Artyku³ przegl¹dowy Review
Zaniepokojenie opinii publicznej obecnoci¹ w ro-dowisku zwi¹zków chemicznych, które mog¹ zak³ó-caæ funkcjonowanie uk³adu hormonalnego (endocrine disruptors, EDs) wynika z udokumentowanych przy-k³adów oddzia³ywania wielu zwi¹zków na zwierzêta dzikie oraz z wyników badañ eksperymentalnych i epi-demiologicznych. Ze wzglêdu na swoj¹ okrelon¹ aktywnoæ biologiczn¹ s¹ one szeroko stosowane jako leki, rodki ochrony rolin, dodatki do ¿ywnoci, wcho-dz¹ w sk³ad kosmetyków, rodków czystoci etc. (40). EDs mog¹ dzia³aæ na drodze wielu mechanizmów: poprzez aktywacjê lub blokadê w³aciwych dla hor-monów receptorów mog¹ odpowiednio naladowaæ lub hamowaæ dzia³anie naturalnych (endogennych) hormo-nów; wp³ywaj¹c na aktywnoæ enzymów zaanga¿o-wanych w steroidogenezê lub wi¹¿¹c siê z bia³kami nonikowymi mog¹ mieæ wp³yw na syntezê, transport, metabolizm lub wydalanie hormonów (35, 43). W re-zultacie takie wielokierunkowe oddzia³ywanie mo¿e prowadziæ do szeregu schorzeñ, stanowi¹c du¿e za-gro¿enie dla zdrowia publicznego.
Mo¿liwoci i ograniczenia badañ
Wykrywanie i monitorowanie obecnoci ró¿nych grup zwi¹zków w rodowisku oraz w ¿ywnoci jest mo¿liwe dziêki ogromnemu postêpowi, jaki dokona³ siê w zakresie rozwoju metod analitycznych (30). Na-tomiast ci¹gle odczuwa siê brak metod dla jednoznacz-nej oceny ich aktywnoci biologiczjednoznacz-nej (9, 50).
Poci¹-ga to za sob¹ problemy z ocen¹ ryzyka dla zdrowia cz³owieka (28, 38, 39). Istniej¹ce metody in vitro/in vivo, jakie opracowano na przestrzeni szeregu lat (16, 19, 42), obok okrelonych mo¿liwoci maj¹ tak¿e swoje ograniczenia (tab. 1). Ich znajomoæ jest nie-zbêdna do racjonalnego wykorzystania tych metod (18, 42, 45, 49). W ostatniej dekadzie uwaga wiata naukowego i ró¿nych organizacji miêdzynarodowych skupia³a siê na weryfikacji, udoskonaleniu i walidacji wybranych metod celem w³¹czenia ich do programów badañ nad zwi¹zkami hormonalnie aktywnymi (9, 10, 22, 32). Mimo pewnych ró¿nic, zarówno w USA, jak i w krajach UE, uda³o siê wypracowaæ kilkupozio-mowy schemat postêpowania obejmuj¹cy kolejno me-tody o wzrastaj¹cej wartoci predyktywnej uzyskiwa-nych z ich udzia³em wyników (22, 24). W ogólnym zarysie koncepcja badania wed³ug OECD obejmuje: ocenê wstêpn¹ poziom 1, badania skryningowe in vitro poziom 2 i badania in vivo poziom 3, 4 i 5 (tab. 2).
Ocena wstêpna jest etapem przygotowawczym i ma na celu okrelenie zakresu nara¿enia na dany zwi¹zek chemiczny, zgromadzenie (na podstawie dostêpnego pimiennictwa) danych na temat jego w³aciwoci fi-zykochemicznych i toksykologicznych.
Badania skryningowe in vitro dostarczaj¹ informacji odnonie do mechanizmu dzia³ania badanej substancji. Do wykrywania substancji estrogennych najbardziej popularne sta³y siê ustalone linie ludzkie raka piersi
Wykrywanie i ocena aktywnoci zwi¹zków
hormonalnie aktywnych
MARIA MINTA, SYLWIA STYPU£A-TRÊBAS
Zak³ad Farmakologii i Toksykologii Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Minta M., Stypu³a-Trêbas S.
Hormonally active compounds identification and assessment
Summary
During the last two decades concerns have been raised regarding the possible harmful effects of exposure to certain chemicals (natural and synthetic) that can modulate or disrupt the endocrine system (endocrine disrupters, EDs). Their identification and assessment is complicated by a number of mechanisms on which they act. As a result a variety of in silico/in vitro/in vivo methods are used. In this paper the most valuable methods for initial assessment, screening and testing are reviewed. To protect public health, future risk assess-ment of endocrine disrupters must take into account exposure to the mixtures in which different compounds can interact. The development of fast and sensitive bioassays is crucial to the achievement of this goal.
