Artyku³ przegl¹dowy Review
Rezerwuarem patogennych szczepów Pasteurella multocida (Pm) i Bordetella bronchiseptica (Bbr) mog¹ byæ zarówno ludzie, jak i wiele gatunków zwierz¹t np.: winie, kozy, owce, byd³o, króliki, koty, psy, drób, szczury oraz ma³py (5). U trzody chlewnej bakterie te wywo³uj¹ zakane zanikowe zapalenie nosa (zzzn) chorobê o du¿ym znaczeniu dla efektywnej produkcji trzody chlewnej. Objawia siê ona zanikiem nab³onka migawkowego nosa oraz deformacj¹ czaszki, co pro-wadzi do upoledzenia stymulacji wêchowej, obni¿e-nia apetytu i utrudnionego pobieraobni¿e-nia paszy, a w kon-sekwencji do spowolnienia tempa przyrostów masy cia³a. W zale¿noci od natê¿enia objawów chorobo-wych obecnie wyró¿nia siê dwie podjednostki choro-bowe: PAR (progressive atrophic rhinitis) progre-sywny zanikowy nie¿yt nosa, wywo³ywany przez
der-monekrotoksyczne szczepy Pm (DNT Pm), oraz NPAR (nonprogressive atrophic rhinitis) nieprogresywny nie¿yt nosa wywo³ywany przez chorobotwórcze szcze-py Bbr (16). Pasteurella multocida izoluje siê zarów-no od wiñ wykazuj¹cych objawy infekcji, jak i od wiñ klinicznie zdrowych, ale izolaty te charakteryzu-j¹ siê odmiennymi cechami genotypowymi. Z uwagi na fakt, ¿e zaka¿one winie mog¹ nie wykazywaæ zauwa¿alnych objawów klinicznych, choroba mo¿e nie zostaæ wykryta. Jeli PAR zostanie stwierdzone u 3-5% wiñ, mo¿e to wskazywaæ na wystêpowanie infekcji u oko³o 50-70% zwierz¹t z danej chlewni. Naj-wiêksze zagro¿enie dla gospodarstw wolnych od PAR wystêpuje przy wprowadzaniu nowych zwierz¹t o nie-znanym statusie zdrowotnym podczas remontu stada, które jako potencjalny rezerwuar Pm i Bbr mog¹ przy-czyniæ siê do infekcji pozosta³ych wiñ. Próby
elimi-Przegl¹d metod wykorzystywanych do wykrywania
i charakterystyki szczepów Pasteurella multocida
i Bordetella bronchiseptica*
)
IWONA MARKOWSKA-DANIEL, KATARZYNA STÊPNIEWSKA
Zak³ad Chorób wiñ Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Markowska-Daniel I., Stêpniewska K.
Review of the methods applied for the detection and characterization of Pasteurella multocida and Bordetella bronchiseptica strains
Summary
Pasteurella multocida (Pm) and Bordetella bronchiseptica (Bbr) are important pathogens of humans and many species of animals. At present, several classic and modern techniques are applied for their detection and identification. The review presents an overview of the diagnostic methods that are the most widely used in laboratories, with special emphasis placed on highlighting their advantages and limitations. The choice of the technique depends on the aim of the study. The most often used are classical methods such as microbiological, serological, biochemical, and in the case of atrophic rhinitis likewise the morphometric analysis of the cross-section of a turbinated bone. The above-mentioned techniques are not accurate enough because most of the test results must be confirmed by more precise and sensitive techniques. The development of a wide spectrum of molecular techniques has facilitated the undoubted identification of Pm and Bbr. The widest used is PCR basing on the amplification of the gene encoding dermonecrotoxin of Pm and Bbr. Other molecular techniques could be useful for describing the connection among individual components of bacterial cells and their ability to develop the disease. Moreover they could also be used to describe the degree of phylogenetical relationship among field strains. Such information could be used to make a prognosis regarding the appearance of diseases on a particular area.
Taking into account the significance of the rapid and precise detection of the pathological agents for immediate and accurate therapy, the continuation of studies aimed at the developing of rapid and sensitive diagnostic techniques is fully recommended and justified.
Key words: Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, detection, characterization
nacji wymienionych patogenów z fermy poprzez che-mioterapiê i szczepienia poci¹gaj¹ za sob¹ znaczne nak³ady finansowe, przyczyniaj¹c siê tak¿e do zmniej-szenia rentownoci gospodarstwa.
Dla skutecznego zwalczenia infekcji lub ochrony przed zaka¿eniem stad wolnych od PAR wa¿ne jest szybkie wykrycie obecnoci patogennych szczepów, zdolnych do produkcji dermonekrotoksyny. Do metod najczêciej stosowanych w diagnostyce choroby zali-cza siê: analizê morfometryczn¹, badania bakteriolo-giczne oraz testy: biochemiczne, biolobakteriolo-giczne i mole-kularne.
