Medycyna Wet. 2009, 65 (4) 277
Praca oryginalna Original paper
Rosn¹ca wiadomoæ i potrzeba weterynaryjnej ochrony zdrowia publicznego, w tym bezpieczeñstwa ¿ywnoci, wymuszaj¹ koniecznoæ prowadzenia bar-dziej precyzyjnych badañ zarówno nad mechanizmem dzia³ania leków, jak i nad ich losami w organizmie zwierz¹t rzenych. Pomimo wieloletniego stosowania tiamuliny w medycynie weterynaryjnej dane dotycz¹-ce jej losów w ustroju gatunków dodotycz¹-celowych, zw³asz-cza drobiu, s¹ bardzo ograniczone (2 publikacje z lat 70. i 80.). Nieliczne badania nad farmakokinetyk¹ tego zwi¹zku by³y prowadzone wiele lat temu z wykorzy-staniem technik mikrobiologicznych. Dane pimien-nictwa podaj¹ przyk³ady zastosowania technik chro-matograficznych do oznaczania tiamuliny w premik-sach i paszach dla zwierz¹t (17), jajach (5), produk-tach leczniczych weterynaryjnych (8) i miodzie (15), w których tiamulina wystêpowa³a w stê¿eniach wy¿-szych ni¿ we krwi po podaniu w dawkach terapeutycz-nych. Do chwili obecnej brak jest informacji pimien-nictwa na temat wykorzystania techniki HPLC do ozna-czania tiamuliny w osoczu czy surowicy, po jej poda-niu w dawkach terapeutycznych.
Tiamulina jest antybiotykiem pó³syntetycznym pochodn¹ naturalnie wystêpuj¹cej pleuromutyliny (4,
18). Wszystkie zwi¹zki z grupy pochodnych pleuro-mutyliny cechuj¹ siê wspólnym i unikalnym mechani-zmem dzia³ania i nie wykazuj¹ krzy¿owej opornoci z innymi stosowanymi obecnie antybiotykami (3, 6). Dzia³aj¹ bakteriostatycznie poprzez hamowanie syn-tezy bia³ek bakteryjnych (wi¹¿¹ siê z podjednostk¹ 50S rybosomów prokariotycznych) (6, 16). Pochodne pleu-romutyliny s¹ zwi¹zkami o charakterze zasadowym. Cechuje je bardzo dobra rozpuszczalnoæ w t³uszczach, co korzystnie wp³ywa na ich wch³anianie z przewodu pokarmowego oraz proces dystrybucji w ustroju. Spek-trum dzia³ania przeciwbakteryjnego tiamuliny obejmu-je bakterie Gram-dodatnie, bakterie beztlenowe, krêt-ki jelitowe, a tak¿e niektóre bakterie Gram-ujemne. Szczególnie dobr¹ skutecznoæ omawiany antybiotyk wykazuje przeciwko mykoplazmom (4, 18). Tiamuli-na jest obecnie stosowaTiamuli-na u wiñ oraz drobiu (11, 18). Celem badañ by³o opracowanie odpowiednio czu-³ej metody analitycznej, umo¿liwiaj¹cej oznaczenie tiamuliny w osoczu po podaniu w dawkach terapeu-tycznych, a nastêpnie wyznaczenie jej podstawowych wskaników farmakokinetycznych u kurcz¹t rzenych obejmuj¹cych pole powierzchni pod krzyw¹ stê¿enie-czas (AUC), stê¿enie maksymalne (Cmaks.), czas
wy-Wybrane aspekty farmakokinetyki tiamuliny
u kurcz¹t rzenych
MA£GORZATA POMORSKA-MÓL, CEZARY J. KOWALSKI*
Zak³ad Chorób wiñ Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, ul. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
*Zak³ad Farmakologii Katedry Przedklinicznych Nauk Weterynaryjnych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin
Pomorska-Mól M., Kowalski C. J.
