blastomyces, Candida, Cryptococcus, Histo- plasma i Mucor. Około 60-80% zakażeń dotyczy
grzybów z rodzaju Candida oraz Aspergillus. Coraz większą rolę zaczynają odgrywać również grzyby nale-żące do Fusarium oraz Scedosporium (6, 9, 18, 24, 25). Występowanie grzybic narządowych wiąże się prawie zawsze ze stanami upośledzonej odporności (tab. 1). Zalicza się do nich neutropenię oraz limfopenię doty-czącą limfocytów CD4+. Inne czynniki, które sprzyjają
Zagrożenia grzybicami narządowymi
w terapii przeciwnowotworowej u zwierząt
JACEK PIÓRKOWSKI, ZBIGNIEW NOZDRYN-PŁOTNICKI
Katedra Anatomii Patologicznej, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, ul. Głęboka 30, 20-060 Lublin
Otrzymano 16.07.2013 Zaakceptowano 28.02.2014
Piórkowski J., Nozdryn-Płotnicki Z.
Threat organ mycoses in antineoplastic therapy with animals
Summary
Oncotherapy of tumors in dogs and cats is often associated with many side effects. This result is connected with the considerable fall of immunity through the application of radiotherapy as well as chemotherapy. Organ mycoses are typical complications concerning livers, spleen, as well as the lungs evoked by fungus Candida, Aspergillus as well as Cryptococcus. Diagnosis using PCR is a method primarily approved due to its short time test and a high specificity. The avoidance of organ mycosis should be based on the introduction of suitable preventive programs connected with empirical treatment.
Keywords: cancer therapy, organ mycosis, animals
Ryc. 1. Grzybica płuc. Strzępki grzybni otoczone naciekiem granulocytów obojętnochłonnych. Barw. HE. Pow. 100 ×
Med. Weter. 2014, 70 (6) 327
zakażeniu, to: leczenie immunosupresyjne, leczenie glikokortykosteroidami, radioterapia, chemioterapia, diagnostyczne zabiegi chirurgiczne, stosowanie cew-ników dożylnych oraz splenektomia (9, 17, 19, 27). Zwraca się również uwagę na długotrwałe stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum działania, a także na niewydolność nerek oraz wątroby.
Kandidioza
Candida spp. należą do rzędu drożdżakowców
i stanowią naturalną florę fizjologiczną przewodu pokarmowego, skóry oraz narządów moczowo-płcio-wych (11, 22). Zakażenia u zwierząt wywołane przez
Candida mają najczęściej charakter endogenny, a
źró-dłem zakażenia jest flora drożdżakowa gospodarza (2, 14-16, 20, 28). Drogą inwazji jest błona śluzowa dróg oddechowych oraz przewodu pokarmowego (1). Zaburzenia odpowiedzi humoralnej, odpowiedzi ko-mórkowej oraz uszkodzenia ciągłości błon śluzowych sprzyjają kolonizacji przez te grzyby. Na początku lat osiemdziesiątych XX w. Candida albicans stanowiła większość zakażeń, a pozostałe Candida spp. – znaczną mniejszość. W latach dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku w związku ze stosowaniem profilaktycznym leków azolowych tendencje uległy odwróceniu i po-zycję dominującą zaczynają uzyskiwać Candida
glabrata oraz Candida tropicalis (5). Inne gatunki
oportunistyczne stwierdzane u pacjentów onkolo-gicznych to: Candida krusei, Candida parapsilosis,
Candida dubliniensis, Candida lliermondii, Candida kefir, Candida lipolytica, Candida lusitaniae, Candida rugosa. Candida spp. są przyczyną kandydemii, czyli
obecności grzybów we krwi. Istotną rolę w koloniza-cji odgrywają zdolności adhezyjne strzępek grzybni, związki immunomodulujące, związki antyoksydacyj-ne oraz wydzielaantyoksydacyj-ne enzymy hydrolityczantyoksydacyj-ne. Rozsiana kandydemia prowadzi do wysokiej śmiertelności, osią-gającej poziom 40-80% (3, 27). Drogą zakażenia dla
Candida spp. jest uszkodzona błona śluzowa przewodu
pokarmowego. Drogą naczyń krwionośnych dochodzi również do rozprzestrzeniania się procesu i tworzenia ognisk przerzutowych w śledzionie, wątrobie, płucach oraz ośrod-kowym układzie nerwowym.
