Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 64 (4), 444-446, 2008

Medycyna Wet. 2008, 64 (4A) 444

Praca oryginalna Original paper

Fizjologicznie w pochwie zdrowych suk znajduje siê flora bakteryjna, sk³adaj¹ca siê z bakterii komensalicz-nych i warunkowo chorobotwórczych. W jej sk³ad wcho-dz¹ g³ównie b-hemolizuj¹ce paciorkowce, Pasteurella multocida, E. coli i Staphylococcus intermedius, rzadziej stwierdzane s¹ Proteus sp., Pseudomonas sp., Haemo-philus somnus i mykoplazmy (9, 15, 17). Przez wiele lat s¹dzono natomiast, ¿e bakterie nie wystêpuj¹ w macicy zdrowych suk (15). Dopiero niedawno w badaniach bak-teriologicznych wymazów pobranych z macic suk pod-danych eutanazji wykazano po raz pierwszy obecnoœæ bakterii w tym narz¹dzie u zwierz¹t bez objawów choro-bowych (4). Przy¿yciowe pobieranie próbek z macicy do badania bakteriologicznego jest bardzo trudne ze wzglê-du na specyficzn¹ budowê pochwy i szyjki macicy suk. Jest to mo¿liwe dopiero przy zastosowaniu techniki en-doskopowej (9, 17).

Stwierdzono wystêpowanie ró¿nic w sk³adzie flory bakteryjnej pochwy w zale¿noœci od hodowli, z jakiej pochodzi³y suki oraz miêdzy rasami psów (5, 16). Nie-wiele dotychczas wiadomo o sk³adzie flory bakteryjnej w poszczególnych fazach cyklu p³ciowego. Problematy-ce tej poœwiêcono zaledwie kilka prac. Wynika z nich, ¿e faza cyklu p³ciowego wydaje siê wywieraæ wp³yw na za-siedlenie bakteryjne narz¹du rozrodczego suk (6, 9, 17). Prace dotycz¹ce wystêpowania bakterii w macicy suk i wp³ywu faz cyklu p³ciowego na sk³ad flory bakteryjnej pochwy i macicy s¹ nieliczne (4, 6, 9, 17), zaœ w kraju nie by³y dotychczas podejmowane.

Celem niniejszych badañ by³o porównanie zasiedlenia bakteryjnego pochwy i macicy suk oraz okreœlenie zmian w sk³adzie flory bakteryjnej tych narz¹dów w ró¿nych fazach cyklu rujowego.

Materia³ i metody

Zwierzêta. Badania przeprowadzono na 28 sukach mieszañ-cach w wieku 3-7 lat o masie cia³a 7-20 kg. W okresie badañ zwierzêta przebywa³y w pomieszczeniach Zespo³u Rozrodu Zwierz¹t. ¯ywione by³y pe³noporcjow¹ karm¹ przemys³ow¹, raz dziennie. Zwierzêta mia³y wolny dostêp do wody i by³y wyprowadzane na spacer trzy razy dziennie.

Okreœlanie faz cyklu rujowego. Próbki do badañ pobiera-no we wszystkich fazach cyklu rujowego: spokoju p³ciowego czyli bezrujowej (anoestrus), przedrujowej (prooestrus), rui w³aœciwej (oestrus) i porujowej (metoestrus). Okreœlano je ba-daniem klinicznym (ogl¹danie i omacywanie sromu, endosko-pia pochwy), badaniem cytologicznym wymazów pochwowych oraz poprzez oznaczanie poziomu progesteronu w osoczu krwi (2, 19).

Wymazy z pochwy pobierano przy pomocy ja³owych wy-mazówek (HAGMED S.C., Rawa Mazowiecka) z przedniego jej odcinka, po wprowadzenia wziernika pochwowego. Nastêp-nie wykonywano rozmaz na odt³uszczonym szkie³ku podsta-wowym, utrwalano w mieszaninie alkoholu etylowego i eteru (1 : 1) i barwiono metod¹ Shorra (8). Preparaty oceniano w mikroskopie œwietlnym Olympus BX50F4.