MCF-7 i T47D (10) oraz raka jajnika BG-1 (11). Jed-nym z pierwszych modeli do badañ substancji o dzia-³aniu androgennym by³a ludzka linia LNCaP, wyizo-lowana z przerzutów raka gruczo³u krokowego (31).
Ilociow¹ ocenê powinowactwa substancji do wy-izolowanych z komórek i tkanek receptorów dla estro-genów (ER) lub androestro-genów (AR) umo¿liwiaj¹ testy wi¹zania receptora. Nowe rozwi¹zania, polegaj¹ce na zast¹pieniu technik radiometrycznych polaryzacj¹ fluo-rescencyjn¹ umo¿liwiaj¹ wprowadzenie znaczników fluorescencyjnych w miejsce izotopowych. Dziêki temu testy wi¹zania receptora sta³y siê dostêpne tak¿e dla laboratoriów, w których techniki izotopowe nie mog¹ byæ stosowane (42).
Bogatszych informacji w porównaniu z testami wi¹-zania receptora dostarczaj¹ testy aktywacji transkryp-cyjnej. Pozwalaj¹ one oceniæ nie tylko zdolnoæ sub-stancji do wi¹zania z receptorami dla hormonów, ale tak¿e wskazuj¹ na biologiczne konsekwencje tego wi¹zania (16). Ich zastosowanie daje mo¿liwoæ
od-ró¿nienia agonistów od antago-nistów. Testy te wykorzystuj¹ dobrze poznany, genomowy mechanizm dzia³ania hormo-nów steroidowych, zgodnie z którym aktywacja receptora j¹drowego przez hormon regu-luje procesy transkrypcyjne, zale¿ne od rodzaju i stê¿enia liganda oraz czasu i miejsca jego dzia³ania (44). Modelem do badañ s¹ zmodyfikowane genetycznie komórki eukario-tyczne, do których wprowadzo-no plazmid ekspresji recepto-ra dla hormonu orecepto-raz gen repor-terowy (42, 44). W obecnoci zwi¹zków hormonalnie aktyw-nych dochodzi do ekspresji genu reporterowego, koduj¹-cego bia³ko, które mo¿e byæ ³atwo wykrywane i oznaczane za pomoc¹ metod spektrofotometrycznych, pomiarów fluorescencji lub luminescencji. W roli genów repor-terowych wykorzystywane s¹ geny â-galaktozydazy, lucyferazy oraz bia³ka zielonej fluorescencji (green fluorescent protein, GFP) (15, 46, 53). Chocia¿ pod-jêto prace nad walidacj¹ kilku sporód wielu dostêp-nych testów aktywacji transkrypcyjnej, dotychczas tyl-ko jeden, oparty na modyfityl-kowanych genetycznie ludz-kich komórkach raka szyjki macicy hERá-HeLa-9903, zosta³ w³¹czony w 2009 r. do katalogu metod OECD (8). Na uwagê zas³uguje fakt, ¿e testy aktywacji trans-krypcyjnej posiadaj¹ du¿y potencja³, jeli chodzi o wy-korzystanie w badaniach aktywnoci hormonalnej mie-szanin (44). W tym zakresie wykorzystywane s¹ m.in. testy oparte na transformowanych szczepach dro¿d¿y. O wyborze dro¿d¿y jako modelu do badania miesza-nin decyduj¹ nie tylko niskie koszty, ³atwoæ hodowli i podatnoæ na manipulacje genetyczne, ale przede wszystkim niewielka wra¿liwoæ na obecne w prób-kach zanieczyszczenia (53).