Podstaw¹ uznania stada za wolne od PAR s¹ ujem-ne wyniki poubojowego badania morfometryczujem-nego, potwierdzone wynikami badania serologicznego (16, 19). Badanie morfometryczne przekroju poprzeczne-go ma³¿owin nosowych wykonuje siê u podejrzanych o chorobê 10 tuczników, o masie cia³a oko³o 100 kg. Pozwala ono na okrelenie wielkoci szczeliny miê-dzy ma³¿owin¹ a cian¹ boczn¹ lub przegrod¹ nosa w miejscu, w którym jest ona najwiêksza. Do okrele-nia stopokrele-nia zmian w ma³¿owinach nosowych stosuje siê 5-stopniow¹ skalê opracowan¹ przez Done (6), wg której stopieñ I traktowany jest jako s³abe odchylenie od normy, a stopieñ V jako ca³kowity zanik ma³¿o-win. Za wynik dodatni uwa¿a siê sumê pomiarów szczelin w lewej i prawej jamie nosowej przekracza-j¹c¹ 6 mm. W przypadku, gdy zanik ma³¿owin jest niewielki, ale stwierdza siê wyran¹ deformacjê prze-grody nosowej, wynik traktuje siê równie¿ jako do-datni.
Materia³em u¿ywanym do diagnostycznych badañ laboratoryjnych w kierunku PAR s¹ wymazy pobrane przy¿yciowo z nosa wiñ oraz surowice, a poubojowo migda³ki i bioptaty z chorobowo zmienionych p³uc.
Istotne znaczenie w badaniu bakteriologicznym ma w³aciwe pobranie materia³u do badañ (dotyczy to zw³aszcza wymazów z nosa wiñ). winie powinny byæ odpowiednio przytrzymane, tak, aby nie zaciskaæ im nozdrzy. Nozdrza zewnêtrzne powinny byæ po-wierzchownie oczyszczone. Wymaz pobiera siê komer-cyjnymi sterylnymi wymazówkami b¹d przy u¿yciu waty nawiniêtej na patyczek plastikowy lub metalo-wy. Wymazówkê wk³ada siê dorodkowo do przed-sionka nosa wzd³u¿ brzusznej ciany otworu nosowe-go, kieruj¹c siê w stronê przegrody nosowej, nastêp-nie, po przejciu przedsionka nosa nale¿y delikatnie kierowaæ j¹ w stronê nozdrzy tylnych, równolegle do p³aszczyzny strza³kowej g³owy i wykonuj¹c ruch ob-rotowy pobraæ wymaz. Wymazy nale¿y pobieraæ doæ szybko i sprawnie, poniewa¿ winie broni¹c siê nie-kiedy szarpi¹ gwa³townie g³ow¹ lub zaciskaj¹ nozdrza, co utrudnia pozyskanie materia³u.
Powierzchowne pobranie wymazu, zbyt d³ugi czas pomiêdzy pobraniem a wysiewem materia³u czy nie-w³aciwe warunki transportu (brak sch³odzenia) unie-mo¿liwiaj¹ potencjaln¹ izolacjê patogenów. Bordetel-la bronchiseptica potrzebuje wiêcej czasu do wzrostu
(nawet 72 godziny), który mo¿e byæ t³umiony przez wzrost innych, szybko rosn¹cych bakterii, co mo¿e daæ w konsekwencji fa³szywie ujemny wynik badania.
Wstêpn¹ metod¹ diagnostyczn¹ jest badanie bakte-riologiczne. W celu izolacji Pm i Bbr badany materia³ posiewany jest równolegle na agar od¿ywczy z dodat-kiem 5% krwi koñskiej, a tak¿e na pod³o¿a Mac-Conkeya oraz Smith-Baskervillea (SB). Po inkubacji w 37°C przez 24 godziny w warunkach tlenowych, z wyj¹tkiem hodowli na pod³o¿u SB, która wymaga d³u¿szego czasu inkubacji (oko³o 48 godzin), doko-nuje siê oceny makromorfologicznej wyros³ych kolo-nii. Pasteurella multocida nie wykazuje wzrostu na pod³o¿u MacConkeya, a na agarze z krwi¹ kolonie przybieraj¹ charakterystyczny kszta³t kropli rosy. Ko-lonie Bbr na agarze z krwi¹ s¹ drobne, bia³e, wypuk³e, za na pod³o¿u MacConkeya s¹ drobne, przejrzyste, z ró¿ow¹ powiat¹. Bordetella bronchispetica, rosn¹c na pod³o¿u SB, powoduj¹ jego alkalizacjê, co prowa-dzi do zmiany zabarwienia z zielonej na niebiesk¹. Lariveire i wsp. (13) wykazali, ¿e na pod³o¿u SB poz-bawionym ze swego sk³adu amfoterycyny B uzyskuje siê znaczny wzrost efektywnoci izolacji Bbr z mate-ria³u biologicznego.