Selected aspects of pharmacokinetics of tiamulin in broiler chicken Summary
The aim of the study was to develop an analytical method adequate to determine the tiamulin in plasma after administration in therapeutic values, calculation of the pharmacokinetic parameters of tiamulin in broiler chickens and the evaluation of the bioequivalence of two veterinary formulations. In order to determine the tiamulin in investigated material the HPLC technique with UV-VIS detection was used. After oral administration of tiamulin as Tiamulina 10% and Tiamutin 12.5% the following pharmacokinetic parameters were calculated: AUC, Cmax, tmax, t0,5, Vd, kel and MRT. For the pharmacokinetics analysis a PK Solution 2.0 computer program was used. Results of the study indicate quite a rapid absorption of tiamulin from the gastrointestinal tract as well as its quick elimination from plasma. The high value of the volume of distribution indicates the peripheral compartment is a target compartment for tiamulin. Results of statistical analysis including pairs of pharmacokinetic parameters like tmax, Cmax, AUC and the evaluation of percentage differences among them, allows the authors to conclude that formulations used in the study are bioequivalent.
Medycyna Wet. 2009, 65 (4) 278
st¹pienia stê¿enia maksymalnego (tmaks.), biologiczny okres pó³trwania (t0,5), objêtoæ dystrybucji (Vd), sta³¹ eliminacji (kel) oraz redni czas przebywania leku w ustroju (MRT). Kolejnym etapem by³o przeprowa-dzenie oceny biorównowa¿noci pomiêdzy dwoma u¿ytymi w badaniach produktami leczniczymi.
Materia³ i metody
Zwierzêta. Badania przeprowadzono na 74 kurczêtach rzenych obojga p³ci, o wyjciowej masie cia³a 1640-2550 g. Przed rozpoczêciem dowiadczenia kurczêta przesz³y 7-dnio-w¹ kwarantannê. Wszystkie ptaki uznano za zdrowe, co pozwoli³o na zakwalifikowanie ich do dalszej procedury badawczej. Kurczêta w czasie kwarantanny i w okresie dowiadczenia by³y trzymane w dobrze wentylowanych pomieszczeniach wiwarium Zak³adu Farmakologii AR w Lublinie. Ptaki by³y ¿ywione mieszank¹ rut zbo¿owych bez antybiotyków, kokcydiostatyków i stymulatorów wzros-tu oraz otrzymywa³y wodê do picia ad libiwzros-tum. Leki poda-wane by³y na czczo, zgodnie z wytycznymi odnonie do badañ farmakokinetycznych i biorównowa¿noci. W dniu dowiadczenia ptaki podzielono losowo na dwie grupy do-wiadczalne (A i B, n = 35 szt.), a tak¿e wyodrêbniono grupê kontroln¹ (K, n = 4).
Leki. W badaniach u¿yto dwóch produktów zawieraj¹-cych w sk³adzie tiamulinê, pochodz¹zawieraj¹-cych od ró¿nych pro-ducentów. Ptakom z grupy A podawano produkt leczniczy weterynaryjny Tiamulina 10% (Chemifarma, W³ochy) próba: n:040118, termin wa¿noci: 31.01.2005 (znajduj¹-cy siê w trakcie procedury rejestra(znajduj¹-cyjnej produkt bada-ny) natomiast ptakom z grupy B produkt Tiamutin 12,5% (Novartis, Szwajcaria) nr serii: G350, termin wa¿noci: 11.2006 (produkt referencyjny). Oba leki by³y w formie roztworu wodnego, przeznaczone do stosowania z wod¹ do picia.
Aparatura. W sk³ad uk³adu chromatograficznego wchodzi³a: pompa do HPLC Varian Star 9002 i detektor UV-VIS (Varian). Rozdzia³y wykonywano na kolumnie XTerra®RP
18 o rednicy ziarna 5 µm i wymiarach 4,6
× 150 mm (Waters). Próbki o objêtoci 10 µl dozowano przy pomocy zaworu pêtlowego Rheodyne.