Tab. 1. Mo¿liwoci i ograniczenia metod in vitro/in vivo
Objanienia: * QSAR, quantity structure activity relationship (charakterystyka ilociowa zale¿noci strukturapowinowactwo); ** ADME, absorption, distribution, metabolism, excretion (absorpcja, rozmieszczenie, metabolizm, wydalanie)
y d o t e M Zalety Wadyiograniczenia o rt i v n I ) æ o n l a w y r k y w > ( a i n e ¿ ê t s e ³ a m a n æ o w il ¿ a r w a ¿ u d · iz d e i w o p d o æ o n z c if y c e p s a ¿ u d · * R A S Q i m a l e d o m z a i n a ³ a iz d ³ ó p s w æ o w il ¿ o m · ) h c y n z c i g o l o i b k e b ó r p ( n i n a z s e i m a i n a d a b æ o w il ¿ o m · ) y n e c o æ o n w y t k e i b o > ( e n a w o z y t a m o t u a z y d o t e m · h c y w o w e i s e z r p ñ a d a b a i n e z d a w o r p æ o w il ¿ o m · ) y tz s o k e i k s i n ( ñ a d a b o d ij c n a t s b u s i c o li e ³ a m · t ¹ z r e i w z a i c y ¿ u e i n e z c i n a r g o · * * E M D A k a r b · h c y n w y t a g e n / h c y n w y t y z o p e i w y z s ³ a f w ó k i n y w o k y z y r · ñ a d a b a l d ) m e z a k s w o g o r d ( m e i c r a p s w e i n y d e j æ y b ¹ g o m · invivo o v i v n I m zi n a g r o y ³ a c a n u w y ³ p w ê n e c o a i w il ¿ o m u o c * * E M D A ¹ j a i n d ê l g z w u · a i n a ³ a iz d w ó m zi n a h c e m s e r k a z i k o r e z s ¹ j u m j e b o · e w o d o r a n y z d ê i m e j c a zi n a g r o z e z r p e n a w o t p e c k a , e n a w o t n u r g u y d o t e m · a k s w e n a i n e c o · nikis¹(mog¹byæ?)przydatnewocenieryzyka :z e z r p e n a w o k if y d o m æ y b ¹ g o m ñ e z c d a i w o d i k i n y W h c y n j y r o t a r o b a l t ¹ z r e i w z a l d h c a z s a p w e tr a w a z y n e g o rt s e o ti f · y n e g o rt s e e n n e g o d n e ·
Tab. 2. Koncepcja badania zwi¹zków hormonalnie aktywnych wg OECD
Objanienia: * badania z u¿yciem zwierz¹t powinny byæ wykonywane z przestrzeganiem zasad dobrej praktyki laboratoryjnej i uzyskaniu zgody komisji etycznej; ** badania ekotok-sykologiczne l e C Zakresbadañ 1 m o iz o P h c y c ¹ j e i n t s i e i w a t s d o p a n w ó k z ¹ i w z r ó b y w i a j c k e l e s h c y n a d i c o w i c a ³ w o d e i n o n d o ij c a m r o f n i e i n e z d a m o r g z h c y n a d , a i n e ¿ a r a n u s e r k a z , h c y n z c i m e h c o k y zi f h c y n z c i g o l o k y s k o t 2 m o iz o P u m zi n a h c e m o d e i n o n d o ij c a m r o f n i e i n a k s y z u a i n a d a b a i n a ³ a iz d invirtoi/nsiilco , R T , R A , R E a r o t p e c e r a i n a z ¹ i w y t s e t ,j e n j y c p y r k s n a rt ij c a w y t k a y t s e t , y z a t a m o r a æ o n w y t k a i ê z e n e g o d i o r e t s a n w y ³ p w R A S Q e i n a w o l e d o m * 3 m o iz o P u t k e f e o g e n o l e r k o o d e i n o n d o ij c a m r o f n i e i n a k s y z u y t s e t e w o n i m r e t o k t ó r k o g e n n y r k o d n e invivo , a n n e g o rt s e ) y t n a ( æ o n w y t k a y c i c a m u t s o r z w t s e t , a n n e g o r d n a ) y t n a ( æ o n w y t k a a r e g r e b h s r e H t s e t h c a b y r a n y w o n i n e g o ll e ti w t s e t * * * 4 m o iz o P e w o i c ³ p y d ¹ z r a n i ê c y z c r a t a n u w y ³ p w e i n a n z o p utedsotyskdoonarjzloewnyan28ia-dpn³cioiowwyetegsottomksayrckzenroydco,irjzewania, b y r d a n o g e n z c i g o l o t a p o t s i h y n a i m z * * b a ¿ a z o fr o m a t e m * * * 5 m o iz o P a i n a d a b invivoobejmuj¹cekompleksow¹ocenê . c t e h c y n j y c k u d o r p e r ñ e z r u b a z , h c y n n y r k o d n e w ó t k e f e h c a k a s s a n e w o i n e l o k o p -2 /-1 a i n a d a b h c a k a t p , h c a b y r , h c a z a ³ p a n e n j y c k u d o r p e r y t s e t * *
Unikalnym modelem in vitro badania wp³ywu kse-nobiotyków na produkcjê hormonów p³ciowych jest linia NCI-H295R, wyprowadzona z komórek raka kory nadnerczy cz³owieka (21). Linia ta posiada fizjologicz-ne cechy strefowo niezró¿nicowanych komórek nad-nerczy p³odu i zdolnoæ do produkcji hormonów, jak¹ wykazuj¹ trzy fenotypowo zró¿nicowane strefy kory nadnerczy doros³ych, produkuj¹ce mineralokortyko-steroidy, glukokortykosteroidy i androgeny. Komórki NCI-H295R posiadaj¹ ponadto zdolnoæ ekspresji aro-matazy, kluczowego enzymu biosyntezy hormonów steroidowych pozwalaj¹cego na konwersjê androge-nów w estrogeny.