Ocena makromorfologiczna hodowli bakteryjnej pozwala na wstêpn¹ identyfikacjê wyros³ych drobno-ustrojów, jest jednak niewystarczaj¹ca do stwierdze-nia, czy wyizolowana Pm jest czy nie jest szczepem dermonekrotokstycznym.
Kolejn¹ metod¹ stosowan¹ w wykrywaniu omawia-nych patogenów jest badanie mikroskopowe. Bezpo-rednie badanie mikroskopowe ma niewielk¹ wartoæ diagnostyczn¹ przy identyfikacji Bbr, natomiast stwier-dzenie pa³eczek wybarwionych dwubiegunowo b³êki-tem metylenowym w metodzie Loefflera wskazuje na obecnoæ bakterii z rodzaju Pasteurella spp (13).
Potwierdzeniem wstêpnej identyfikacji bakteriolo-gicznej izolatów Pm i Bbr s¹ badania biochemiczne wyizolowanych czystych kultur bakteryjnych. Pasteu-rella multocida subsp. multocida nie powoduje hemo-lizy, wytwarza katalazê, oksydazê oraz indol, nie wy-twarza ureazy oraz powoduje dekarboksylacjê ornity-ny. Ponadto fermentuje ona glukozê, mannitol, sorbi-tol i galaktozê. Niektóre szczepy fermentuj¹ równie¿ laktozê, ksylozê i trehalozê. Bordetella bronchisepti-ca charakteryzuje siê tym, ¿e wytwarza katalazê i oksy-dazê, ma zdolnoæ ruchu, powoduje redukcjê azota-nów, wytwarza ureazê (ju¿ po 4 godzinach inkubacji), wykazuje wzrost w obecnoci cytrynianu oraz nie wy-twarza br¹zowego barwnika na pod³o¿u agarowym z krwi¹ z dodatkiem L-tyrozyny (1 g/L) (10). Szybk¹ analizê biochemiczn¹ mo¿na przeprowadziæ przy u¿y-ciu zestawów mini Api: ID 20 E (identyfikacja Ente-robacteriaceae i innych niewymagaj¹cych pa³eczek Gram-ujemnych) oraz Api 20 NE (identyfikacja nie-jelitowych pa³eczek Gram-ujemnych) (bioMerieux).
Testy biochemiczne, podobnie jak badanie bak-teriologiczne, tak¿e nie pozwalaj¹ na rozró¿nienie
szczepów DNT i nie-DNT. Ponadto ich zastosowanie w szybkiej diagnostyce bakteriologicznej zaka¿eñ wy-wo³ywanych przez Pm i Bbr ogranicza fakt, ¿e nie s¹ one przeznaczone do bezporedniego badania mate-ria³u klinicznego, dlatego czas badania wyd³u¿a siê o izolacjê czystych kultur bakteryjnych.
Po identyfikacji bakteriologicznej i biochemicznej wyizolowanych pasteurelli wa¿ne jest zaliczenie ich do grupy otoczkowej, a tak¿e ocena toksynotwór-czoci. Pasteurella multocida powoduj¹ca PAR u wiñ nale¿y g³ównie do serotypu D, ale stwierdzano rów-nie¿ szczepy chorobotwórcze nale¿¹ce do serotypu A. Oznaczenia grupy otoczkowej Pm dokonuje siê po-przez wykonanie testu z akryflawin¹ w hodowlach bu-lionowych BHI (bulion mózgowo-rdzeniowy). Obec-noæ grubych, k³aczkowatych str¹tów wskazuje na typ otoczkowy D, jednolicie mêtna struktura hodowli wskazuje na typ otoczkowy A. Przynale¿noæ do gru-py A mo¿na potwierdziæ za pomoc¹ testu na wytwa-rzanie hialuronidazy. Polega on na poprzecznym po-siewie liniowym Pm i jednoczenie pod k¹tem pros-tym do tej linii posiewie Staphylococcus aureus wy-twarzaj¹cego hialuronidazê. Zredukowany wzrost Pm w pobli¿u wyros³ego gronkowca wskazuje na grupê otoczkow¹ A (11).
