Artyku³ przegl¹dowy Review
Problem fa³szowania ¿ywnoci towarzyszy ludz-koci na przestrzeni jej cywilizowanych dziejów. Rów-nie¿ obecnie, mimo stosowania coraz dok³adniejszych systemów kontroli oraz wci¹¿ doskonalonych metod wykrywania zafa³szowañ, spotyka siê je praktycznie we wszystkich ga³êziach przemys³u spo¿ywczego. Jed-nym z rodzajów fa³szowania ¿ywnoci pochodzenia zwierzêcego jest zmiana sk³adu przetworów wytwa-rzanych z miêsa deklarowanych gatunków zwierz¹t, po-legaj¹ca na dodaniu zwykle tañszych rodzajów miêsa pozyskiwanego od gatunków innych ni¿ wymienione w normach dla danego produktu czy na etykietach. Efektywne przeciwdzia³anie wspomnianym praktykom ma istotne znaczenie ze wzglêdu na ochronê zdrowia konsumentów (np. reakcje alergiczne), zapewnienie w³aciwej, zgodnej z deklarowan¹ przez producenta wartoci od¿ywczej produktów, na wyznawan¹ reli-giê, jak te¿ dla wsparcia wysi³ków zwi¹zanych z wpro-wadzaniem i utrzymaniem zasad sprawiedliwego han-dlu (fair-trade). Wykrywanie omawianych zafa³szowañ jest stosunkowo trudne nie tylko ze wzglêdu na ich specyfikê, ale równie¿ z powodu wykorzystywanych do ich rozpoznawania metod badawczych wymaga-j¹cych zatrudnienia wykwalifikowanego personelu laboratoryjnego. W prezentowanej pracy
przedstawio-no przedstawio-nowo-czesne metody laboratoryjne umo¿liwiaj¹ce identyfikacjê gatunkow¹ miêsa surowego i powsta³ych z niego przetworów.
Do identyfikacji gatunkowej miêsa oraz wykrywa-nia zafa³szowañ zwi¹zanych ze sk³adem gatunkowym przetworów miêsnych wykorzystuje siê dwie grupy metod, obejmuj¹cych techniki oparte na analizie bia-³ek lub umo¿liwiaj¹ce identyfikacjê i analizê DNA poszczególnych gatunków zwierz¹t rzenych.
Metody oparte na analizie bia³ek
Sporód tej grupy najszersze zastosowanie maj¹ metody immunologiczne, zw³aszcza techniki immu-noenzymatyczne, g³ównie typu ELISA (20, 21, 23, 29, 30). W odczynach tych u¿ywane s¹ swoiste przeciw-cia³a op³aszczone na mikrop³ytkach, skierowane prze-ciwko bia³kom charakterystycznym dla poszczegól-nych gatunków zwierz¹t. Bia³ka te pozyskane z bada-nych próbek miêsa lub przetworów miêsbada-nych w po-staci odpowiednich ekstraktów zostaj¹ zwi¹zane z przeciwcia³ami, tworz¹c kompleksy wykrywane przy u¿yciu znakowanych enzymem przeciwcia³, czêsto monoklonalnych. Doæ licznie proponowane warianty i zestawy ELISA umo¿liwiaj¹ identyfikacjê gatunko-w¹ miêsa w próbkach jednego gatunku, jak i próbkach
Nowoczesne metody badania sk³adu gatunkowego
miêsa i produktów miêsnych
BERNARD WASIÑSKI, JACEK OSEK
Zak³ad Higieny ¯ywnoci Pochodzenia Zwierzêcego,
Pañstwowy Instytut Weterynaryjny Pañstwowy Instytut Badawczy w Pu³awach, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Wasiñski B., Osek J.
