Medycyna Wet. 2006, 62 (6) 683
Praca oryginalna Original paper
Reaktywne formy tlenu (RFT) s¹ zwi¹zkami bar-dzo reaktywnymi i odpowiadaj¹ za oksydacyjne uszko-dzenia struktur tkankowych. Alkohol etylowy jest jed-nym z czynników indukuj¹cych wytwarzanie reaktyw-nych form tlenu (RFT) w organizmie, a jego toksycz-noæ zale¿y, miêdzy innymi, od wywo³anego stresu oksydacyjnego. Poza tym etanol ma bezporedni wp³yw na aktywacjê fosfolipazy A2 i A1, zwiêkszone uwalnianie kwasu arachidonowego (AA) z b³on bio-logicznych i produkcjê reaktywnych form tlenu (RFT) w wyniku aktywacji kaskady AA. Niekiedy genero-wanie RFT jest tak intensywne, ¿e zaburza naturaln¹ równowagê pomiêdzy ich produkcj¹ a potencja³em antyoksydacyjnym ustroju. RFT reaguj¹ z lipidami b³on komórkowych, co prowadzi do powstawania nadtlen-ków lipidowych, które s¹ metabolizowane do aldehy-du malonowego (MDA) i hydroksyalkenali. Peroksy-dacja lipidów b³on komórkowych prowadzi do zabu-rzeñ funkcji komórek i apoptozy (9-11).
Niebezpieczeñstwo procesów peroksydacyjnych wynika z mechanizmu ³añcuchowego rozprzestrzenia-nia siê reakcji wolnorodnikowych w nastêpuj¹cych po sobie fazach: inicjacji, prolongacji, terminacji i reini-cjacji (1, 3, 7). Pojawienie siê sprzê¿onych dienów (CD) jest dowodem rozpoczynaj¹cego siê procesu per-oksydacji. Prolongacja polega na dalszych reakcjach rodników alkilowych z tlenem i tworzeniu rodników
nadtlenkowych, które reaguj¹ z kwasami t³uszczowy-mi b³on komórkowych, co prowadzi do powstawania hydronadtlenków kwasów t³uszczowych oraz wolnych rodników alkilowych zdolnych do dalszej reakcji. Ter-minacja procesu wolnorodnikowego polega na rekom-binacji wolnych rodników i powstania produktu, któ-ry nie jest wolnym rodnikiem. Prowadzi do powstania zmodyfikowanych, uszkodzonych cz¹steczek lipidów, ketokwasów i hydroksykwasów oraz zwi¹zków lipi-dowo-bia³kowych. W obecnoci jonów ¿elaza i mie-dzi mo¿e zachomie-dziæ reakcja reinicjacji, w której z pro-duktów peroksydacji hydronadtlenków lipidowych powstaj¹ znów rodniki. Sam alkohol etylowy jest zmiataczem rodnika hydroksylowego (3), a produk-tem tej reakcji jest wysoce toksyczny aldehyd octowy, który mo¿e tworzyæ addukty z bia³kami, kwasami nu-kleinowymi i innymi cz¹stkami, zaburzaj¹c budowê i funkcjê komórek (3, 9).
Celem pracy by³o przeledzenie wp³ywu alkoholu etylowego podawanego szczurom do¿o³¹dkowo na dynamikê zmian w systemie antyoksydacyjnym orga-nizmu i peroksydacjê lipidów.
Materia³ i metody
Badania przeprowadzono na 80 szczurach, samcach szczepu Wistar o masie cia³a 190-200 g, podzielonych na 4 grupy po 20 sztuk. Dowiadczenia przeprowadzono
zgod-Zaburzenia równowagi oksydacyjno-antyoksydacyjnej
u szczurów wywo³ane dzia³aniem etanolu
KRZYSZTOF LUTNICKI, EWA SZPRINGER, ANDRZEJ MARCINIAK
Katedra i Zak³ad Patofizjologii Akademii Medycznej im. F. Skubiszewskiego w Lublinie, ul. Jaczewskiego 8, 20-090 Lublin
Lutnicki K., Szpringer E., Marciniak A.