Dermonekrotoksycznoæ izolatów Pm i Bbr mo¿na stwierdziæ zarówno metodami in vitro, z uwzglêdnie-niem: testu cytotoksycznoci w hodowlach komórko-wych, testu immunoenzymatycznego z zastosowaniem przeciwcia³ monoklonalnych czy PCR (Polymerase Chain Reaction), jak i metodami in vivo, w tym tes-tem biologicznym przeprowadzonym na zwierzêtach laboratoryjnych. mieræ myszek bia³ych po dootrzew-nowym wstrzykniêciu supernatantu z p³ynnej hodow-li wymienionych szczepów wiadczy o dermonekro-toksycznoci izolatów, podobnie jak wstrzykniêcie ródskórne supernatantu winkom morskim wywo³u-j¹ce u nich zmiany nekrotyczne skóry (19).
Powszechnie stosowanymi metodami, wykorzysty-wanymi przede wszystkim do badañ monitoringowych stad w kierunku zzzn s¹: antygenowy test ELISA s³u-¿¹cy do wykrywania antygenu Pm oraz serologiczny test ELISA do wykrywania przeciwcia³ dla DNT Pm. Jedyny dostêpny na rynku zestaw komercyjny do wy-krywania antygenu Pm nie pozwala na rozró¿nienie izolatów Pm DNT(+) od Pm DNT(). Natomiast tes-tem serologicznym nie mo¿na rozró¿niæ przeciwcia³ anty-DNT Pm, które s¹ efektem szczepienia profilak-tycznego od przeciwcia³, które powsta³y w wyniku sty-mulacji uk³adu immunologicznego przez drobnoustrój (w toku zaka¿enia), dlatego nie powinien byæ on sto-sowany do oceny stanu zdrowia wiñ wprowadzanych do stad wolnych od PAR (14). Niew¹tpliw¹ zalet¹ tes-tu ELISA jest natomiast prostota wykonania, mo¿li-woæ przebadania du¿ej liczby próbek w krótkim okre-sie oraz ³atwoæ interpretacji wyników.
Bowersock i wsp. (1) porównali czu³oæ i specy-ficznoæ testu ELISA do wykrywania antygenu Pm,
opartego na przeciwciele monoklonalnym przeciwko DNT, z wynikami próby biologicznej, przeprowadza-nej we wczeniej opisany sposób i testu cytotoksycz-noci w hodowli pneumocytów p³odów kocich. Czu-³oæ i specyficznoæ opracowanego przez wymienio-nych autorów testu ELISA zosta³a okrelona na po-ziomie, odpowiednio, 80% i 85% i by³a zdecydowa-nie wy¿sza od dwóch pozosta³ych metod, obarczonych dodatkowo znacznym subiektywizmem w interpreta-cji wyników. Próba biologiczna da³a wyniki zbli¿one do metody immunoenzymatycznej, chocia¿ zdarza³y siê trudnoci podczas interpretacji rezultatów, co mog-³o wynikaæ z obecnoci obcych substancji w superna-tancie u¿ytym do immunizacji myszy, za w przypad-ku testu cytotoksycznoci zanotowano znaczn¹ nie-zgodnoæ wyników z testem ELISA. Nale¿y zaznaczyæ, ¿e izolaty ocenione jako dodatnie w tecie ELISA zo-sta³y nastêpnie przebadane z u¿yciem sondy moleku-larnej, celem weryfikacji. Uzyskany wynik by³ w 100% zgodny, co potwierdzi³o przydatnoæ opracowanego testu do wykrywania obecnoci DNT Pm w wymazach z nosa wiñ.
W ostatnich latach bardzo szerokie zastosowanie w diagnostyce bakteriologicznej znalaz³y techniki bio-logii molekularnej, szczególnie PCR, z uwagi na fakt, ¿e przy jego u¿yciu mo¿liwa jest bezporednia identy-fikacja izolatów, z pominiêciem etapu hodowli na pod-³o¿ach, identyfikacji biochemicznej czy testu toksycz-noci. W konsekwencji czas niezbêdny do postawie-nia rozpoznapostawie-nia jest bardzo krótki (kilka godzin). Po-nadto do zalet metody PCR nale¿¹: wysoka czu³oæ i specyficznoæ, prostota wykonania oraz mo¿liwoæ wykorzystania ka¿dego rodzaju materia³u biologicz-nego jako matrycy. W przypadku Pm niew¹tpliwie g³ównym czynnikiem odpowiedzialnym za chorobo-twórczoæ szczepów jest DNT, st¹d metody PCR u¿y-wane do rozpoznawania PAR opieraj¹ siê najczêciej na powieleniu sekwencji genu ToxA, odpowiedzial-nego za jej produkcjê. Wymieniony gen jest uwa¿any za specyficzny dla tego gatunku bakterii oraz charak-terystyczny dla patogennych szczepów Pm, wywo³u-j¹cych objawy chorobowe u wiñ (15, 18, 20, 23). Nie-mniej jednak wg Kampa i wsp. (9) E. coli oraz S. ty-phimurium zawieraj¹ sekwencje homologiczne do po-wielanego regionu, co mo¿e wp³ywaæ na specyficz-noæ metody.