New methods of meat species identification and detection of meat adulterations
Summary
Despite the permanent development of laboratory techniques, various types of adulterations are still a problem in the food industry. An important group among different frauds is adulterations connected with meat species authenticity. Uncovering of adulterated meat products is important inter alia for allergic individuals, for those who cant intake certain species because of religious beliefs, and for maintaining fair-trade. More subtle techniques used for the mentioned adulterations generate a need for the elaboration of better analytical methods to provide effective control of meat and meat products. The aim of this review is to present currently used laboratory methods applied for meat species identification and detection of adulterations in the declared composition of meat products. The first group of the described methods enables identification and analysis of proteins and the second presented group contains techniques of DNA analysis. Apart from their short characteristics, some disadvantages and potential problems found during work with certain methods are described.
stanowi¹cych mieszankê miêsa kilku gatunków zwie-rz¹t. Wiele zestawów umo¿liwia badanie próbek po obróbce termicznej. Zalet¹ testów ELISA jest mo¿li-woæ wykonania ich w warunkach rutynowych labo-ratoriów diagnostycznych, stosunkowo krótki czas badania, mo¿liwoæ jednoczesnej analizy znacznej liczby próbek, jak równie¿ eliminacja subiektywizmu przy odczycie i interpretacji wyników w przypadku u¿ycia automatycznego czytnika. Z prezentowanych przez niektórych autorów danych wynika, ¿e omawia-na metoda umo¿liwia³a np. wykrywanie w wyrobach z wo³owiny zawartoci miêsa wieprzowego ju¿ na po-ziomie 0,5% (23), zwykle limit wykrywalnoci waha siê jednak na poziomie 1-3%. Za mankament metody uwa¿a siê mo¿liwoæ wyst¹pienia reakcji krzy¿owych w przypadku badania próbek od blisko spokrew-nionych gatunków zwierz¹t rzenych (36). Niektórzy autorzy zwracali te¿ uwagê na ró¿nice w intensyw-noci reakcji barwnej, a tym samym oceny wyniku, w przypadku badania próbek poddanych obróbce ter-micznej (32).
Nieco prostsz¹ metod¹ immunoenzymatyczn¹ wy-korzystywan¹ doæ szeroko do przegl¹dowych badañ z zakresu identyfikacji gatunkowej jest test typu dip-stick. Jest to metoda jakociowa umo¿liwiaj¹ca bada-nie miêsa surowego i przetworów miêsnych bada-nie podda-nych obróbce termicznej oraz próbek mleka i surowi-cy (28). Jej zalet¹ jest krótszy ni¿ w przypadku ELISA czas badania oraz mo¿liwoæ wykonania w skromnie wyposa¿onym laboratorium, a nawet poza nim. Ogra-niczenie stanowi mo¿liwoæ analizy tylko próbek nie poddanych obróbce termicznej.
Inn¹ proponowan¹ metod¹ jest chromatografia cie-czowa (LC liquid chromatography), wykorzystywa-na do jakociowych (3, 11) i ilociowych (4) badañ sk³adu gatunkowego miêsa i jego przetworów. Ostat-nio coraz czêciej proponowane jest wykorzystanie wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC high performance liquid chromatography), pozwa-laj¹cej na uzyskanie rozdzia³u przy u¿yciu mniejszej iloci próbki i mniejszej objêtoci eluentu oraz w krót-szym czasie ni¿ w przypadku LC. Identyfikacji gatun-kowej miêsa lub produktów dokonuje siê na podsta-wie oznaczania obecnoci termostabilnych dwupep-tydów lub na podstawie analizy stosunku ilociowego nienasyconych kwasów t³uszczowych w trójglice-rydach (39). Efektywnoæ HPLC wykazano miêdzy innymi w oznaczaniu obecnoci bia³ek zwierzêcych w paszach (2, 38). Trudnoci w odczycie i interpreta-cji wyniku mog¹ byæ powodowane m.in. zmiennoci¹ sk³adu t³uszczowego i aminokwasowego tkanek bê-d¹ca efektem ró¿nego ¿ywienia zwierz¹t (35, 36).