Aspergilloza
Grzybica kropidlakowa wywołana jest przez grzyby należące do workowców. Za- rodniki Aspergillus mają niewielkie rozmia-ry, wynoszące około 2,5-3,5 µm i są szeroko rozpowszechnione w środowisku. Wrotami zakażenia są często zranienia przy zabiegach chirurgicznych oraz drogi oddechowe, gdzie najczęściej atakowanym narządem są płuca. Podstawową linią obrony są makrofagi, leu-kocyty oraz monocyty. Elastaza produkowa-na przez grzybnię hamuje opsonizację, zabu-rza również fagocytozę oraz cytotoksyczność limfocytów T (4). Wydzielana restryktocyna oraz gliotoksyna hamują migrację i produkcję rodników tlenowych przez leukocyty wielojądrzaste. Wnikające strzępki grzybni do światła naczyń prowadzą do zakrzepów, zatorów oraz martwicy tkanek, są także przyczyną rozsiewu zarodników drogą krwiopochodną do odległych narządów. U psów i kotów najczęściej spotykanym gatunkiem jest A. fumigatus i A. terreus (4, 7). Do czynników ryzyka rozwoju aspergilozy za-licza się: długotrwałą neutropenię, nowotwory o pod-łożu hematologicznym, stosowanie cytostatyków oraz glikokortykosteroidów. U ludzi zwraca się również uwagę na leczenie infliksymabem – Remicade (prze-ciwciało monoklonalne przeciw czynnikowi martwicy nowotworów TNF-α) (8).
Diagnostyka układowych zakażeń grzybiczych Obraz kliniczny grzybic narządowych początkowo jest mało charakterystyczny i w większości przypad-ków przypomina choroby o etiologii wirusowej lub bakteryjnej. U zwierząt chorych, będących w stanie immunosupresji często obserwuje się tylko podwyż-szenie ciepłoty ciała. W powiązaniu z neutropenią jest to ważny czynnik sugerujący możliwość wystąpienia grzybic układowych. Ryzyko tych zakażeń znacznie wzrasta w przypadku długotrwałego stosowania an-tybiotyków. Patogenność grzybów wynika głównie z mechanicznego i destrukcyjnego działania grzybni na otaczające tkanki oraz wytwarzania przez nie endotoksyn i enzymów (hydrolazy, lizofosfolipazy, katalazy). Dowodem zakażenia inwazyjnego jest stwierdzenie w pobranym materiale obecności grzybni. W diagnostyce zakażeń grzybiczych wykorzystywane są badania mikroskopowe, badania hodowlane oraz inne techniki (23). Najczęściej materiałem biolo-gicznym jest: krew, płyn z jamy opłucnowej, płyn z jamy brzusznej, płyn z torbieli i ropni, wymazy z dostępnych błon śluzowych. Próbki pozyskiwane są podczas wykonywania endoskopii, biopsji
aspira-Tab. 1. Najczęstsze czynniki, przyczyny oraz stopnie ryzyka układowych zakażeń grzybiczych u ludzi wywołanych przez Aspergillus oraz Candida w trzystopniowej skali (29)
Czynnik, przyczyna Stopień ryzyka zakażeniaAspergillus Stopień ryzyka zakażeniaCandida
Antybiotykoterapia brak mały
Stosowanie cewnika żylnego brak mały
Zapalenie błon śluzowych brak duży
Infekcja bakteryjna mały mały
Stosowanie kortykosteroidów mały mały
Długotrwała neutropenia związana
ze stosowaniem cytostatyków duży mały
Nadkażenie wirusem cytomegalii
(CMV) mały brak
Przebyta gruźlica średni mały
Nieodpowiednia profilaktyka mały mały
Med. Weter. 2014, 70 (6) 328
cyjnej cienkoigłowej oraz zabiegów opera- cyjnych.
Badania mikroskopowe i hodowlane Wykonanie preparatów bezpośrednich po-zwala na wstępną kwalifikację materiału i za-liczenie ich do drożdżaków lub pleśniaków. Obejmują one rozmazy, które najczęściej są utrwalane w 70% alkoholu metylowym lub płynie Schaudinna. Większość grzybów wybarwia się metodą PAS, gdzie grzybnia
wybarwia się na kolor czerwony, a tło preparatu na kolor jasnozielony. Inne barwienia, to wykorzystanie barwnika Wrighta lub Giemsy, gdzie grzybnia wy-barwia się na kolor niebieski. W stosowanej metodzie Gridleya grzybnia barwi się na kolor purpurowoczer-wony, a tło preparatu na żółto. Niektóre grzyby należą-ce do kropidlaków dobrze barwią się również kwaśną fuksyną.