Z kolei Bbr posiada wiele czynników maj¹cych wp³yw na jej patogennoæ. Nale¿¹ do nich: LPS, pro-dukty III typu systemu sekrecyjnego, fimbrie, adhezy-ny, pertaktyna i cyklaza adenylowa. Za najwa¿niejszy marker wirulencji uwa¿a siê jednak dermonekrotok-synê. Jak wynika z badañ przeprowadzonych przez Brockmeiera i wsp. (2), zanik ma³¿owin nosowych oraz odoskrzelowe zapalenie p³uc rozwija³o siê tylko u wiñ zaka¿onych szczepami Bbr produkuj¹cymi DNT, jed-nak¿e szczepy jej pozbawione nie by³y ca³kowicie awirulentne. Ze wzglêdu na znaczenie DNT w pato-gennoci Bbr w PIWet-PIB opracowano aktualnie test
PCR umo¿liwiaj¹cy amplifikacjê wymienionego genu (22).
Jak wskazuj¹ na to wyniki badañ przeprowadzonych przez Choi i Chae (3), wiele zwierz¹t, które s¹ nosi-cielami Pm, mo¿e nie zostaæ wykrytych podczas mo-nitoringu prowadzonego za pomoc¹ konwencjonalne-go PCR, poniewa¿ fragment amplifikowanekonwencjonalne-go genu mo¿e byæ zbyt du¿y. Z tego powodu wspomniani au-torzy zastosowali test nested-PCR do detekcji DNT szczepów Pm z wymazów z nosa wiñ, modyfikuj¹c konwencjonalny PCR przez skrócenie jednego z u¿y-wanych w reakcji starterów. W efekcie uzyskiwali oni krótsze produkty amplifikacji genu odpowiedzialne-go za produkcjê DNT (w wersji pierwotnej fragment powielany mia³ d³ugoæ 846 pz, a po zmianie 690 pz). Warunki reakcji (d³ugoæ cykli, temperatura kolejnych etapów) pozosta³y bez zmian. Zmniejszenie d³ugoci sekwencji powielanych nukleotydów znacznie popra-wi³o czu³oæ testu mierzon¹ spektrofotometrycznie (z 105 do 108), pozwalaj¹c wykryæ 0,1 µg DNA/µl.
W genomie Bordetella spp. znajduj¹ siê powtarza-j¹ce siê sekwencje insercyjne, w wysokiej liczbie ko-pii, pozwalaj¹ce na rozró¿nienie szczepów. W³aci-woæ tê wykorzystali Koidl i wsp. (12), opracowuj¹c technikê Real-Time PCR. Opracowana przez wymie-nionych autorów metoda stanowi³a multipleks czte-rech niezale¿nych reakcji PCR. W pierwszej amplifi-kacji powielano sekwencjê insercyjn¹ IS481 o d³u-goci 81 pz, która jest obecna w du¿ej liczbie kopii u B. pertussis, B. holmesii, za okazyjnie u B. bron-chiseptica. W drugiej amplifikacji powielano fragment o d³ugoci 104 pz IS1001, obecny w du¿ej liczbie ko-pii u B. parapertussis, sporadycznie u B. bronchisep-tica i B. holmesii. W obu reakcjach PCR u¿yto tego samego barwnika i mierzono fluorescencjê przy tej samej d³ugoci fali (530 nm). Trzecia amplifikacja powiela³a sekwencjê o d³ugoci 135 pz, specyficzn¹ dla genu koduj¹cego w³óknikow¹ hemaglutyninê, wystêpuj¹c¹ jako pojedyncza kopia genu u B. para-pertussis, B. bronchiseptica i u B. pertussis. Pomiar fluorescencji dla tego produktu by³ prowadzony przy 640 nm. W czwartej reakcji powielono heterologicz-n¹ wewnêtrzheterologicz-n¹ kontrolê, mierz¹c fluorescencjê przy 704 nm. Analiza krzywej topnienia produktów PCR pozwala³a na wykrywanie specyficznego produktu amplifikacji i ró¿nicowanie gatunków B. parapertus-sis, B. bronchiseptica i B. pertusparapertus-sis, natomiast B. hol-mesii nie by³a wykrywana w tym systemie. Real-Time PCR okaza³ siê zatem przydatn¹ molekularn¹ metod¹ wykrywaj¹c¹ i ró¿nicuj¹c¹ DNA Bordetella spp., któ-ra mo¿e byæ u¿ywana w rutynowych badaniach diag-nostycznych.