Do identyfikacji gatunkowej miêsa wykorzystywane s¹ równie¿ metody elektroforetyczne. Umo¿liwiaj¹ one rozdzia³ i analizê zwi¹zków o ma³ej masie cz¹stecz-kowej, jak te¿ substancji o masie do 2 MDa. Rozdzia³ ten nastêpuje w wyniku przemieszczania siê
posiada-j¹cych ³adunek elektryczny cz¹stek w kierunku elek-trod. Zale¿nie od orodka, w którym prowadzony jest rozdzia³, wyró¿nia siê elektroforezê ¿elow¹ i kapilarn¹. Ta ostatnia wykorzystywana jest przede wszystkim do analizy DNA, znacznie rzadziej do analizy peptydów. W identyfikacji gatunkowej miêsa wykorzystywana jest SDS-PAGE (14, 17, 36). Umo¿liwia ona ustalenie masy cz¹steczkowej danego bia³ka przez porównanie ze standardami masy cz¹steczkowej. Istotn¹ zalet¹ tej metody jest mo¿liwoæ jej stosowania do badañ miêsa poddanego obróbce termicznej. Jako jej mankamenty wskazuje siê niezadowalaj¹ce limity detekcji oraz brak mo¿liwoci identyfikacji bia³ek o zbli¿onej masie cz¹s-teczkowej (36).
Elektroforeza kapilarna (CE capillary electropho-resis) przeprowadzana jest w cienkiej (rednica 25-100 µm), przypominaj¹cej z wygl¹du wiat³owód, rurce wype³nionej buforem. Po wprowadzeniu próbki do ka-pilary przyk³adane jest wysokie napiêcie elektryczne (10-30 kV). U wylotu kapilary znajduje siê detektor (spektrofotometryczny, fluorerscencyjny lub inny) ma-j¹cy za zadanie rejestracjê wychodz¹cych z kapilary zwi¹zków. Zaletami CE s¹: jej wysoka rozdzielczoæ i powtarzalnoæ (34). Zastosowanie metody elektro-forezy kapilarnej do identyfikacji gatunkowej wieprzo-winy, wo³owiny i miêsa indyczego opisali Vallejo--Cordoba i wsp. 1998 (41).
Korzystne limity detekcji w badaniach sk³adu ga-tunkowego wykazuje metoda ogniskowania izoelek-trycznego w gradiencie pH (IEF isoelectric focusing). Polega ona na rozdziale bia³ek w ¿elu zgodnie z war-tociami ich punktu izoelektrycznego. Umo¿liwia to rozró¿nienie bia³ek blisko spokrewnionych gatunków zwierz¹t, gdy¿ nawet w podobnych funkcyjnie bia³-kach sekwencje aminokwasowe mog¹ byæ ró¿ne (36). Ogniskowanie przeprowadzane jest w ¿elach poliakry-lamidowych nas¹czonych amfolitami, które w polu elektrycznym zostaj¹ uporz¹dkowane i tworz¹ zmie-niaj¹cy siê w sposób ci¹g³y gradient pH. Bia³ka wy-kazuj¹ w³aciwoci amfoteryczne (zale¿nie od pH rodowiska, w jakim siê znajduj¹, mog¹ byæ s³abymi kwasami lub zasadami) i przez to wêdruj¹ w polu elek-trycznym w kierunku pH przeciwnego ich ³adunkowi. W trakcie tego procesu badane bia³ka docieraj¹ w ¿elu do strefy wykazuj¹cej pH, w którym staj¹ one siê obo-jêtne elektrycznie (pH jest równe punktowi izoelek-trycznemu bia³ka) i przestaj¹ siê przemieszczaæ (36). Tak uzyskany rozdzia³ analizowany jest przez po-równanie z rozdzia³em wzorca. Analizê wyników IEF wykonuje siê z pomoc¹ densytometru i w³aciwego oprogramowania komputerowego. Omawiana metoda umo¿liwia identyfikacjê gatunkow¹ miêsa nie podda-nego obróbce termicznej, zarówno w przypadku pró-bek pochodz¹cych od jednego gatunku, jak i zawiera-j¹cych zmieszane miêso ró¿nych gatunków zwierz¹t (19, 33, 39). Ró¿ycki w swoich badaniach wykaza³, ¿e limit wykrywalnoci IEF w odniesieniu do miêsa
wiñ, byd³a i drobiu waha³ siê w granicach 0,2-2%, co by³o wynikiem lepszym od uzyskanego w SDS-PAGE, gdzie limit ten wyniós³ 3% (36).