Dla identyfikacji zwi¹zków interferuj¹cych z meta-bolizmem steroidów u¿ywane s¹ testy wi¹zania recep-tora Ah. Receptor Ah jest bia³kiem regulatorowym, które wp³ywa na ekspresjê wielu genów, m.in. dla enzymów zaanga¿owanych w metabolizm steroidów i wielu ksenobiotyków. Wród najczêciej stosowanych metod wykrywania agonistów AhR s¹ testy in vitro wi¹zania receptora Ah oraz testy aktywacji transkryp-cyjnej AhR. Badania aktywacji transkryptranskryp-cyjnej recep-tora Ah najczêciej prowadzi siê z u¿yciem modeli in vitro opartych na hodowli komórek hepatomy ludzkiej (HepG2), mysiej (Hepa1c1c7) lub szczurzej (H4IIE). Aktywacja transkrypcyjna AhR mierzona jest pored-nio przez pomiar indukcji enzymów endogennych (np. etoksyrezorufiny-o-deetylazy, EROD) lub produktów ekspresji genów reporterowych (np. lucyferaza, GFP) wprowadzonych do DNA komórkowego na drodze transfekcji trwa³ej lub przejciowej, znajduj¹cych siê pod kontrol¹ promotora zale¿nego od AhR (13, 23).
Wród dodatkowych metod wykorzystywanych na tym etapie badañ s¹ modele in silico (quantitative struc-ture activity relationship, QSAR) pozwalaj¹ce okre-liæ korelacjê pomiêdzy molekularn¹ struktur¹ zwi¹z-ku i szwi¹z-kutkami biologicznymi w organizmie cz³owieka i/lub odpowiednich gatunków ekosystemu (34, 51). Modele takie znajduj¹ zastosowanie najczêciej w oce-nie nowych zwi¹zków, które w oce-nie przesz³y badañ tok-sycznoci i okaza³y siê bardzo wa¿n¹ metod¹ w ocenie ryzyka.
Badania in vivo wykonywane s¹ w testach krótko-terminowych, które dostarczaj¹ danych odnonie do ukierunkowanego dzia³ania endokrynnego (anty)es-trogennego lub (anty)androgennego oraz w badaniach d³ugoterminowych umo¿liwiaj¹cych kompleksow¹ ocenê efektów endokrynnych i towarzysz¹cych (25).
Do oceny efektów (anty) estrogennych u¿ywany jest test wzrostu macicy (uterotrophic assay) (6), który uznawany jest czasem za z³oty standard. Badanie wy-konuje siê na niedojrza³ych lub poddanych owariek-tomii, dojrza³ych p³ciowo samicach. Gatunkiem pre-ferowanym jest szczur. Zwierzêta otrzymuj¹ (p.o. lub s.c.) przez 3 kolejne dni badany zwi¹zek (minimum 2 poziomy dawkowania). Podstawowym efektem mie-rzonym jest zmiana masy macicy (wie¿ej i wysuszo-nej). Zwi¹zki estrogenne powoduj¹ zwiêkszenie,
anty-estrogenne zmniejszenie masy macicy, w porówna-niu z odpowiednimi grupami kontrolnymi.
Do wykrywania substancji dzia³aj¹cych (anty) an-drogennie przeznaczony jest test Hershbergera (Hersh-berger assay) (7). Celem wyeliminowania dzia³ania endogennych hormonów, badanie wykonuje siê na nie-dojrza³ych lub poddanych kastracji nie-dojrza³ych samcach szczura. Zwierzêta otrzymuj¹ (p.o. lub s.c.) przez 10 kolejnych dni badany zwi¹zek (minimum 2 poziomy dawkowania). Po up³ywie 24 godzin od ostatniego podania ustala siê masê narz¹dów docelowych dla an-drogenów: gruczo³u krokowego, pêcherzyków nasien-nych, gruczo³u opuszkowo-cewkowego, miênia opusz-kowo-g¹bczastego i ¿o³êdzi pr¹cia. Zwi¹zki o dzia³a-niu androgennym zwiêkszaj¹, natomiast antyandro-geny zmniejszaj¹ masê wymienionych narz¹dów. Wynik uznaje siê za pozytywny przy istotnej zmianie masy przynajmniej 2 narz¹dów.
Ze wzglêdu na fakt, ¿e wyniki uzyskiwane na zwie-rzêtach m³odych i dojrza³ych poddawanych kastracji s¹ porównywalne, coraz czêciej rezygnuje siê z wer-sji badania na zwierzêtach kastrowanych. Pozwala to na unikniêcie zabiegów przysparzaj¹cych bólu, co pozostaje w zgodzie z d¹¿eniem do humanitarnego traktowania zwierz¹t dowiadczalnych. Nale¿y jednak pamiêtaæ, ¿e wykonanie badania z u¿yciem m³odych (niedojrza³ych) zwierz¹t wymaga du¿o wiêkszych umiejêtnoci i precyzji przy wykonywaniu zabiegów. Nadmieniæ przy tym trzeba, ¿e zgodnie z wytycznymi OECD oba testy wykonywane s¹ najczêciej na szczu-rach, ale istniej¹ powa¿ne dowody naukowe, ¿e do-skona³ym modelem do badañ nad zwi¹zkami endo-krynnie czynnymi jest chomik z³ocisty (Mesocricetus auratus) (29). Zwierzê to posiada unikatowe cechy reprodukcyjne, takie jak: szybko osi¹gan¹ dojrza³oæ p³ciow¹ (6 tygodni), krótki okres ci¹¿y (16 dni), du¿¹ liczebnoæ miotu, rzadko wystêpuj¹ce wady sponta-niczne u p³odów oraz du¿¹ wra¿liwoæ uk³adu rozrod-czego na czynniki toksyczne.