Inn¹ molekularn¹ metod¹ wykorzystywan¹ do ró¿-nicowania szczepów Pm jest REA (restriction endo-nuclease analysis) analiza DNA ca³ych komórek bak-teryjnych przy u¿yciu enzymów restrykcyjnych. Gard-ner i wsp. (8) wykorzystali w tym celu enzymy SmaI oraz EcoR1. Zastosowanie SmaI pozwoli³o na
wyka-zanie obecnoci ró¿nych wzorów restrykcyjnych wród przebadanych szczepów, natomiast u¿ycie EcoRI spo-wodowa³o uzyskanie ogromnej liczby fragmentów re-strykcyjnych, co utrudnia³o interpretacjê otrzymanych wyników. Uznano zatem, ¿e analiza DNA metod¹ REA z zastosowaniem endonukleazy SmaI stwarza wiêk-sze mo¿liwoci ró¿nicowania wród odmiennych fe-notypowo szczepów Pm izolowanych od wiñ oraz ledzenia róde³ PAR w fermach trzody chlewnej.
Moreno i wsp. (17) u¿ywali do typowania szcze-pów Pm subsp. multocida izolowanych od wiñ cho-rych na zapalenie p³uc, PAR i posocznicê, technikê SE-AFLP (single enzyme amplified fragment length polymorphism). Jest to prosta i ³atwa do standaryzacji metoda s³u¿¹ca do badania polimorfizmu w genomie bakteryjnym. Polega ona na ciêciu genomu jedn¹ en-donukleaz¹ (w omawianym przypadku by³ to enzym HindIII nale¿¹cy do II grupy enzymów restrykcyjnych). Pociête DNA dodano do mieszaniny reakcyjnej zawie-raj¹cej oligonukleotydy, ligazê T4 DNA, bufor i wodê. Zligowane DNA denaturowano w 80°C przez 10 min. i przeprowadzono reakcjê PCR. Zamplifikowane frag-menty rozdzielano w 2% ¿elu agarozowym. Przy za-stosowaniu SE-AFLP uzyskiwano 7-12 fragmentów DNA Pm o wielkoci 400-1400 pz. Wiêkszoæ uzys-kanych izolatów nale¿a³o do typu D, jednak¿e najwiêk-sz¹ genetyczn¹ heterogennoæ zaobserwowano w ob-rêbie typu A.
Kolejn¹ technik¹ wykorzystywan¹ do wykrywania i charakterystyki szczepów Pm i Bbr jest PFGE (pul-sed-field gel electrophoresis). S³u¿y ona do okrelenia genetycznych i epidemiologicznych zale¿noci pomiê-dzy szczepami terenowymi, pozwalaj¹c na okrelenie stopnia ich pokrewieñstwa filogenetycznego oraz efek-tywniejsz¹ identyfikacjê i rozró¿nienie gatunkowe ni¿ np. rybotypowanie. Kêdrak-Jab³oñska (11) przy u¿y-ciu PFGE przebada³a izolaty Pm uzyskane od byd³a chorego na posocznicê krwotoczn¹. Do ciêcia geno-mu bakteryjnego stosowa³a enzym ApaI, a nastêpnie prowadzi³a rozdzia³ elektroforetyczny w zmiennym pulsacyjnym polu elektrycznym i dokonywa³a analizy uzyskanych wzorów.
SDS-PAGE jest technik¹ umo¿liwiaj¹c¹ analizê pro-fili bia³kowych b³ony zewnêtrznej (OMP outer mem-brane protein), które poddawane s¹ rozdzia³owi w 12% ¿elu poliakrylamidowym. Davies i wsp. (4) badali ko-relacje pomiêdzy wystêpowaniem genu toxA Pm, ty-pem otoczkowym szczepu a rodzajem bia³ek b³ony zewnêtrznej. Okaza³o siê, ¿e 76% przebadanych szcze-pów Pm odpowiedzialnych za wystêpowanie PAR, zawieraj¹cych gen toxA, posiada³o typ otoczkowy D i mia³o typ OMP - 4.1 oraz typ otoczkowy A i D o pro-filu OMP - 6.1. Wiêkszoæ szczepów wywo³uj¹cych zapalenie p³uc, nie posiadaj¹cych genu toxA, nale¿a³o do typu otoczkowego A o typie OMP: 1.1, 2.1, 3.1, 5.1, lub typu otoczkowego D, który posiada³ OMP - 6.1. Wykazano tym samym silny zwi¹zek typu otocz-kowego D o profilu OMP - 6.1 powoduj¹cego PAR
i zapalenie p³uc z posiadaniem lub nie genu toxA, od-powiedzialnego za produkcjê DNT.