Kurczêtom z grup dowiadczalnych leki podawano w roztworze wodnym, indywidualnie, doustnie (do wola) sond¹ metalow¹, w jednakowej dawce 40 mg substancji czynnej/kg m.c. Ptaki z grupy kontrolnej nie otrzyma³y ¿ad-nych leków. Osocze od tych ptaków przeznaczono do ba-dañ na odzysk substancji wzorcowej (tzw. osocze czyste). Próbki krwi pobierano do heparynizowanych probówek w trakcie skrwawienia, przy wywo³anej farmakologicznie utracie wiadomoci po up³ywie 1; 1,5; 2; 3; 4; 6 i 8 h od podania produktów leczniczych weterynaryjnych. Próbki osocza poddawano mro¿eniu i przechowywano w tempe-raturze 30°C do czasu przeprowadzenia analiz chromato-graficznych. Program badañ zosta³ zatwierdzony przez Lokaln¹ Komisjê Etyczn¹ ds. Dowiadczeñ na Zwierzê-tach (opinia nr 28/2004).
Zawartoæ tiamuliny w materiale badanym zosta³a ozna-czona wed³ug procedury analitycznej opracowanej w Za-k³adzie Farmakologii z wykorzystaniem informacji zawar-tych w pimiennictwie (12, 14, 17). Fazê ruchom¹
sta-nowi³a mieszanina 0,04 M diwodorofosforanu potasu (KH2PO4) i acetonitrylu (ACN) w stosunku objêtociowym 65 : 35. Szybkoæ przep³ywu fazy ruchomej przez kolumnê podczas rozdzia³u wynosi³a 1,5 ml/min. Detekcje UV pro-wadzono przy d³ugoci fali ë = 208 nm. Prac¹ chromato-grafu sterowano przy pomocy komputera wykorzystuj¹c program Star Chromatography Workstation, Version 4.0, który s³u¿y³ równie¿ do archiwizacji i przetwarzania da-nych.
Wartoci stê¿eñ tiamuliny w osoczu odczytywano z krzy-wej kalibracyjnej wyznaczonej w zakresie stê¿eñ od 360 do 3600 ng/ml. Prawid³owoæ zale¿noci liniowej w pozo-sta³ych wartociach stê¿eñ potwierdzono testem istotnoci korelacji. Obliczono: liniowoæ, precyzjê, dok³adnoæ, od-zysk oraz granicê wykrywalnoci (LOD) i oznaczalnoci (LOQ).
Analiza farmakokinetyczna. Obliczono wskaniki far-makokinetyczne tj. AUC, Cmaks., tmaks., t0,5, Vd, kel i MRT dla tiamuliny po jej stosowaniu w postaci preparatu Tiamulina 10% i Tiamutin 12,5%. Do obliczeñ farmakokinetycznych u¿yto programu komputerowego PK Solutions 2.0 wyko-rzystuj¹cego metody niekompartmentowej analizy farma-kokinetycznej. Model taki pozwala na opisywanie zarów-no kinetyki liniowej, jak i nieliniowej (13). To niezale¿ne od modelu podejcie do farmakokinetyki opiera siê na teo-rii momentów statystycznych. Zastosowanie tej teoteo-rii w ba-daniach farmakokinetycznych jest mo¿liwe, gdy¿ zmiany stê¿enia leku w osoczu, badane jako funkcja czasu, mog¹ zostaæ uznane za procesy, które podlegaj¹ zasadzie praw-dopodobieñstwa oraz statystyki (13). Model taki by³ ju¿ wielokrotnie stosowany w badaniach nad farmakokinetyk¹ innych antybiotyków (7). Zastosowana metoda niekompart-mentowa jest zalecana tak¿e w badaniach maj¹cych na celu ocenê biorównowa¿noci produktów leczniczych. Badania biorównowa¿noci opieraj¹ siê na za³o¿eniu, ¿e w sytuacji, w której substancja czynna produktu badanego dociera z ta-k¹ sam¹ szybkoci¹ i w takim samym stopniu do kr¹¿enia ogólnego, jak to ma miejsce w przypadku produktu refe-rencyjnego, to dostêpnoæ lokalna (stê¿enie w tkankach) jest podobna dla obu produktów badanego i referencyj-nego (1). Tempo i stopieñ wch³aniania leku do kr¹¿enia ogólnego charakteryzuj¹, odpowiednio, wartoci Cmaks., tmaks. oraz AUC (2, 19). W zwi¹zku z powy¿szym dla oceny wy-stêpowania biorównowa¿noci pomiêdzy porównywanymi preparatami u¿yto nastêpuj¹cych wskaników: AUC, Cmaks., i tmaks. (2, 19).