Do wykrywania zwi¹zków oddzia³uj¹cych na go-nady i tarczycê przeznaczony jest 28-dniowy test tok-sycznoci, którego udoskonalona wersja zosta³a roz-szerzona o ocenê dodatkowych wskaników uzyski-wanych w badaniach histopatologicznych wybranych narz¹dów docelowych, badanie plemników i cyklu ru-jowego oraz pomiary poziomu hormonów tarczycy (3). Badaniem maj¹cym na celu m.in. wykrycie zwi¹z-ków oddzia³uj¹cych na hormony tarczycy jest 20-dnio-wy test dojrzewania p³ciowego samic i 21-dnio20-dnio-wy test dojrzewania samców (18). Wa¿nymi wskanikami pod-legaj¹cymi ocenie s¹ w nich: ustalenie terminu otwar-cia pochwy i pojawienia siê pierwszej rui u samic oraz wiek, w którym ma miejsce oddzielenie napletka. U samców okrela siê dodatkowo poziom hormonów (T4 i TSH) w surowicy oraz masê pêcherzyków na-siennych z gruczo³ami koaguluj¹cymi, gruczo³u kro-kowego, j¹der, naj¹drzy, tarczycy, przysadki, w¹troby, nerek i nadnerczy. Wybrane narz¹dy (w tym m.in.
tar-czyca, przysadka, j¹dra) poddawane s¹ ocenie histo-patologicznej.
Najwiêcej informacji dostarczaj¹ badania d³ugoter-minowe na gryzoniach (1, 2, 4, 5). Ze wzglêdu na fakt, ¿e ekspozycja na badany czynnik obejmuje wszystkie etapy cyklu reprodukcyjnego (badania jedno- i wielo-pokoleniowe), mo¿liwa jest ocena wp³ywu na ooge-nezê i spermatogeooge-nezê, zap³odnienie, miertelnoæ pre-i postnataln¹, p³odnoæ pre-i plennoæ, rozwój prenatalny (w tym dzia³anie teratogenne), zaburzenia behawio-ralne u potomstwa, wiek osi¹gniêcia dojrza³oci p³cio-wej, cyklicznoæ pojawiania siê rui i zachowania sek-sualne, okres starzenia siê uk³adu rozrodczego oraz zmiany histopatologiczne w obrêbie narz¹dów p³cio-wych, zarówno u osobników ¿eñskich, jak i mêskich.
Znaczenie badañ eksperymentalnych w ocenie ryzyka dla zdrowia
Badania in vitro umo¿liwiaj¹ poznanie mechanizmu dzia³ania badanej substancji i mog¹ byæ przydatne na etapie identyfikacji i charakterystyki zagro¿enia (14). Badania in vivo posiadaj¹ dwa aspekty: ilociowy, który ma na celu ustalenie, w jakim stopniu uzyskane na zwierzêtach wyniki badañ toksycznoci pozwalaj¹ na wyliczenie bezpiecznej dawki dla cz³owieka; ja-kociowy, który jest prób¹ udzielenia odpowiedzi na pytanie, w jakim stopniu stwierdzone u zwierz¹t reak-cje niepo¿¹dane mog¹ wyst¹piæ u ludzi.
W ocenie ilociowej d¹¿y siê do ustalenia najwy¿-szej dawki, po której nie obserwuje siê objawów szkod-liwego oddzia³ywania badanej substancji (no observed adverse effect level, NOAEL) i dawki najni¿szej powo-duj¹cej daj¹ce siê zauwa¿yæ efekty toksyczne (lowest observed adverse effect level, LOAEL). Po zastoso-waniu odpowiednich wspó³czynników bezpieczeñ-stwa, podyktowanych ró¿nicami gatunkowymi, rodza-jem i czasem nara¿enia, niepewnoci¹ wynikaj¹c¹ z ekstrapolacji wyników ze zwierz¹t na cz³owieka etc. s³u¿¹ one do wyznaczenia dopuszczalnych wartoci dziennego pobrania dla cz³owieka. Jednak w przypad-ku zwi¹zków hormonalnie aktywnych (podobnie jak w odniesieniu do zwi¹zków mutagennych) przydatnoæ wspomnianych wskaników budzi wiele kontrower-sji. Amerykañsk¹ alternatyw¹ dla NOAEL/LOAEL jest zaproponowana w 1984 r. tzw. dawka wyznaczaj¹ca (benchmark dose, BMD), w której punkt wyjcia (point of departure, POD) oparty jest na krzywych dawkaodpowied wyznaczonych dla najbardziej wra¿liwych wskaników (endpoints) istotnych w oce-nie ryzyka dla zdrowia cz³owieka (47).