Eun-Kyung i wsp. (7) ró¿nicowali szczepy Bbr sto-suj¹c analizê RAPD (random amplified polymorphic DNA) i PFGE. Przy pomocy metody PFGE analizo-wane jest ca³e chromosomalne DNA, w przeciwieñ-stwie do RAPD, które stosuje siê do badania chromo-somalnych rozproszonych loci, sekwencji polimorficz-nych regionów komplementarpolimorficz-nych do u¿ytych starte-rów oraz polimorfizm amplifikowanych obszastarte-rów. Obie metody by³y zastosowane do wykrywania ró¿nic genotypowych wród szczepów Bbr wyizolowanych od wiñ. Mo¿na je wykorzystywaæ w badaniach epi-demiologicznych, ledz¹c np. rozprzestrzenianie siê gatunków bakterii odpowiedzialnych za infekcjê. Wy-kazano wiêksz¹ przydatnoæ PFGE w ró¿nicowaniu wyizolowanych szczepów ni¿ RAPD. Dodatkow¹ zale-t¹ PFGE by³a odtwarzalnoæ wyników genotypowania. Szybk¹ i efektywn¹ metod¹ jednoczesnego wykry-wania Bbr i toksynotwórczych Pm jest technika dwu-kolorowej hybrydyzacji materia³u wyizolowanego z czystej kultury. Etap hybrydyzacji jest poprzedzony wklonowaniem odpowiednich fragmentów genu ToxA Pm i genu AlcA Bbr do genomu E. coli. Odpowiednio przygotowane membrany poddaje siê hybrydyzacji z sondami wyznakowanymi barwnikami fluorescen-cyjnymi. Fluorescein¹ wyznakowany jest gen ToxA, natomiast z digoxygenin¹ zwi¹zany jest gen AlcA. De-tekcja odbywa siê po dodaniu odpowiednich substra-tów. Ró¿owy sygna³ hybrydyzacji jest specyficzny tyl-ko dla DNT izolatów Pm, natomiast sygna³ fioletowy charakterystyczny jest tylko dla Bbr. Metoda dwuko-lorowej hybrydyzacji jest szybka, specyficzna i u¿y-teczna do analizy du¿ej liczby próbek, w porównaniu z metodami opieraj¹cymi siê o analizê morfologii ko-lonii i testy biochemiczne. Wad¹ tej metody jest znacz-ny koszt odczynników, które przewy¿szaj¹ ceznacz-ny re-agentów stosowanych w konwencjonalnych metodach kolorymetrycznych czy chemiluminescencyjnych. Nie bez znaczenia jest te¿ doæ skomplikowany proces sa-mego wklonowywania genów (21).
Podsumowuj¹c przedstawione w artykule metody, aktualnie dysponujemy szeregiem klasycznych i no-woczesnych technik pozwalaj¹cych na wykrywanie i charakterystykê omawianych drobnoustrojów. Maj¹ one szereg zalet, ale i okrelone ograniczenia. Wybór w³aciwej metody uzale¿niony jest przede wszystkim od celu analizy. Bior¹c pod uwagê znaczenie szybkie-go i precyzyjneszybkie-go rozpoznania przyczyny zachorowañ dla niezw³ocznego zastosowania odpowiedniego le-czenia, kontynuacja badañ nad rozwojem szybkich i czu³ych metod diagnostycznych wydaje siê w pe³ni uzasadniona. Precyzyjna diagnostyka pozwala tak¿e na bezpieczny remont stada, umo¿liwia ograniczenie wystêpowania zzzn w fermach, a nawet ca³kowite uwolnienie stad od tej choroby, co z pewnoci¹ prze-k³ada siê na korzystny bilans ekonomiczny i rentow-noæ produkcji trzody chlewnej.
Pimiennictwo
1.Bowersock T. L., Hooper T., Pottenger R.: Use of ELISA to detect toxigenic Pasteurella multocida in atrophic rhinitis in swine. J. Vet. Diagn. Invest. 1992, 4, 419-422.
2.Brockmeier S. L., Register K. B., Magyar T., Lax A. J., Pullinger G. D., Kunkle R. A.: Role of the dermonecrotic toxin of B. bronchiseptica in patho-genesis of respiratory disease in swine. Inf. Immun. 2002, 70, 481-490. 3.Choi C., Chae C.: Enhanced detection of toxigenic Pasteurella multocida
directly from nasal swabs using a nested polymerase chain reaction. Vet. J. 2001, 162, 255-258.
4.Davies R. L., MacCorquodale R., Baillie S., Caffrey B.: Characterisation and comparision of Pasteurella multocida strains associated with porcine pneu-monia and atrophic rhinitis. J. Med. Microbiol. 2003, 52, 59-67.
5.de Jong M. F.: Progressive and nonprogressive atrophic rhinitis, [w:] Disease of swine. Wyd. Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA 2006, 577-602.
6.Done J. T., Upcott D. H., Frewin D. C., Herbert C. N.: Atrophic rhinitis: snout morphometry for quantitative assessment of conchal atrophy. Vet. Rec. 1984, 114, 33-35.