Ethanol evoked oxidation-antioxidation imbalance in rats Summary
Ethanol administration is able to induce oxidative stress, resulting in the activation of defense mechanisms, but sometimes ROF production is very intensive and disturbs the balance between its generation and antioxidant capacity. The obtained results show that concentrations of CD, HPETE and MDA in plasma after 2hr, 12hr and 24hr pos-ethanol administration were significantly higher than in the control group of animals. 50% ethanol administered orally resulted in a significant increase of lipid peroxide levels in plasma with a simultaneous increase in SOD activity throughout the entire 24 hr period of the experiment. Gpx activity was significantly higher during the first 2 hrs following ethanol administration and then decreased to become lower than in the control group at 12 and 24 hrs. TAS in plasma decreased at hr12 and hr24 following ethanol exposure. Ethanol ingestion disturbed the plasma antioxidant system and augmented lipid peroxidation in a time dependent manner. The increased MDA production was strong evidence that lipid peroxidation is the one of main mechanisms of alcoholic tissue damage.
Medycyna Wet. 2006, 62 (6) 684
nie z wytycznymi Lokalnej Komisji Etycznej ds. badañ na zwierzêtach przy Akademii Medycznej w Lublinie. Szczu-ry by³y g³odzone przez 24 godziny przed ekspeSzczu-rymentem, lecz mia³y zapewniony wolny dostêp do poide³ nape³nio-nych 10% roztworem glukozy w 0,96% NaCl. Poid³a od-stawiono na godzinê przed dowiadczeniem. Szczurom podawano stalow¹ sond¹ do¿o³¹dkow¹ 50% roztwór eta-nolu w dawce 5 ml/kg m.c., który otrzymywano przez roz-cieñczenie 96% alkoholu etylowego w 0,96% NaCl lub aplikowano im tak¹ sam¹ iloæ p³ynu fizjologicznego w gru-pie kontrolnej.
Badano wp³yw etanolu na poziom produktów peroksy-dacji w surowicy, tj.: sprzê¿onych dienów (CD), hydronad-tlenków lipidowych (HPETE) i aldehydu malonowego (MDA) oraz na aktywnoæ enzymatycznych zmiataczy wolnych rodników: dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w erytrocytach, peroksydazy glutationu (GPx) we krwi, jak równie¿ ca³kowity potencja³ antyoksydacyjny (TAS) w su-rowicy po 2, 12 i 24 godzinach od podania alkoholu.
CD i HPETE oznaczano wed³ug jodometrycznej meto-dy opisanej przez Buege i Augusta (4) w mometo-dyfikacji War-da (12). MDA oznaczano metod¹ Ledwo¿ywa (6). Aktyw-noæ SOD w erytrocytach okrelano przy pomocy zestawu Ransod (Nr kat. SD 125, Randox Lab. Ltd., UK). Aktyw-noæ GPx oznaczano przy pomocy zestawu Ransel (Nr kat. RS 505, Randox Lab. Ltd, UK). TAS w surowicy oznacza-no zestawem (Nr kat. Nx 2332, Randox Lab. Ltd, UK). Otrzymane wyniki przedstawiono w postaci rednich aryt-metycznych ± odchylenie standardowe SD i poddano ana-lizie statystycznej wed³ug testu Anova, wartoæ p < 0,001 przyjêto jako poziom wysokiej istotnoci.