W ocenie jakociowej wa¿n¹ rolê spe³niaj¹ biomar-kery (26). Biomarbiomar-kery s¹ to mierzalne zmiany w orga-nizmie i zachodz¹cych w nim procesach biochemicz-nych wywo³ane przez wch³oniêty ksenobiotyk. Na ich podstawie mo¿na uzyskaæ odpowiedzi na trzy podsta-wowe pytania:
czy organizm by³ nara¿ony na dzia³anie czynnika szkodliwego (biomarkery ekspozycji);
czy nara¿enie spowodowa³o skutki zdrowotne (biomarkery efektu);
czy osobnik jest wra¿liwy na dzia³anie danego zwi¹zku (biomarkery wra¿liwoci).
Przyk³adowym biomarkerem ekspozycji na estro-geny jest indukowanie witellogeniny u samców ryb (bia³ko to w normalnych warunkach jest obecne tylko u samic) (36). Z kolei zmiana aktywnoci enzymu mi-krosomalnego, etoksyrezorufiny (ethoxyresorufin-O--deethylase, EROD), jest wskanikiem nara¿enia na zwi¹zki halogenowe wêglowodorów aromatycznych (WWA) i zwi¹zki dioksynopodobne (52). W badaniach tych modelowymi gatunkami ryb s¹: karp, zêbacz ka-na³owy i p³otka, a ocenie podlegaj¹ najczêciej próbki rodowiskowe, takie jak woda i cieki (33).
Do markerów efektu dzia³ania EDs zaliczyæ mo¿na m.in. wskaniki oceniane we wspomnianych wczeniej badaniach na zwierzêtach np. zmiana masy macicy pod wp³ywem (anty)estrogenów. U ludzi najbardziej praw-dopodobnym objawem nara¿enia na EDs wydaj¹ siê zaburzenia mêskiego uk³adu rozrodczego (testicular dysgenesis syndrome, TDS) obejmuj¹ce nieprawid³o-we ujcie zewnêtrzne cewki moczonieprawid³o-wej (hypospadia-sis), wnêtrostwo (cryptorchismus), oligo-(azo)-spermiê i/lub nowotwory j¹der (12).
Podsumowanie
Ze wzglêdu na fakt, ¿e badania pojedynczych zwi¹z-ków nie odzwierciedlaj¹ sytuacji rzeczywistego nara-¿enia cz³owieka, coraz czêciej zwraca siê uwagê na potrzebê badania mieszanin (20, 27, 41). Eksperymen-talnie wykazano, ¿e kombinacja EDs mo¿e powodo-waæ istotne zmiany, nawet wówczas gdy poszczegól-ne zwi¹zki wystêpuj¹ w niewielkich stê¿eniach, indy-widualnie nie wykazuj¹cych zauwa¿alnych efektów (37, 48). Dotyczy to zw³aszcza mieszanin charaktery-zuj¹cych siê wspólnym mechanizmem dzia³ania (mode of action, MOA).
Wydaje siê zatem, ¿e z punktu widzenia ochrony zdrowia publicznego nowym wyzwaniem przy szaco-waniu ryzyka jest ocena skumulowanego nara¿enia na zwi¹zki biologicznie aktywne obecne w rodkach spo¿ywczych (17). Dobrym rozwi¹zaniem okazuj¹ siê biotesty, w których dokonuje siê pomiaru aktyw-noci biologicznej wyra¿aj¹cej sumaryczne obci¹¿e-nie próbki.
Pimiennictwo
1.Anon.: (1983) OECD TG 415 One-Generation Reproduction Toxicity Study. 2.Anon.: (1983) OECD TG 416 Two-Generation Reproduction Toxicity Study
(updated 2001).
3.Anon.: (1995) OECD TG 407: Repeated dose 28-day oral toxicity study in rodents. (Enhanced: updated 2008).
4.Anon.: (1995) OECD TG 421 Reproduction/Developmental Toxicity Screen-ing Test.
5.Anon.: (1996) OECD TG 422 Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Reproduction/Developmental Toxicity Screening Test.
6.Anon.: (2007) OECD TG 440: Uterotrophic bioassay in rodents: A short--term screening test for oestrogenic properties.
7.Anon.: (2009) OECD TG 441: Hershberger bioassay in rats. A short-term screening assay for (anti) androgenic properties.
8.Anon.: (2009) OECD TG 455: Stably transfected human estrogen receptor-á transcriptional activation assay for detection of estrogenic agonist-activity of chemicals.