Analizê statystyczn¹ wyników przeprowadzono przy u¿yciu programu komputerowego Statistica 6,0. Dla wery-fikacji hipotezy równoci rednich poszczególnych para-metrów farmakokinetycznych przeprowadzono analizê wariancji (á = 0,05).
Wyniki i omówienie
Dok³adnoæ zastosowanej metody zosta³a okrelo-na przez odzysk, który by³ równy 83,5%. Wyzokrelo-naczo- Wyznaczo-no granicê wykrywalWyznaczo-noci (LOD) i oznaczalWyznaczo-noci (LOQ) wynosz¹ce kolejno: 47,5 ng/ml i 158 ng/ml. Wspó³czynnik korelacji by³ wysoki i wyniós³ r = 0,9999. Obliczone wartoci parametrów walidacji mieci³y siê w dopuszczalnym zakresie.
Medycyna Wet. 2009, 65 (4) 279
rednie stê¿enia tiamuliny w osoczu kurcz¹t rze-nych po stosowaniu preparatów w jednakowej dawce przedstawiono na ryc. 1. Przebieg obu krzywych jest zdecydowanie równoleg³y, co wskazuje na podobn¹ kinetykê tiamuliny w organizmie ptaków, niezale¿nie od u¿ytego produktu leczniczego. Odcinek pocz¹tko-wy krzypocz¹tko-wych (do 1,5 godz. po podaniu leku) obrazuje etap wch³aniania podanej substancji z przewodu po-karmowego do krwi. Najwy¿sze stê¿enia tiamuliny po jednorazowym podaniu preparatów obserwowano do-syæ szybko, bo ju¿ po up³ywie 1,5 h i wynios³y one, odpowiednio: 1614 ng/ml (Tiamulina 10%) i 1505 ng/ ml (Tiamutin 12,5%). Czas wyst¹pienia stê¿enia mak-symalnego jest zgodny z wynikami uzyskanymi przez innych autorów badaj¹cych losy tiamuliny u ró¿nych gatunków zwierz¹t (4, 10) i wiadczy o szybkiej ab-sorpcji tiamuliny z przewodu pokarmowego. Dalej krzywe przyjmuj¹ charakter zstêpuj¹cy, co wskazuje
na rozpoczêty proces dystrybucji oraz eliminacji tia-muliny z osocza.
W tab. 1 przedstawiono rednie wartoci wskani-ków farmakokinetycznych (AUC, Cmaks., tmaks., t0,5, Vd, kel i MRT) (wraz z odchyleniem standardowym). Ob-liczone wartoci parametrów farmakokinetycznych dla u¿ytych w badaniach produktów uk³ada³y siê na po-dobnym poziomie.
Biologiczny okres pó³trwania tiamuliny wyznaczo-ny w badaniach w³aswyznaczo-nych by³ stosunkowo krótki i wy-niós³ rednio 2,4 i 2,9 h. Podobne wartoci (t0,5 3,0 h) uzyskano w badaniach przeprowadzonych na cielêtach (4). Po podskórnym podaniu tiamuliny psom w daw-kach 25 i 10 mg/kg wyznaczono zdecydowanie d³u¿-szy okres pó³trwania wynosz¹cy, odpowiednio, 12,4 h oraz 4,2 h pomimo podania ni¿szej dawki (9).