Próbki krwi (3 ml) pobierano z ¿y³y dostopowej do hepary-nizowanych probówek. Koncentracjê progesteronu w osoczu oznaczano metod¹ RIA opisan¹ przez Hoffmanna i wsp. (10). Czu³oœæ metody wynosi³a 1,34 nmol/l, zaœ zmiennoœæ we-wn¹trz- i zewn¹trzseryjna, odpowiednio, 6,7% i 9,8%.

Flora bakteryjna pochwy i macicy

w ró¿nych fazach cyklu rujowego suk*

)

TOMASZ JANOWSKI, S£AWOMIR ZDUÑCZYK, IWONA BORKOWSKA, ANDRZEJ JURCZAK, MA£GORZATA PODHALICZ-DZIÊGIELEWSKA

Zespó³ Rozrodu Zwierz¹t Katedry Nauk Klinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UWM, ul. Oczapowskiego 14, 10-178 Olsztyn

Janowski T., Zduñczyk S., Borkowska I., Jurczak A., Podhalicz-Dziêgielewska M.

Vaginal and uterine bacterial flora at different stages of the estrus cycle in bitches

The aim of this study was to compare the bacterial flora of canine vagina and uterus and assess its composition during the estrus cycle. From 28 healthy bitches, vaginal smears and samples of uterine secretion by means of endoscopy were collected during the estrus cycle (anestrus, proestrus, estrus, metestrus) for bacteriological investigation. Similar bacterial flora were present in the vagina and uterus of bitches. Lactobacillus sp., a-hemolytic streptococci, Staphylococcus intermedius, Pasteurella multocida and E. coli were most frequently found. The average number of isolates was 2.2 per vaginal sample and 1.4 per uterine sample, the uterine samples also showed a lower bacterial count. The composition of vaginal and uterine bacterial flora and amounts of bacteria varied during the estrus cycle. The highest bacterial count occurred during proestrus.

Keywords: bitches, bacterial flora, vagina, uterus, estrus cycle

*) _{Badania wykonane w ramach grantu 3 P06K 01426 finansowanego przez}

Medycyna Wet. 2008, 64 (4A) 445

Badania bakteriologiczne. Wyma-zy z pochwy pobierano prWyma-zy pomocy ja³owych wymazówek (HAGMED S.C., Rawa Mazowiecka) z przednie-go odcinka pochwy po wprowadzeniu wziernika. Nastêpnie umieszczano je w medium transportowym i bez-zw³ocznie przekazywano do badania bakteriologicznego w Pracowni Bak-teriologicznej Wojewódzkiej Stacji Sanitarno-Epidemiologicznej w Olsz-tynie.

Z macicy próbki do badañ bakte-riologicznych pobierano przy pomo-cy endoskopu i zestawu kateterów. W zale¿noœci od wielkoœci suki stoso-wano kompaktowy cystouretroskop (Wolf GmbH, Knittlingen, Niemcy) lub histeroskop (Olympus, Hamburg, Niemcy). Po odka¿eniu sromu ja³owy endoskop wprowadzano do pochwy pod fa³d grzbietowy. Po uwidocznie-niu czêœci pochwowej szyjki wprowa-dzano przez jej kana³ kateter zewnêtrz-ny (Arrow, Reading, USA) z mandry-nem na 3-5 cm do macicy. Po

usuniê-ciu mandrynu wprowadzano kateter wewnêtrzny (Balton, War-szawa) na taka odleg³oœæ, aby jego koniec wystawa³ oko³o 2 cm z kateteru zewnêtrznego. Nastêpnie infundowano do ma-cicy 2 ml ja³owego p³ynu fizjologicznego i zasysano go po-nownie do strzykawki. P³yn umieszczano w ja³owej probówce i przekazywano niezw³ocznie do badania bakteriologicznego. Bli¿sze szczegó³y dotycz¹ce techniki endoskopii narz¹du rod-nego u suk zawarte s¹ we wczeœniejszej pracy w³asnej (7).