Wyniki i omówienie
Uzyskane wyniki wskazuj¹, ¿e stê¿enie CD, HPETE i MDA w surowicy po 2, 12, 24 godzinach od podania etanolu by³y statystycznie istotnie wy¿sze ni¿ w gru-pie kontrolnej (ryc. 1). Co wiêcej, poziom produktów peroksydacji lipidów by³ znamiennie wy¿szy po 12 godzinach ni¿ po 2 godzinach po podaniu alkoholu i znamiennie wy¿szy po 24 ni¿ po 12 godzinach od podania etanolu. Aktywnoæ SOD wzrasta³a w ci¹gu dwóch godzin po podaniu etanolu, po czym osi¹ga³a najwy¿sz¹ wartoæ w 12. godzinie i spada³a po 24 go-dzinach, utrzymuj¹c siê jednak ci¹gle na poziomie wy¿szym ni¿ w grupie kontrolnej. Aktywnoæ GPx wzrasta³a 2 godziny po podaniu alkoholu, a nastêpnie spada³a po 12 godzinach, by po 24 godzinach osi¹g-n¹æ wartoæ znamiennie ni¿sz¹ ni¿ w grupie kontrol-nej. Poziom TAS po 2 godzinach od podania etanolu nie zmieni³ siê w sposób istotny w porównaniu z gru-pa kontroln¹, natomiast po kolejnych 12 i 24 godzi-nach znamiennie spada³ (ryc. 2).
Proces peroksydacji rozpoczyna siê szybko po po-daniu etanolu, czego wyrazem jest gwa³towny wzrost stê¿enia CD w pierwszych 2 godzinach dowiadcze-nia. W 12. i 24. godzinie dynamika peroksydacji ule-ga zmniejszeniu, gdy¿ po 2 godzinach od aplikacji alkoholu w³¹czaj¹ siê mechanizmy antyoksydacyjne, które jednak nie s¹ w stanie skutecznie zahamowaæ
procesów peroksydacji. Wzrost poziomu MDA obser-wowa³ w swych badaniach Aydin i wsp. (2) w prze-biegu chronicznego podawania etanolu.
Wzmo¿ona aktywnoæ SOD obserwowana od 2. go-dziny od podania etanolu sugeruje, ¿e zachodzi sta³y wzrost poziomu anionorodnika tlenowego. Spadek ak-tywnoci SOD obserwowany od 12.-24. godziny do wartoci wy¿szych ni¿ w grupie kontrolnej wskazuje, ¿e pierwotne procesy uszkodzenia nadal trwaj¹. Wzrost aktywnoci GPx zwi¹zany jest z dezaktywacj¹ nad-tlenku wodoru powsta³ego w reakcjach katalizowa-nych przez SOD oraz dezaktywacja nadtlenków lipi-dowych, których stê¿enie w tym czasie wzrasta. Spa-dek aktywnoci GPx jest zwi¹zany z dostêpnoci¹ glu-tationu, którego iloæ po spo¿yciu alkoholu zmniejsza siê. Jordao i wsp. (5) donosz¹ o negatywnym wp³ywie etanolu na witaminê E, bêd¹c¹ kluczowym czynnikiem nieenzymatycznego uk³adu antyoksydacyjnego oraz na poziom GSH. Mózsik i wsp. (10) obserwowali wzrost aktywnoci katalazy ju¿ po 1 minucie od podania al-koholu, po czym aktywnoæ ta powraca³a do normy. Enzym ten katalizuje inaktywacjê nadtlenku wodoru i wraz z GPx ma dzia³anie protekcyjne wobec SOD, chroni¹c dysmutazê przed inaktywacj¹ przez nadtle-nek wodoru (7). Pocz¹tek wzrostu aktywnoci SOD obserwowano ju¿ po 15 minutach, za aktywnoæ GPx mia³a ci¹g³¹ tendencjê wzrostow¹ (10).
Ryc. 1. Wp³yw etanolu na poziom produktów peroksydacji MDA w nM/g tkanki, CD w OD 233 nm, HPETE OD 353 nm
Ryc. 2. Wp³yw etanolu na aktywnoæ peroksydazy glutationu (GPx) w U/g Hb, dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w U/gHb i ca³kowity potencja³ antyoksydacyjny (TAS) w U Trolox\ml
Medycyna Wet. 2006, 62 (6) 685 Etanol podawany szczurom do¿o³¹dkowo zaburza
uk³ad antyoksydacyjny i nasila peroksydacjê lipidów. Spadek aktywnoci TAS, w sk³ad którego wchodz¹ tiole, kwas moczowy, witamina E, bilirubina i lipidy obserwowany od 12 godziny po podaniu alkoholu na-sila³ siê w czasie.