Metody umo¿liwiaj¹ce identyfikacjê i analizê DNA
Od szeregu lat obserwuje siê intensywny rozwój la-boratoryjnych metod badawczych umo¿liwiaj¹cych identyfikacje i analizê materia³u genetycznego, w tym DNA poszczególnych gatunków zwierz¹t. Niew¹tpli-wymi zaletami, jakie niesie ze sob¹ mo¿liwoæ wyko-rzystania do badañ DNA s¹: jego obecnoæ w ka¿dej komórce, stosunkowo wysoka stabilnoæ i opornoæ na dzia³anie temperatury oraz iloæ zawartych w nim informacji (40).
Do identyfikacji gatunkowej surowego i poddane-go obróbce termicznej miêsa wiñ, byd³a, owiec, koni, drobiu wykorzystywano m.in. technikê hybrydyzacji DNA (7, 13, 22). Istotnymi jej zaletami s¹ limit wy-krywalnoci na poziomie 0,01-0,1% (12) i stosunko-wo niski koszt badania (5).
Metod¹ wykazuj¹c¹ jeszcze ni¿sze limity wykrywal-noci ni¿ hybrydyzacja DNA i coraz szerzej przysto-sowywan¹ do analiz sk³adu gatunkowego miêsa oraz jego przetworów jest reakcja ³añcuchowa polimerazy (PCR). W badaniach tych do przeprowadzenia ampli-fikacji wybiera siê czêsto fragmenty mitochondrialne-go DNA ze wzglêdu na du¿¹ jemitochondrialne-go iloæ w porównaniu z j¹drowym DNA (40). Oprócz wspomnianych, niskich limitów wykrywalnoci, siêgaj¹cych 0,005% (10), PCR wykazuje równie¿ wysok¹ specyficznoæ. U¿ycie me-tody multiplex PCR, umo¿liwiaj¹cej wykrywanie za pomoc¹ kilku par starterów podczas jednej reakcji kil-ku fragmentów DNA specyficznych dla ró¿nych ga-tunków zwierz¹t, zaproponowano miêdzy innymi do identyfikacji surowego i poddanego obróbce cieplnej miêsa wiñ, byd³a, kóz, owiec, kur i indyków (15, 31, 36).
Inn¹ modyfikacj¹ PCR, która w identyfikacji gatun-kowej miêsa pozwala ró¿nicowaæ nie tylko gatunki blisko spokrewnione, lecz nawet poszczególne rasy, jest technika PCR-RFLP bêd¹ca po³¹czeniem reakcji ³añcuchowej polimerazy z analiz¹ polimorfizmu d³u-goci fragmentów restrykcyjnych (RFLP restriction fragments length poymorphism) (25, 42, 44). Oma-wiana metoda polega na poddaniu produktu PCR trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, a uzyskany w trakcie elektroforezy obraz umo¿liwia identyfikacjê pochodzenia gatunkowego badanego miêsa. Warunkiem jednoznacznej oceny jest w³aci-wy dobór enzymów restrykcyjnych i posiadanie pró-bek wzorcowych (5, 40). Mankamentem omawianej techniki jest mo¿liwoæ wystêpowania wyników fa³-szywych spowodowanych mutacjami punktowymi w miejscach restrykcji oraz doæ wysoki limit wykry-walnoci (ok. 5%), ograniczaj¹cy wykorzystanie me-tody do wykrywania zafa³szowañ.