Badania bakteriologiczne wykonywano wed³ug rutynowych metod. W kierunku mikroflory tlenowej próbki posiewano na bulion, agar zwyk³y, agar z krwi¹, pod³o¿e Levina, Chapmana i Sabourauda. Pod³o¿a inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 godziny (pod³o¿e Chapmana przez 48 godzin, Sabourouda przez 5 dni), nastêpnie sporz¹dzano rozmazy i barwiono meto-d¹ Grama. Pa³eczki Gram-ujemne identyfikowano przy pomo-cy szeregu biochemicznego i testów firmowych ID 32 E i ID 32 GN (Bio-Merieux), zaœ gronkowce i paciorkowce za pomo-c¹ testów Slidex Staph-Kit i Slidex Strepto-Kit A, B, C, D, F, G (Bio-Merieux). W kierunku flory beztlenowej posiewy wy-konywano na pod³o¿a Szedlera i Wrzoska, które inkubowano w atmosferze CO₂ (system Genbo-anaer, Bio-Merieux) w tem-peraturze 37°C przez 48 godzin.

Liczebnoœæ izolatów okreœlano wed³ug nastêpuj¹cego sche-matu: poni¿ej 30 kolonii – nieliczne, 30-100 kolonii – liczne, powy¿ej 100 kolonii – bardzo liczne.

Wyniki i omówienie

Tabela 1 przedstawia szczepy bakterii wyizolowane z pochwy i macicy suk w poszczególnych fazach cyklu rujowego. Stwierdzono, ¿e sk³ad flory bakteryjnej pochwy i macicy suk ulega³ znacz¹cym zmianom w przebiegu cyk-lu rujowego, polegaj¹cych na znikaniu pewnych rodza-jów bakterii oraz pojawianiu siê nowych.

W tab. 2 podano œredni¹ liczbê izolatów z pochwy i macicy suk w poszczególnych fazach cyklu rujowego. Z próbek pobranych z pochwy izolowano we wszystkich fazach cyklu rujowego wiêcej szczepów bakteryjnych ni¿ z macicy. Przeciêtnie izolowano z pochwy 2,2 szczepy bakteryjne z jednej próby, natomiast z macicy 1,4.

Tabela 3 przedstawia liczebnoœæ izolatów z pochwy i macicy suk w cyklu rujowym. Wynika z niej, ¿e liczba kolonii uzyskiwanych z wymazów pochwowych by³a wiêksza ni¿ z próbek pobranych z macicy, w których naj-czêœciej obserwowano nieliczny wzrost bakterii. Bardzo liczne izolaty stwierdzano jedynie w próbkach pobranych z macicy w fazie przedrujowej.

W Polsce nie przeprowadzono dotychczas badañ nad wystêpowaniem bakterii w pochwie i macicy zdrowych suk. Dostêpne dane dotycz¹ jedynie zwierz¹t z zaburze-niami procesów rozrodu i maj¹ fragmentaryczny charak-ter. Birger i Staroniewicz (5) izolowali z pochwy suk z zespo³em

endometritis--pyometra g³ównie szcze-py E. coli (75% przypad-ków), natomiast znacznie rzadziej Streptococcus sp. (15,7% suk). Œmielewska--£oœ i wsp. (16) izolowali z pochwy suk z problema-mi rozrodu w oko³o 40% przypadków czyste kultu-ry Staphylococcus aureus, Staphylococcus interme-dius, Streptococcus zooepi-demicus i E. coli. W

bada-j ó rt s u o n b o r D a z a F a w o j u r z e b przedrujowa ruiw³aœciwej porujowa a w h c o p macica pochwa macica pochwa macica pochwa macica a d i c o tl u m a ll e r u e t s a P 21,4 10,7 21,4 10,7 14,3 28,6 10,7 s u i d e m r e t n i s u c c o c o l y h p a t S 28,6 21,4 17,1 10,7 21,4 39,3 14,3 s i n a c s u c c o c o t p e rt S 39,3 17,1 14,3 il o c . E niehemolzi. 14,3 17,1 il o c . E hemolzi. 25,0 28,6 14,3 21,4 28,6 p s s u c c o c o t p e rt S . a-hemolzi. 71,4 28,6 32,1 10,7 39,3 10,7 28,6 21,4 . p s s e c y m o n it c A 10,7 10,7 10,7 21,4 17,9 . p s s u ll i c a b o t c a L 71,4 100,01 100,01 78,6 78,6 71,4 39,3 e n m e j u o z a l u g a o k e c w o k n o r G 17,9 10,7 10,7 10,7 . p s s u c c o c o r c i M 14,3 10,7 21,4 14,3 10,7 . p s s u c c o c o r e t n E 10,7 17,1 17,1 . p s s u ll i c a B 14,3 10,7 10,7 17,1 e n n I 7,1 10,7 17,1 14,3 10,7