Podsumowuj¹c uzyskane wyniki z analizy farma-kokinetycznej nale¿y stwierdziæ, ¿e proces wch³ania-nia badanego antybiotyku z przewodu pokarmowego by³ bardzo szybki. Wartoci Cmaks. zosta³y osi¹gniête ju¿ po up³ywie 1,5 godziny od podania leków ptakom. Tiamulina by³a stosunkowo szybko eliminowana z oso-cza kurcz¹t, o czym wiadczy dosyæ krótki biologicz-ny okres pó³trwania i MRT, a tak¿e doæ wysoka war-toæ sta³ej eliminacji. Jak podaje pimiennictwo, tia-mulina ulega dobremu rozmieszczeniu w tkankach (m.in. p³ucach, b³onie luzowej jelit, w¹trobie, ner-kach), w których osi¹ga znacznie wy¿sze stê¿enia ni¿ we krwi (4, 20). W kolejnych badaniach przeprowa-dzonych na cielêtach stê¿enie tiamuliny w nerkach, w¹trobie i p³ucach w jedn¹ godzinê po podaniu do¿yl-nym by³o 4-7,5 razy wy¿sze ni¿ w surowicy; wy¿szy poziom leku stwierdzono równie¿ w moczu i ¿ó³ci (20). Obliczona w badaniach w³asnych wysoka wartoæ ob-jêtoci dystrybucji (Vd ponad 5 oraz 6 l/kg) mo¿e byæ potwierdzeniem tych informacji.
Oceny biorównowa¿noci produktów leczniczych in vivo dokonano na podstawie przeprowadzonych ba-dañ farmakokinetycznych. Wyniki podsumowuj¹ce ocenê biorównowa¿noci preparatów przedstawiono w tab. 2. Oceniane preparaty mo¿na uznaæ za biorów-nowa¿ne, gdy¿ stosunek porównywanych par parame-trów farmakokinetycznych, wyra¿ony w wartociach rzeczywistych, mieci³ siê w granicach 0,80-1,20 a analiza wariancji nie wykaza³a pomiêdzy nimi sta-tystycznie istotnej ró¿nicy, przy poziomie istotnoci á = 0,05. Tak¿e ró¿nica w procentach pomiêdzy po-równywalnymi wskanikami nie przekracza³a
dopusz-czalnego progu ± 20% (1, 10, 19). Wyniki uzyskane na podstawie prze-prowadzonej analizy statystycznej, obej-muj¹cej pary wskaników farmakokine-tycznych tmaks., Cmaks., AUC, jak i okre-lenie procentowych ró¿nic pomiêdzy nimi, pozwalaj¹ uznaæ produkt leczni-czy badany Tiamulina 10% i produkt leczniczy referencyjny Tiamutin 12,5% za biorównowa¿ne. Preparaty te mog¹
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Œrednie stê¿enia tiamuliny w osoczu [ng/ml] 1 1,5 2 3 4 6 8
Czas od podania preparatu [h] Preparat badany Preparat referencyjny
Ryc. 1. Porównanie wartoci rednich stê¿eñ tiamuliny w oso-czu (ng/ml) kurcz¹t rzenych w zale¿noci od czasu (h) dla obu preparatów (wraz z odchyleniem standardowym)
a k s W nikfarmakokinetyczny Tiamuilna10% Tiamuitn12,5% t0,5(h) 2,91±0,76 2,47±0,71 Cmaks.(ng/m)l 1614±5060 1504±2390 tmaks.(h) 1,5±0,0 1,5±0,0 )l m / h · g n ( C U A 4430±4180 4335±9790 ) h ( T R M 04,6±0,78 04,3±0,46 Vd(/lkg) 06,6±1,91 05,1±2,16 kel(h1) 0,25±0,11 0,35±0,16
Tab. 1. rednie wartoci wskaników farmakokinetycznych (wraz z odchyleniem standardowym)
e n a w o zi l a n A a k s w inik referLeenkcyjny Lekbadany Ró(¿±ni2c0e%w)% Bad.r/e.f Isrtoót¿nnoicæ Cmaks.(ng/m)l 1505 1614 +7,24 1,07 ni tmaks.(h) 1,5 1,5 0 1,00 ni )l m / h · g n ( C U A 4335 4430 2,19 1,02 ni
Tab. 2. Ocena biorównowa¿noci pomiêdzy preparatem Tiamulina 10% a le-kiem referencyjnym Tiamutin 12,5%
Medycyna Wet. 2009, 65 (4) 280
byæ u¿ywane wymiennie u kur, poniewa¿ zgodnie z za-lecanymi procedurami oceny, maj¹ podobne w³aci-woci farmakokinetyczne.
Pimiennictwo
1.Anon.: Conduct of Bioequivalence Studies in Animals. Directive 81/852/EEC as amended 1993.