Produkty amplifikacji uzyskane w PCR mo¿na równie¿ poddawaæ sekwencjonowaniu (PCR-FINS forensically informative nucleotide sequencing). Wy-korzystanie tej techniki proponowano do identyfikacji gatunkowej miêsa (5), ale z wy³¹czeniem mo¿liwoci badania mieszanek miês ró¿nych gatunków zwierz¹t (36).
Kolejn¹, opart¹ na PCR technik¹ u¿ywan¹ do iden-tyfikacji gatunkowej jest losowa amplifikacja polimor-ficznego DNA (RAPD-PCR random amplified po-lymorphic DNA) (9, 37). Metoda polega na amplifi-kacji fragmentów DNA o ró¿nej d³ugoci przy u¿yciu pojedynczego, krótkiego startera, który wykazuje kom-plementarnoæ do sekwencji repetytywnych w danym genomie. Postêpowanie takie generuje amplifikacjê pewnej liczby fragmentów DNA o ró¿nej d³ugoci, specyficznych np. dla danego gatunku. Uwidacznia siê to podczas elektroforezy w postaci charakterystycz-nego wzoru pr¹¿ków. Zalet¹ metody jest relatywnie niski koszt, natomiast ograniczeniem zró¿nicowana powtarzalnoæ (4).
Wspomniane wy¿ej techniki oparte na analizie DNA maj¹ w identyfikacji gatunkowej miêsa zastosowanie przede wszystkim jako metody jakociowe. Spore nadzieje zwi¹zane z mo¿liwoci¹ wykorzystania tej grupy technik do badañ ilociowych w odniesieniu do analizy sk³adu gatunkowego miêsa i jego przetworów wydaje siê stwarzaæ real-time PCR, czyli reakcja ³añ-cuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (6, 27). Spotykane w pimiennictwie doæ liczne prace doty-cz¹ce tego zagadnienia wskazuj¹ na mo¿liwoæ efek-tywnego rozpoznawania omawian¹ metod¹ tkanek m.in. byd³a, wiñ, owiec, kóz, koni, os³ów, ró¿nych gatunków drobiu, ryb (1, 24, 26, 27). Czu³oæ propo-nowanych procedur umo¿liwia osi¹ganie limitu wy-krywalnoci na poziomie poni¿ej 0,05% (1, 24).
Szersze wykorzystanie real-time PCR do ilocio-wych badañ sk³adu gatunkowego wymaga jeszcze do-pracowania i wyjanienia istotnych zagadnieñ doty-cz¹cych ró¿nych elementów wa¿nych przy standary-zacji metody. Obejmuj¹ one miêdzy innymi kwestie wyboru w³aciwego sposobu okrelania (wyra¿ania) zawartoci miêsa poszczególnych gatunków w bada-nych przetworach, okrelenia wp³ywu naturalnej i spo-wodowanej obróbk¹ (np. ciepln¹) degradacji DNA w tkankach, wyboru w³aciwej frakcji DNA do ba-dañ, ustalenia wp³ywu, jaki wywiera na wyniki iloæ DNA w badanym materiale oraz cechy poszczegól-nych rodzajów DNA, np. mitochondrialnego lub j¹d-rowego (5).