Tab. 1. Szczepy bakterii wyizolowane z pochwy i macicy suk w poszczególnych fazach cyklu rujowego (% suk)

u l k y c a z a F o g e w o j u r Pochwa Macica a w o j u r z e B 2,3 1,0 a w o j u r d e z r P 2,6 1,8 j e w i c œ a ³ w i u R 1,9 1,4 a w o j u r o P 2,1 1,4 m e l ó g O 2,2 1,4

Tab. 2. Œrednia liczba izolatów z pochwy i macicy suk w po-szczególnych fazach cyklu ru-jowego

Tab. 3. Liczebnoœæ izolatów z pochwy i macicy suk w cyklu rujowym u l k y c a z a F o g e w o j u r e n z c il e i N Liczne Bardzo ilczne a w h c o p macica pochwa macica pochwa macica o g e w o i c ³ p u j o k o p S 52,1 66,7 43,5 33,3 24,3 – a w o j u r d e z r P 50,0 44,4 23,1 33,3 26,9 21,2 j e w i c œ a ³ w i u R 57,9 60,0 26,3 40,0 15,8 – a w o j u r o P 61,9 100,01 14,3 – 23,8 –

Medycyna Wet. 2008, 64 (4A) 446

niach nad wystêpowaniem bakterii w macicy suk z ze-spo³em endometritis-pyometra stwierdzano g³ównie szcze-py E. coli, znacznie rzadziej paciorkowce i gronkowce (5, 13, 18). Generalnie trudno jednak porównywaæ bakte-ryjne zasiedlenie pochwy i macicy suk zdrowych i do-tkniêtych ciê¿kimi stanami patologicznymi.

W badaniach w³asnych wykazano wystêpowanie bak-terii w pochwie u wszystkich zwierz¹t, co pokrywa siê z wynikami innych autorów (6, 9). Natomiast Olson i Mather (15) nie stwierdzili obecnoœci bakterii w pochwie u 37% badanych suk, a Allen i Dongal (1) u 14% zwie-rz¹t. W badaniach w³asnych do najczêœciej izolowanych z pochwy suk szczepów bakterii nale¿a³y Lactobacillus sp., paciorkowce a-hemolizuj¹ce i Staphylococcus inter-medius. Podobne szczepy bakterii stwierdzali w pochwie zdrowych suk tak¿e inni autorzy (1, 6, 9, 15).

W badaniach w³asnych wykazano równie¿ obecnoœæ bakterii w macicy wszystkich zwierz¹t. Dane piœmien-nictwa na ten temat ró¿ni¹ siê znacznie. Mather i Olson (15) nie stwierdzili w ogóle wystêpowania bakterii w macicy zdrowych suk, natomiast Baba i wsp. (4) po-bierali wymazy z macic suk poddanych eutanazji i wy-izolowali bakterie z 70% próbek. Tak¿e w badaniach, w których stosowano endoskopowe techniki pobierania próbek z macicy, stwierdzono wystêpowanie drobnoustro-jów w tym narz¹dzie u zdecydowanej wiêkszoœci suk (9, 17). W macicy wystêpowa³y podobne szczepy bakterii jak w pochwie, ale z próbek pobranych z macicy izolo-wano mniej szczepów bakteryjnych w porównaniu do wy-mazów pochwowych, a liczba uzyskanych kolonii by³a mniejsza. Podobieñstwo flory bakteryjnej pochwy i ma-cicy suk podkreœlaj¹ równie¿ inni autorzy (4, 9, 17).