Wyhodowanie grzybów Candida, Aspergillus oraz
Cryptococcus w posiewach daje podstawę rozpoznania
mikologicznego. Materiałem do badań hodowlanych grzybów są wycinki tkanek lub narządów, homogeni-zowane lub rozdrabniane przy pomocy jałowych kulek. Tak przygotowany materiał posiewany jest na podłoże płynne lub stałe Sabourauda. Posiewy są inkubowane przez okres 24 godzin. Wielokrotne przesianie koloni na świeże podłoża pozwala na izolację czystych szcze-pów. Różnicowanie grzybów opiera się na makrosko-powym i mikroskomakrosko-powym wyglądzie hodowli, gdzie uwzględnia się wielkość, rodzaj zarodników, sposób ich układania się oraz wielkość strzępek lub pseudo-strzępek. Obecnie powszechne zastosowanie znajdują gotowe podłoża np. Candida ID Agar (bioMérieux), Glabrata RTT (Fumouze Diagnostics, Levallois-Perret Cedex) oraz Chromagar Candida (Becton Dickinson), które pozwalają na określenie gatunku w oparciu o barwę kolonii. Testy te umożliwiają rozpoznanie
Candida glabrata w ciągu kilkudziesięciu minut. Do
identyfikacji Candida albicans, gdzie jedną z cech charakterystycznych jest wytwarzanie chlamydospor, wykorzystywane jest podłoże RAT-Medium (bio-Mérieux). Testy te pozwalają wykryć enolazę, β-glukan oraz D-arabinitol (30). Do wykrycia Aspergillus we krwi oraz w płynach ustrojowych wykorzystywany jest również gotowy test pozwalający na wykrycie anty-genu galaktomannozowego. Jedną z dokładniejszych metod jest także zakażanie zwierząt doświadczalnych (myszy, króliki, świnki morskie) wyizolowanym ma-teriałem podawanym pozaotrzewnowo lub dojądrowo. Po śmierci zwierząt pobierane są do dalszych badań narządy miąższowe.
Pozostałe techniki badawcze
Najbardziej zaawansowane techniki obejmują wykorzystanie badań immunohistochemicznych z przeciwciałami monoklonalnymi (EB-A1 oraz WF-AF-1), immunofluorescencję oraz metody biologii
molekularnej, np. PCR opartej na analizie RNA i DNA, gdzie niewątpliwą jej zaletą jest stosunkowo krótki czas przeprowadzanego badania oraz wysoka czułość i swoistość (12, 21, 30). Stwierdzono również wysoką czułość testów opartych na metodzie immunoenzyma-tycznej ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), która wynosi od 70%-100% (30). Wykorzystanie RTG w przypadku podejrzenia grzybicy płuc może dawać obraz mało charakterystyczny i stwierdzane jest je-dynie zagęszczenie tkanki płucnej lub nacieki miąż-szowe. W przypadku aspergilozy może wystąpić tzw. efekt halo (obraz mlecznego szkła wokół zmiany) lub odwróconego halo (obraz mlecznego szkła w środku zmiany). Znacznie dokładniejsza jest wysokorozdziel-cza tomografia komputerowa HRCT (high resolution computer tomography). Pozwala ona na wykrycie już we wczesnej fazie zmian w oskrzelikach płucnych.
Rozpoznanie wieloukładowych zakażeń grzybi-czych jest stawiane zbyt późno. Często wynika to z bardzo nietypowych objawów klinicznych. W co-dziennej praktyce klinicznej badania serologiczne oraz molekularne nie są wykorzystywane, a posiewy dają wyniki dodatnie zbyt późno (10). Praktyka kliniczna powinna zakładać wprowadzenie schematu postępo-wania w terapii przeciwgrzybicznej przy podejrzeniu zakażenia podobne jak u ludzi. Organizacja IDSA (Infection Disease Society of America) opublikowała schemat postępowania przeciwgrzybiczego dotyczący pacjentów z obniżoną odpornością w przypadku stoso-wania między innymi cytostatyków (13, 26). System diagnostyki inwazyjnych zakażeń grzybiczych w sta-nach obniżonej odporności zakłada wprowadzanie czterech etapów postępowania przeciwgrzybiczego obejmujących profilaktykę, leczenie empiryczne, le-czenie wyprzedzające oraz lele-czenie potwierdzonych grzybic narządowych (tab. 2).