7.Eun-Kyung S., Yeon-Soo S., Jeong Hee H., Tae-Wook H.: Diversity of swine Bordetella bronchiseptica isolates evaluated by RAPD analysis and PFGE. J. Vet. Sci. 2007, 8, 65-73.
8.Gardner I. A., Kasten R., Eamens G. J., Snipes K. P., Anderson R. J.: Mole-cular fingerprinting of Pasteurella multocida associated with progressive atrophic rhinitis in swine herds. J. Vet. Diagn. Invest. 1994, 6, 442-447. 9.Kamp E. M., Bokken G. C. A., Vermeulen T. M. M., de Jong M. F., Buys H. E.,
Reek F. H., Smits M. A.: A specific and sensitive PCR assay suitable for large-scale detection of toxigenic P. multocida in nasal and tonsillar swabs speciments of pigs. J. Vet. Diagn. Invest. 1996, 8, 304-309.
10.Kaneman E. W., Winn W. C.: Miscellaneous fastidious gram-negative bacilli, [w:] Color atlas and textbook of diagnostic microbiology. Wyd. Lipicott Wil-liams&Wilkins 2006, 416-431.
11.Kêdrak A.: Fenotypowa i genotypwa charakterystyka szczepów Pasteurella multocida wyosobnionych od byd³a. Praca doktorska, Pu³awy 2004. 12.Koidl C., Bozic M., Burmeister A., Hess M., Marth E., Kessler H. H.:
Detec-tion and differentaDetec-tion of Bordetella spp. by Real-Time PCR. J. Clin. Micro-biol. 2007, 45, 347-350.
13.Lariveire S., Leblanc L., Mittal K. R., Martineau G. P.: Comparison of isola-tion methods for the recovery of Bordetella bronchiseptica and Pasteurella multocida from the nasal cavities of piglets. J. Clin. Microbiol. 1993, 31, 364-367.
14.Levonen K., Frandsen P. L., Seppanen J., Veijalainen P.: Detection of toxi-genic Pasteurella multocida infections in swine herds by assaying antibodies in sow colostrums. J. Vet. Diagn. Invest. 1996, 8, 455-459.
15.Lichtensteiger C. A., Steenbergen S. M., Lee R. M., Polson D. D., Vimr E. R.: Direct PCR analysis for toxigenic Pasteurella multocida. J. Clin. Microbiol. 1996, 34, 3035-3039.
16.Markowska-Daniel I., Samorek M., Stêpniewska K.: Wspó³czesne pogl¹dy na temat epidemiologii progresywnego i nieprogresywnego zakanego zani-kowego zapalenia nosa wiñ. Lecznica Du¿ych Zwierz¹t 2008, 1, 18-24. 17.Moreno A. M., Baccaro M. R., Ferreira A. J. P., Pestana de Castro A. F.: Use
of single-enzyme amplified fragment length polymorphism for typing Pasteurella multocida subsp. multocida isolates from pigs. J. Clin. Micro-biol. 2003, 41, 1743-1746.
18.Nagai S., Someno S., Yagihashi T.: Differentation of toxigenic from nontoxi-genic isolates of P. multocida by PCR. J. Clin. Microbiol. 1994, 32, 1004--1010.
19.Pejsak Z.: Pastereloza, Zakane zanikowe zapalenie nosa, Nieprogresywne zakane zanikowe zapalenie nosa (bordeteloza), [w:] Ochrona zdrowia wiñ. PWR Poznañ, 2007, 287-297.
20.Register K. B., DeJong K.: Analytical verification of a multiplex PCR Bor-detella bronchiseptica and Pasteurella multocida from swine. Vet. Microbiol. 2006, 117, 201-210.
21.Register K. B., Lee R. M., Thomson C.: Two-color hybridization assay for simultaneous detection of Bordetella bronchiseptica and toxigenic Pasteu-rella multocida from swine. J. Clin. Microbiol. 1998, 36, 3342-3346. 22.Stêpniewska K., Markowska-Daniel I.: Opracowanie testu PCR do
diag-nostyki zaka¿eñ wiñ wywo³ywanych przez Bordetella bronchiseptica. Bull. Vet Inst. Pulawy w druku.
23.Townsend K. M., Hanh T. X., OBoyle D., Wilkie I., Phan T. T., Wijewarda-na T. G., Trung N. T., Frost A. J.: PCR detection and aWijewarda-nalysis of Pasteurella multocida from the tonsils of slaughtered pigs in Vietnam. Vet. Microbiol. 2000, 72, 69-78.
Adres autora: prof. dr hab. Iwona Markowska-Daniel, ul. Sienkiewicza 35A, 24-100 Pu³awy; e-mail: iwonamd@piwet.pulawy.pl