Jednym z istotnych problemów jest sposób w³aci-wego przeliczenia iloci wykrytego DNA na iloæ od-powiadaj¹cej mu tkanki okrelonego gatunku zawar-tej w badanej mieszaninie lub produkcie. Zawartoæ (udzia³) tkanek mo¿e byæ wyra¿ana wagowo (procen-towo) w odniesieniu do wagi (odsetka zawartoci) in-nego komponentu dain-nego przetworu. Tymczasem przy
u¿yciu metody real-time wykrywana i okrelana mo¿e byæ iloæ DNA zawartego w badanej próbce. O ile na przyk³ad u ryb utrzymuje siê relatywnie sta³y stosu-nek miêdzy liczb¹ kopii genu transferyny a odpowia-daj¹c¹ jej wag¹ tkanki miêniowej (18), co umo¿liwia przeliczenie iloci wykrytego DNA na wagow¹ zawar-toæ miêni ryb, to w przypadku tkanek ssaków czy ptaków korelacja taka nie jest jednoznaczna. Wynika to miêdzy innymi z faktu, ¿e do przetworów wykorzy-stywana jest zwykle tkanka miêniowa ryb z ewentu-alnym niewielkim dodatkiem ich skóry i/lub tkanki kostnej, natomiast w przypadku ssaków czy ptaków oprócz miêni wykorzystywany mo¿e byæ te¿ t³uszcz i podroby (5). Stwierdzono, ¿e zawartoæ DNA mo¿-liwego do wyekstrahowania w tkance miêniowej drobiu i ssaków jest istotnie ni¿sza ni¿ w narz¹dach wewnêtrznych. U drobiu ró¿nice te mog¹ byæ nawet ponad dwudziestokrotne (8). Ponadto, w przypadku przetworów zawieraj¹cych miêso ssaków i ptaków, nale¿y braæ dodatkowo pod uwagê ró¿nice wielkoci genomów obu tych grup zwierz¹t.
Wspomniane powy¿ej zalety mitochondrialnego DNA warunkuj¹ jego przydatnoæ przede wszystkim do badañ jakociowych. Zmienna w komórkach po-szczególnych tkanek liczba mitochondriów, a zatem i zawartoæ mitochondrialnego DNA, znacznie utrud-nia badautrud-nia ilociowe oparte m.in. na technice real--time PCR, dlatego te¿ do wspomnianej metody zale-ca siê wykorzystanie j¹drowego DNA (5), co pozwala na miarodajne porównywanie iloci wykrywanego DNA pochodz¹cego z ró¿nych tkanek i od ró¿nych gatunków zwierz¹t. W przypadku j¹drowego DNA zwraca siê uwagê na mo¿liwoæ wykorzystania do real-time PCR sekwencji repetytywnych stanowi¹cych niekiedy znaczny odsetek genomu. Czêæ z tych sek-wencji bywa zdegradowana, co m.in. mo¿e utrudniaæ w³aciw¹ interpretacjê krzywej topnienia, a w konsek-wencji równie¿ standaryzacjê metody ilociowej (5).
Jedn¹ z proponowanych ostatnio innowacji w bada-niach sk³adu gatunkowego miêsa i jego przetworów jest po³¹czenie metod PCR i elektroforezy kapilarnej (34). Rozwi¹zanie to mo¿e mieæ obecnie zastosowa-nie przede wszystkim do badañ jakociowych. £¹czy ono w sobie wysok¹ czu³oæ i specyficznoæ PCR oraz zapewnian¹ przez CE wysok¹ rozdzielczoæ i mo¿li-woæ precyzyjnej analizy niewielkich objêtociowo próbek. W badaniach sk³adu gatunkowego CE ³¹czy siê przede wszystkim z PCR-RFLP (43). W oparciu o technikê microchip podjêto te¿ udan¹ próbê minia-turyzacji urz¹dzenia do CE. W rezultacie uzyskano rozwi¹zanie typu lab-on-a-chip. Jego zastosowanie w po³¹czeniu z PCR-RFLP pozwoli³o prawid³owo identyfikowaæ miêso kilkunastu gatunków ssaków i uzyskaæ lepsz¹ rozdzielczoæ fragmentów DNA ni¿ w przypadku elektroforezy w ¿elu agarozowym (16).