Znaczny spadek odporności pojawiający się na skutek stosowania cytostatyków powinien być wska-zaniem do zastosowania odpowiednich metod postępo-wania przeciwgrzybiczego. Wynika to często z braku wczesnych objawów klinicznych oraz z małej czułości badań mikrobiologicznych, co w wielu przypadkach znacznie opóźnia diagnozę. Nie w każdym przypadku gorączka neutropeniczna ma podłoże grzybicze i dlate-go wprowadzenie odpowiedniej terapii antybiotykowej opartej nie tylko na najpopularniejszej w lecznictwie weterynaryjnym amfoterycynie B, ale także na innych
Tab. 2. Etapy postępowania przeciwgrzybiczego
Forma leczenia Wskazanie
Leczenie profilaktyczne Długotrwała neutropenia
Leczenie empiryczne Długotrwała neutropenia oraz gorączka trwająca powyżej 5 dni Leczenie wyprzedzające Długotrwała neutropenia, gorączka trwająca powyżej 5 dni,
dodatnie wyniki badań dodatkowych (tomografia komputerowa, obecność antygenów grzybiczych w surowicy – galaktomann i/lub glukan, dodatnie wyniki potwierdzające obecność grzybów w oparciu o metodę PCR)
Med. Weter. 2014, 70 (6) 329
lekach jest prawidłowym krokiem w kierunku zapew-nienia ochrony organizmu przed wtórnymi grzybicami układowymi.
Problem mogą stanowić wysokie koszty leczenia oraz działania uboczne leków. Stosowanie amfote-rycyny B wiąże się z jej dużą nefrotoksycznością. Znacznie lepszym rozwiązaniem jest stosowanie jej postaci w formie liposomalnej (AmBisome), roztworu koloidalnego w siarczanie cholesterolu (Amphocil) lub też w postaci kompleksu lipidowego (Abelcet). Przeprowadzone badania wskazują na dużo niższą nefrotoksyczność tych preparatów i wynosi ona 15% dla Amhocil, 20% dla AmBisome i 25% dla Abelcet wobec aż 30-50% dla klasycznej AmB.
Możliwość wystąpienia wieloukładowych zakażeń grzybiczych należy zawsze brać pod uwagę przy braku reakcji na antybiotyki o szerokim spektrum działania oraz w przypadku długotrwałego leczenia cytostatycz-nego. U zwierząt długotrwale leczonych cytostatyka-mi, będących w stadium głębokiej immunosupresji, należy rozważyć wprowadzenie podobnie jak u ludzi leczenia empirycznego. Za celowością tego typu po-stępowania mogą przemawiać ujemne wyniki badań radiologicznych, posiewów oraz metod serologicznych wynikających z zaburzeń odporności humoralnej.
Piśmiennictwo
1. Batura-Gabryel H., Kuźnar B.: Inwazje wieloogniskowe grzybami z rodzaju Candida i kandydoza jamy ustnej u chorych na raka płuca i przewlekłą obtu-racyjną chorobę płuc. Mikol. Lek. 2000, 7 (supl. 1), 66-67.
2. Biegańska M., Dworecka-Kaszak B.: Charakterystyka szczepów Candida sp. izolowanych w latach 2001-2002 od zwierząt. Mikol. Lek. 2003, 10, 275-283. 3. Biliński P., Seferyńska I., Warzocha K.: Diagnostyka i leczenie układowych
zakażeń grzybiczych w onkohematologii. Onkol. Prak. Klin. 2008, 4, 15-24. 4. Bray J. P., White R. A. S., Lascelles B. D. X.: Treatment of canine nasal aspergillosis with a new non-invasive technique: failure with enilconazole. J. small Anim. Pract. 1998, 39, 223-226.
5. Brown M. R., Thompson C. A., Mohammed F. M.: Systemic candidiasis in an apparently immunocompetent dog. J. Vet. Diagn. Invest. 2005, 17, 272-276. 6. Clark T. A., Hajjech R. A.: Recent trends in the epidemiology of invasive
mycoses. Curr. Opin. Infect. Dis. 2002, 15, 569-574.
7. Davidson A. P., Mathews K. G., Koblik P. D., Theon A.: Diseases of the nose and nasal sinuses, [w:] Ettinger S. J. (ed.): Textbook of Veterinary Internal Medicine. Saunders W. B., Philadelphia 2000, 1003-1025.
8. Dzierżanowska D.: Leki przeciwgrzybicze stosowane w leczeniu grzybic układowych, [w:] Zakażenia grzybicze – wybrane zagadnienia. Alfa-Medica Press, Bielsko-Biała 2006, 92-125.