W fazie spokoju p³ciowego w pochwie i macicy wy-stêpowa³o niewiele bakterii. Z narz¹dów tych izolowano w tym okresie g³ównie szczepy paciorkowców a-hemoli-zuj¹cych, Pasteurella multocida i gronkowców koagula-zoujemnych. W fazie przedrujowej nast¹pi³ wzrost licz-by bakterii zarówno w pochwie, jak i macicy. W sk³adzie flory bakteryjnej macicy pojawi³y siê szczepy Staphylo-coccus intermedius, StreptoStaphylo-coccus canis, EnteroStaphylo-coccus sp. i hemolizuj¹ce szczepy E. coli. Zmiany te œwiadcz¹ o migracji bakterii z pochwy do macicy i s¹ zapewne wy-nikiem rozwarcia szyjki macicy pod wp³ywem wzrasta-j¹cej w tej fazie cyklu rujowego koncentracji estrogenów (11). W fazie rui w³aœciwej stwierdzono eliminacjê z macicy szczepów Pasteurella multocida i E. coli. By³o to przypuszczalnie zwi¹zane z antagonistycznym oddzia-³ywaniem bakterii z rodzaju Lactobacillus. Pod wp³ywem estrogenów w komórkach nab³onkowych nastêpuje bo-wiem wzrost zawartoœci glikogenu, który jest naturalnym substratem dla pa³eczek kwasu mlekowego. Jest on przez nie rozk³adany, w wyniku czego powstaje kwas mlekowy i nastêpuje obni¿enie pH. Zjawisko to odgrywa wa¿n¹ rolê w mechanizmach obronnych narz¹du rodnego, zapo-biegaj¹c nadmiernemu namna¿aniu siê patogennych bak-terii (3). Estrogeny wydaj¹ siê równie¿ zwiêkszaæ odpor-noœæ nieswoist¹ organizmu zwierz¹t. Powszechnie znane jest, ¿e w okresie rui macica zwierz¹t jest ma³o wra¿liwa na zaka¿enia bakteryjne (12, 14). W fazie porujowej obec-noœæ bakterii w macicy by³a mniejsza. By³o to przypusz-czalnie zwi¹zane z ograniczeniem mo¿liwoœci ich migra-cji z pochwy do macicy. Wzrost koncentramigra-cji

progestero-nu w tej fazie cyklu powoduje bowiem zamkniêcie szyjki macicy (11). W badaniach w³asnych œrednia koncentra-cja progesteronu w fazie porujowej wynosi³a 38,5 ± 9,8 nmol/l. Odpowiada³a ona wartoœciom podawanym przez innych autorów (2, 11). W piœmiennictwie jest niewiele informacji poœwiêconych wystêpowaniu bakterii w poch-wie i macicy suk w przebiegu cyklu rujowego. Stpoch-wier- Stwier-dzono, ¿e w okresie cieczki nastêpuje wzrost liczebnoœci bakterii w pochwie suk (1). W okresie przedrujowym izo-lowano istotnie czêœciej szczepy Pasteurella multocida i b-hemolizuj¹cych paciorkowców ni¿ w pozosta³ych fazach cyklu p³ciowego (6). Wykazano te¿, ¿e zmianom ulega równie¿ sk³ad flory bakteryjnej macicy (9, 17). Po-twierdzaj¹ to wyniki uzyskane w badaniach w³asnych.

Z przeprowadzonych badañ wynika, ¿e w przebiegu cyklu rujowego wystêpuje zmiennoœæ sk³adu i liczeb-noœci flory bakteryjnej pochwy i macicy suk. Jest to przy-puszczalnie zwi¹zane ze zmianami hormonalnymi zacho-dz¹cymi podczas cyklu rujowego, które wywieraj¹ wp³yw na warunki panuj¹ce w uk³adzie rozrodczym oraz na na-rz¹dow¹ i ogóln¹ odpornoœæ nieswoist¹ zwierz¹t. Wydaje siê, ¿e z punktu widzenia etiopatogenezy bakteryjnych schorzeñ macicy, istotne znaczenie mo¿e odgrywaæ wzras-taj¹ce zasiedlenie macicy drobnoustrojami w okresie przedrujowym i rui w³aœciwej bêd¹ce skutkiem otwartej szyjki macicy. Zaka¿enie bakteryjne macicy uznawane jest za istotny czynnik w rozwoju ropomacicza u suk (5, 19).