9.Ashby J.: Scientific issues associated with the validation of in vitro and in vivo methods for assessing endocrine disrupting chemicals. Toxicology 2002, 181-182, 389-397.
10.Baker V. A.: Endocrine disrupters testing strategies to assess human hazard. Toxicol. in Vitro 2001, 15, 413-419.
11.Baldwin W. S., Curtis S. W., Caulhen C. A., Risinger J. I., Korach K. S., Barrett J. C.: BG-1 ovarian cell line: an alternative model for examining estrogen-dependent growth in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 1998, 34, 649-654.
12.Bay K., Asklund C., Skakkebaek N. E., Andersson A.-M.: Testicular dys-genesis syndrome: possible role of endocrine disruptors. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2006, 20, 77-90.
13.Behnisch P. A., Hosoe K., Sakai S.: Bioanalytical screening methods for dioxins and dioxin-like compounds a review of bioassay/biomarker tech-nology. Environ. Internat. 2001, 27, 413-439.
14.Blaauboer B. J.: The applicability of in vitro-derived data in hazard identifi-cation and characterisation of chemicals. Environ. Toxicol. Pharmacol. 2002, 11, 213-225.
15.Bovee T. F. H., Helsdingen R. J. R., Koks P. D., Kuiper H. A., Hoogenboom R. L. A. P., Keijer J.: Development of rapid yeast estrogen bioassay, based on the expression of green fluorescent protein. Gene 2004, 325, 187-200. 16.Charles G. D.: In vitro models in endocrine disruptor screening. ILAR J.
2004, 45, 491-501.
17.Charles G. D., Linscombe V. A., Tornesi B., Matson J. L., Gollapudi B. B.: An in vitro screening paradigm for extracts of whole foods for detection of potential toxicants. Food Chem. Toxicol. 2002, 40, 1391-1402.
18.Clode S. A.: Assessment of in vivo assays for endocrine disruption. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metabol. 2006, 20, 35-43.
19.Diel P., Schmidt S., Vollmer G.: In vivo systems for the quantitative and qualitative analysis of the biological activity of phytoestrogens. J. Chroma-togr. B 2002, 777, 191-202.
20.Filby A. L., Neuparth T., Thorpe K. L., Owen R., Galloway T. S., Tyler C. R.: Health impact of estrogens in the environment, considering complex mixture effects. Environ. Health Perspect. 2007, 115, 1704-1710.
21.Gazdar A., Oie H., Shackleton C., Chen T., Triche T., Myers C., Chrousos G., Brennan M., Stein C., La Rocca R.: Establishment and characterization of a human adrenocortical carcinoma cell line that expresses multiple pathways of steroid biosynthesis. Cancer Res. 1990, 50, 5488-5496.
22.Gelbke H. P., Kayser M., Poole A.: OECD test strategies and methods for endocrine disruptors. Toxicology 2004, 205, 17-25.
23.Giesy J. P., Hilscherova K., Jones P. D., Kannan K., Machala M.: Cell bio-assays for detection of aryl hydrocarbon (AhR) and estrogen receptor (ER) mediated activity in environmental samples. Marine Pollution Bull. 2002, 45, 3-16.
24.Gray L. E., Kelce W. R., Wiese T. et al.: Endocrine screening methods work-shop report: detection of estrogenic and androgenic hormonal and anti-hormonal activity for chemicals that act via receptor or steroidogenic enzyme mechanisms. Reprod. Toxicol. 1997, 11, 719-750.
25.Gray L. E. Jr., Foster P. M. D.: Significance of experimental studies for as-sessing adverse effects of endocrine-disrupting chemicals. Pure Appl. Chem. 2003, 75, 2125-2141.
26.Greim H.: Endpoints and surrogates for use in population studies in toxico-logy. Toxicol. Lett. 2001, 120, 395-403.
27.Groten J. P., Heijne W. H. M., Stierum R. H. Freidig A. P., Feron V.: Toxico-logy of chemical mixtures: a challenging quest along empirical sciences. Envi-ron. Toxicol. Pharmacol. 2004, 18, 185-192.
28.Harvey P. W., Everett D. J.: Regulation of endocrine-disrupting chemicals: Critical overview and deficiencies in toxicology and risk assessment for human health. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metabol. 2006, 20, 145-165. 29.Hendry W. J. III, Sheehan D. M., Khan S. A., May J. V.: Developing a labora-tory animal model for perinatal endocrine disruption: the hamster chronicles. Exp. Biol. Med. 2002, 227, 709-723.
30.Holland P. T.: Analysis of endocrine active substances in food and the envi-ronment. Pure Appl. Chem. 2003, 75, 1843-1857.
31.Horoszewicz J. S., Leong S. S., Chu T. M., Wajsman Z. L., Friedman M., Papsidero L., Kim U., Chai L. S., Kakati S., Arya S. K., Sandberg A. A.: The LNCaP cell line a new model for studies on human prostatic carcinoma. Prog. Clin. Biol. Res. 1980, 37, 115-132.