9. Dzierżanowska D., Dąbkowska M., Garczewska B.: Patomechanizm i obraz kliniczny zarażeń grzybiczych, [w:] Grzybice narządowe. Med. Prakt., Kraków 2003, 13-20.
10. Ellepola A. N., Morrison C. J.: Laboratory diagnosis of invasive candidiasis. J. Microbiol. 2005, 43, 65-84.
11. Forward Z. A., Legendre A. M., Khalsa H. D.: Use of intermittent bladder infusion with clotrimazole for treatment of candiduria in a dog. JAVMA 2002, 220, 1496-1490.
12. Hope W. W., Walsh T. J., Denning D. W.: Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis. Lancet Infect. Dis. 2005, 5, 609-622.
13. Hughes W. T., Armstrong D., Bodey G. P.: Guidelines for the Use of Antimicrobial Agents in Neutropenic Patients with Cancer. Clin. Infect. Dis. 2002, 34, 730-751.
14. Keller B., Scheibl P., Bleckmann E., Hoedemaker M.: Differentation of east in mastitis milk. Mycoses 2000, 43 (supl. 1), 17-19.
15. Kitamura H., Anri A., Fse K., Seo M., Itakura C.: Chronic mastitis caused by Candida maltoza in a cow. Vet. Pathol. 1990, 27, 465-466.
16. Krohne S. G.: Canine systemic fungal infections. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice 2000, 30, 1063-1090.
17. Maertens J.: Evaluating prophylaxis of invasive fungal infections in patients with haematologic malignancies. E. J. Haematol. 2007, 78, 275-282.
18. Marr K. A., Carter R. A., Crippa F., Wald A., Corey L.: Epidemiology and outcome of mould infections in hematopoietic stem cell transplant recipients. Clin. Infect. Dis. 2002, 34, 909-917.
19. Martino R., Viscoli C.: Empirical antifungal therapy in patients with neutro-penia and persistent or recurrent fever of unknown origin. B. J. Haematol. 2005, 132, 138-154.
20. Medway W.: Some bacterial and mycotic diseases of marine mammals. JAVMA 1980, 177, 831-834.
21. Morace G., Pagamo L., Sanguinetti M.: PCR-resctriction enzyme analysis for detection of candida DNA in blood from febrile patients with hematological malignancies. J. Clin. Microbiol. 1999, 37, 1871-1875.
22. Mueller R. S., Bettenay S. V., Shipstone M.: Cutaneous candidiasis in a dog caused by Candida guilliermondi. Vet. Rec. 2002, 150, 728-730.
23. Ochman E.: Diagnostyka mikrobiologiczna i serologiczna układowych zakażeń grzybiczych, [w:] D. Dzierżanowska (red.): Zakażenia grzybicze – wybrane zagadnienia. Alfa-Medica Press, Bielsko-Biała 2006, 50-78.
24. Pagano L., Ricci P., Tonso A., Nosari A., Cudillo L., Montillo M., Cenacchi A.,
Pacilli L., Fabbiano F., Favero A. del.: Mucormycosis in patients with
hae-matological malignancies: a retrospective clinical study of 37 cases. Br. J. Haematol. 1997, 99, 331-336.
25. Pagano L., Valentini C. G., Cara M., Fianchi L.: Zygomycosis: Current ap-proaches to management of patients with haematological malignancies. Br. J. Haematol. 2009, 146, 597-606.
26. Pappas P. G., Kauffman C. A., Andes D.: Infection diseases Society of America. Clinical practice guidelines for the management of candidiasis; 2009 update by the Infectious Diseases Society of America. Clin. Infect. Dis. 2009, 48, 503-535.
27. Perfect J. R., Marr K. A., Walsh T. J.: Voriconazole treatment for less-common, emerging or refractory fungal infections. Clin. Infect. Dis. 2003, 36, 1122-1131. 28. Pizzo P. A.: Management of fever in patients with cancer and treatment –
in-duced neutropenia. N. Engl. J. Med. 1993, 328, 1323-1332.
29. Prentice A. G., Glasmacher A., Hobson R. P., Schey S., Barnes R. A., Donnelly
J. P., Jackson G.: Guidelines on the management of invasive fungal
infec-tion during therapy for haematological malignancy. British Committee for Standards in Haematology. March 2010.
30. Yeo S. F., Wong B.: Current status of nonculture methods for diagnosis of invasive fungal infection. Clin. Microbiol. Rev. 2002, 15, 465-484. Adres autora: dr Jacek Piórkowski, ul. Głęboka 30, 20-060 Lublin; e-mail: jacek.piorkowski@up.lublin.pl