2.Anon.: Guidelines for the conduct of bioequivalence studies for veterinary medicinal products. EMEA/CVMP/016/00-corr-FINAL, 2000.
3.Boyd B., Castaner J.: Retapamulin. Drugs Fut 2006, 31, 107-113. 4.Gatne M. M., Badole P. C., Somkuwar A. P., Ranade V. V.: Pharmacokinetics
of tiamulin in calves after single intramuscular administration. Indian Vet. J. 1994, 71, 1148-1149.
5.Hormazabal V., Yndestad M., Ostensvik O.: Determination of flunixin and tiamulin hydrogen fumarate in meat and toltrazuril and toltrazurilsulfon in meat and eggs using LC/MS. J. Liq. Chromatogr. R. T. 2003, 26, 791-801. 6.Hunt E.: Pleuromutilin antibiotic. Drugs Fut 2000, 25, 1163-1168. 7.Kalaiselvi L., Sriranjani D., Ramesh S., Sriram P., Mathuram L. N.:
Phar-macokinetics of ofloxacin in broiler chicken. J. Vet. Pharmacol. Ther. 2006, 29, 185-189.
8.Krzek J., Kwiecieñ A., Starek M., Kierszniewska A., Rzeszutko W.: Identifi-cation and determination of tiamulin, lincomycin and spectinomycin in vete-rinary preparations by thin-layer chromatography/densitometry. J. AOAC Intern. 2000, 83, 1502-1506.
9.Laber G.: Investigation of pharmacokinetic parameters of tiamulin after intramuscular and subcutaneous administration in normal dog. J. Vet. Phar-macol. Ther. 1988, 11, 45-49.
10.Laber G., Schütze E.: Blood level studies in chickens, turkey poults and swine with tiamulin, a new antibiotic. J. Antibiot. 1977, 12, 1119-1122.
11.Lykkeberg A. K., Cornett C., Halling-Sorensen B., Hansen S. H.: Isolation and structural elucidation of tiamulin metabolites formed in liver microso-mes of pigs. J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 2006, 42, 223-231.
12.Markus J. R., Sherma J.: Method III. Liquid chromatographic determination of tiamulin hydrogen fumarate in complete swine meal feeds. J. AOAC Intern. 1993, 76, 449-450.
13.Martinez M. N.: Noncompartmental methods of drug characterization: stati-stical moment theory. JAVMA 1998, 213, 974-980.
14.Moore D. B., Britton N. L., Smallidge R. L., Riter K. L.: Determination of tiamulin in type C medicated swine feeds using high throughput extraction with LC. J. AOAC Intern. 2002, 85, 533-540.
15.Nozal M. J., Bernal J. L., Martin M. T., Jimenez J. J., Bernal J., Higes M.: Trace analysis of tiamulin in honey by liquid chromatography-diode array-electrospray ionization mass spectrometry detection. J. Chrom. 2006, 1116, 102-108.
16.Poulsen S. M., Karlsson M., Johansson L. B., Vester B.: The pleuromutilin drugs tiamulin and valnemulin bind to the RNA at the peptidyl transferase centre on the ribosome. Mol. Microbiol. 2001, 41, 1091-1099.
17.Rodriguez-Comesana M., Cancho-Grande B., Simal-Gandara J.: Screening method for detecting cross-contamination residues of tiamulin in swine feeds. J. AOAC Intern. 2003, 86, 449-451.
18.Schuhmacher A., Bafundo K. W., Islam K. M., Aupperle H., Glaser R., Schoon H. A., Gropp J. M.: Tiamulin and semduramicin: Effects of simulta-neous administration on performance and health of growing broiler chickens. Poultry Sci. 2006, 85, 441-445.
19.Toutain P. L., Koritz G. D.: Veterinary drug bioequivalence determination. J. Vet. Pharmacol. Therap. 1997, 20, 79-90.
20.Ziv G., Levisohn L., Bar-Moshe B., Bor A., Soback S.: Clinical pharmacology of tiamulin in ruminants. J. Vet. Pharmacol. Ther. 1983, 6, 23-32. Adres autora: dr Ma³gorzata Pomorska-Mól, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: mpomorska@pulawy.piwet.pl