32.Huet M.-C.: OECD Activity on endocrine disrupters test guidelines develop-ment. Ecotoxicology 2000, 9, 77-84.
33.Hutchinson T. H., Ankley G. T., Segner H., Tyler C. R.: Screening and testing for endocrine disruption in fish biomarkers as signposts not traffic lights in risk assessment. Environ. Health Perspect. 2006, 114, 106-114.
34.Jacobs M. N.: In silico tools to aid risk assessment of endocrine disrupting chemicals. Toxicology 2004, 205, 43-53.
35.Janosek J., Hilscherová, Bláha L., Holoubek I.: Environmental xenobiotics and nuclear receptors- Interactions, effects and in vitro assessment. Toxicol. in Vitro 2006, 20, 18-37.
36.Jones P. D., De Coen W. M., Tremblay L., Giesy J. P.: Vitellogenin as a bio-marker for environmental estrogens. Water Sci. Technol. 2000, 42, 1-14. 37.Kortenkamp A.: Ten years of mixing coctails: a review of combination
effects of endocrine-disrupting chemicals. Environ. Health Perspect. 2007, 115, 98-105.
38.Martin O. V., Lester J. N., Voulvoulis N., Boobis A. R.: Human health and endocrine disruption: a simple multicriteria frame work for qualitative asses-sment of end point-specific risks in context of scientific uncertainty. Toxicol. Sci. 2007, 98, 332-347.
39.Mendes J. J. A.: The endocrine disrupters: a major medical challenge. Food Chem. Toxicol. 2002, 40, 781-788.
40.Minta M., Stypu³a-Trêbas S.: Zwi¹zki hormonalnie aktywne w rodowisku a zagro¿enia zdrowia publicznego. Medycyna Wet. 2010, 66, 525-529. 41.Monosson E.: Chemical mixtures: considering the evolution of toxicology
and chemical assessment. Environ. Health Perspect. 2005, 113, 383-390. 42.Mueller S. O.: Overview of in vitro tools to assess the estrogenic and
anti-estrogenic activity of phytoestrogens. J. Chromatogr. B 2002, 777, 155-165. 43.Rosselli M., Reinhart K., Imthurn B., Keller P. J., Dubey R. K.: Cellular and biochemical mechanisms by which environmental oestrogens influence re-productive function. Hum. Reprod. Update 2000, 6, 332-350.
44.Roy P., Alevizaki M., Huhtaniemi I.: In vitro bioassays for androgens and their diagnostic applications Hum. Reprod. Update 2008, 14, 73-82. 45.Saarinen N. M., Lorenzetti B. S., Mortensen A., Mäkelä S., Penttinen P.,
Sørensen I. K., Valsta L. M., Virgili F., Vollmer G., Wärri I. A., Zierau O.: Tools to evaluate estrogenic potency of dietary phytoestrogens: a consensus paper from the EU thematic network Ohytohelth (QLKI-2002-2453). Ge-nes Nutr. 2006, 1, 143-158.
46.Sanseverino J., Elridge M. L., Layton A. C., Easter J. P., Yarboriugh J., Schultz T. W., Sayler G. S.: Screening of potentially hormonally active chemicals using bioluminescent yeast bioreporters. Toxicol. Sci. 2009, 107, 122-134.
47.Setzer R. W. Jr., Kimmel C. A.: Use of NOAEL, benchmark dose, and other models for human risk assessment of hormonally active substances. Pure Appl. Chem. 2003, 75, 2151-2158.
48.Silva E., Rajapakse N., Kortenkamp A.: Something from nothing eight weak estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs signi-ficant mixture effects. Environ. Sci.Technol. 2002, 36, 1751-1756. 49.Soto A. M., Maffini M. V., Schaeberle C. M., Sonnenschein C.: Strengths and
weaknesses of in vitro assays for estrogenic and androgenic activity. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metabol. 2006, 20, 15-33.
50.Spearow J. L., Barkley M.: Reassessment of models used to test xenobiotics for oestrogenic potency is overdue. Hum. Reprod. 2001, 16, 1027-1029. 51.Walker J. D.: Application of QSARs in toxicology: a US Government
per-spective. J. Molec. Struct. (Theochem) 2003, 622, 167-184.
52.Whyte J. J., Jung R. E., Schmitt C. J., Tillitt D. E.: Ethoxyresorufin-O-de-ethylase (EROD) activity in fish as a biomarker of chemical exposure. Crit. Rev. Toxicol. 2000, 30, 347-370.
53.Witters H. E., Vangenechten C., Berckmans P.: Detection of estrogenie acti-vity in Flemish surface waters using an in vitro recombinant assay with yeast cells. Water Sci. Technol. 2001, 43, 117-123.
Adres autora: dr hab. Maria Minta, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: mamin@piwet.pulawy.pl