Wzrost produkcji MDA jest dowodem na udzia³ procesu peroksydacji lipidów jako g³ównego czynni-ka w mechanizmie alkoholowego uszkodzenia tczynni-kanek. Wzrost taki obserwowali Mózsik i wsp. (10) po 30 minutach od podania etanolu. Pierwsze zmiany ma-kroskopowe uszkodzonych komórek luzówki ¿o³¹d-ka pojawiaj¹ siê ju¿ po minucie od podania alkoholu, za po godzinie siêgaj¹ 50% wszystkich uszkodzeñ luzówki (9, 10). Jest interesuj¹cym, ¿e zmiany ma-kroskopowe w uszkodzonych tkankach pojawiaj¹ siê przed wzrostem poziomu MDA, bêd¹cego jednym z wyk³adników intensywnoci procesów peroksydacji, co wskazuje na ich udzia³ potencjalizuj¹cy dzia³anie czynnika agresywnego w dalszych etapach uszkodze-nia struktur tkankowych.
Pimiennictwo
1.Andrzejak R., Goch J. H., Jurga M.: Wolne rodniki i ich znaczenie w medy-cynie. Post. Hig. Med. Dow. 1995, 49, 531-549.
2.Aydin S., Ozaras R., Uzun H., Belce A., Usulu E., Tahan V., Altug T., Dumen E., Senturk H.: N-acetylcysteine reduced the effect of ethanol on antioxidant system in rat plasma and brain tissue. Tohoku J. Exp. Med. 2002, 198, 71-77.
3.Bartosz G.: Druga twarz tlenu. PWN, Warszawa 1995.
4.Buege J. A., August S. D.: Microsomal lipid peroxidation. Meth. Enzymol. 1978, 52, 302-310.
5.Jordao A. A., Chiarello P. G., Arantes M. R., Mirelles M. S., Vannucchi H.: Effect of an acute dose of ethanol on lipid peroxidation in rats: action of vitamin E. Food Chem. Toxicol. 2004, 42, 459-464.
6.Ledwo¿yw A., Michalak J., Stêpieñ A., K¹dzio³ka A.: The relationship between plasma triglicerydes, cholesterol, total lipids and lipid peroxidation products during human atherosclerosis. Clin. Chim. Acta 1986, 155, 275--284.
7.Liczmañski A. E.: Toksycznoæ tlenu I, II. Post. Biochem. 1988, 34, 273-310. 8.Lutnicki K., Szpringer E., Czerny K., Wróbel J.: The influence of ethanol and different free radical scavengers on lipid peroxidation process and antioxi-dant status in the rats gastric mucosa. Annales UMCS, s. D, 1999, 54, 151--161.
9.Lutnicki K., Szpringer E., Czerny K., Ledwo¿yw A.: Effects of ethanol and arachidonic acid pathway inhibitors on the effectiveness of gastric mucosa cytoprotection. Folia Morphol. 2001, 60, 47-56.
10.Mózsik Gy., Sütö G., Vincze A., Zsoldos T.: Ulcer disease. CRC Press Inc. Boca Raton Florida 2000, 15-25.
11.Szpringer E., Lutnicki K.: Current views on apoptosis in theory and medical practice. P. J. Vet. Sci. 2003, 6, 71-80.
12.Ward P. A., Till G. O., Hatherill J. R., Annesly T. M., Kunkel R. G.: Systemic complement activation, lung injury and products of lipid peroxidation. J. Clin. Invest. 1985, 76, 517-527.
Adres autora: dr n. wet. Krzysztof Lutnicki, ul. Jaczewskiego 8, 20-090 Lublin