Piœmiennictwo

1.Allen W., Dagnall G. J. R.: Some observations on the aerobic bacterial flora of the genital tract of the dog and bitch. J. Small. Anim. Pract. 1982, 23, 325-335. 2.Arbeiter K.: Anwendung von Hormonen in der Reproduktion von Hund und

Katze, [w:] Döcke E. (red.): Veterinärmedizinische Endokrinologie. Gustav Fischer Verlag, Jena-Stuttgart 1994, 823-841.

3.Askienazy-Elbhar M.: Vaginal flora and genital infections. Validity of 2 markers: vaginal pH and flora score. Gynaecol. Obstet. Fert. 2000, 28, 502-508. 4.Baba E., Hata H., Fukata T., Arakawa A.: Vaginal and uterine microflora of adult

dogs. Am. J. Vet. Res. 1983, 44, 606-609.

5.Birger M., Staroniewicz Z.: Rola bakterii w zespole endometritis-pyometra u suk. Medycyna Wet. 1996, 52, 245-248.

6.Bjurström L., Linde-Forsberg C.: Long-term study of aerobic bacteria of the genital tract in breeding bitches. Am. J. Vet. Res. 1992, 53, 665-669.

7.Borkowska I., Jurczak A., Leœnik M., Janowski T.: Endoskopia dróg rodnych suk. Medycyna Wet. 2003, 59, 297-299.

8.Dreier H.-K.: Genitaltrakt. [w:] Kraft W., Dürr U. M. (red.): Klinische Labor-diagnostik in der Tiermedizin. Schattauer Verlag, Stuttgart, New York 1999, 201-211.

9.Günzel-Apel A.-R., Lübke A., Rohde J.: Vergleichende Untersuchung der vagina-len und uterinen Zytologie und Keimflora im Sexualzyklus und Puerperium von Beaglehündinnen. Tierärztl. Praxis 1999, 27(K), 112-119.

10.Hoffmann B., Kyrein H. J., Ender M. L.: An efficient procedure for the determina-tion of progesterone by radioimmunoassay applied to bovine peripheral plasma. Hormone Res. 1973, 4, 302-310.

11.Hoffamnn B., Riesenbeck A., Klein R.: Reproductive endocrinology of bitches. Anim. Reprod. Sci. 1996, 42, 275-288.

12.Hussain A. M., Daniel R.: Studies on some aspects of neutrophil functions and uterine defenses in cows during the estrous cycle. Reprod. Dom. Anim. 1991, 26, 290-296.

13.Krzy¿anowski J., Wawron W., Krakowski L., Kostro K., Wrona Z., Szczubia³ M., Piech T., Kusy R.: Badania nad stanem nieswoistych mechanizmów obronnych u suk z ropomaciczem. Medycyna Wet. 2000, 56, 382-385.

14.Nomura K., Masooka K., Shimada Y.: Experimental production of canine pyo-metra by inoculation with E. coli into the uterus with the cervix not ligated. J. Jap. Vet. Med. Assoc. 1988, 41, 95-99.

15.Olson P. N., Mather E. C.: Canine vaginal and uterine bacterial flora. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1978, 172, 708-711.

16.Œmielewska-£oœ E., Klimentowski S, Rypu³a K.: Udzia³ zaka¿eñ herpeswiruso-wych, chlamydiowych i bakteryjnych w niep³odnoœci u suk. ¯ycie Wet. 1997, 72, 17-19.

17.Watts J. R., Wright P. J., Whithear K. C.: Uterine, cervical and vaginal microflora of the normal bitch throughout the reproductive cycle. J. Small Anim. Pract. 1996, 37, 54-60.

18.Wernicki A., Krzy¿anowski J., Puchalski A.: Characterization of Escherichia coli strains associated with canine pyometra. Polish J. Vet. Sci. 2002, 5, 51-56. 19.Zduñczyk S., Janowski T.: Zaburzenia rozrodu psów i kotów. UWM, Olsztyn 2002.

Adres autora: prof. dr hab. Tomasz Janowski, ul. Oczapowskiego 14, 10-718 Olsztyn; e-mail: jantom@uwm.edu.pl