Nowoczesne techniki wdra¿ane do identyfikacji gatunkowej miêsa i kontroli zwi¹zanych z tym
zafa³-szowañ wykazuj¹ coraz wy¿sz¹ czu³oæ i specyficz-noæ. Wykorzystanie tych precyzyjnych i czu³ych me-tod zwi¹zane jest nie tylko z samym przedmiotem badañ, lecz równie¿ ze znacznymi niejednokrotnie kosztami surowców u¿ywanych do wytwarzania pod-dawanych kontroli produktów. O ile wyniki prac nad metodami badañ jakociowych wydaj¹ siê obecnie nieco wyprzedzaæ osi¹gniêcia w zakresie metod ilo-ciowych, to obserwowany wci¹¿ dynamiczny postêp pozwala przypuszczaæ, ¿e w najbli¿szym czasie do-stêpne bêd¹ równie¿ nowoczesne, precyzyjne i powta-rzalne metody, umo¿liwiaj¹ce badania ilociowe z za-kresu sk³adu gatunkowego miêsa i jego przetworów.
Pimiennictwo
1.Ali M. E., Hashim U., Mustafa S., Che Man Y. B., Dhahi T. S., Kashif M., Uddi M. K., Abd Hamid S. B.: Analysis of pork adulteration in commercial meatballs targeting porcine-specific mitochondrial cytochrome b gene by TaqMan probe real-time polymerase chain reaction. Meat Sci. 2012, 91, 454-459.
2.Aristoy M. C., Toldra F.: Histidine dipeptides HPLC-based test for the detection of mammalian proteins in feeds for ruminants. Meat Sci. 2004, 67, 211-217.
3.Ashor S. H., Monte W. C., Stiles P. G.: Liquid chromnatographic identifica-tion of meats. J. Offic. Analyt. Chemists 1988, 71, 397-403.
4.Ashor S. H., Osman M. A.: Liquid chromatographic quantitation of chicken and turkey in unheated chicken-turkey mixtures. J. Offic. Analyt. Chemists 1988, 71, 403-405.
5.Ballin N. Z., Vogesen F. K., Karlsson A. H.: Species determinantion Can we detect and quantify meat adulteration? Meat Sci. 2011, 83, 165-174. 6.Bartlett S. E., Davidson W. S.: FINS (forensically informative nucleotide
sequencing): A procedure for identifying the animal of origin of biological specimens. Biotechniques 1992, 12, 408-411.
7.Buntjer J. B., Lenstra J. A., Haagsma N.: Rapid species identification in meat using satellite DNAprobes. Lebensm. Unters. Forsch. 1995, 201, 577--582.
8.Buntjer J. B., Lamine A., Haagsma N., Lenstra J. A.: Species identification by oligonucleotide hybridisation: The influence of processing of meat products. J. Sci. Food Agric. 1999, 79, 53-57.
9.Calvo J., Zaragoza P., Osta R.: Random amplified poymorphic DNA finger-prints for identification of in poultry pare. Poultry Sci. 2001, 80, 522-524. 10.Calvo J., Zaragoza P., Osta R.: Technical note: A quick and more intensive
method to identify pork in processed and unprocessed food by PCR ampli-fication of a new specific DNA fragment. J. Anim. Sci. 2001, 79, 2108--2112.
11.Chou C. C., Lin S. P., Lee K. M., Hsu C. T., Vickroy T. W., Zen J. M.: Fast differentiation of meats from fifteen animal species by liquid chromatography with electrochemical detection using copper nonparticle plated electrodes. J. Chromatogr. B 2007, 846, 230-239.
12.Ebbehøj K. F., Thomsen P. D.: Differentiation of closely related species by DNA hybridization. Meat Sci. 1991, 359-366.
13.Ebbehøj K. F., Thomsen P. D.: Species differentiation of heated meat products by DNA hybridization. Meat Sci. 1991, 30, 221-234.
14.Etienne M., Jérome M., Fleurence J., Rehbein H., Kundiger R., Mendes R., Costa H., Perez-Martin R., Pineiro-Gonzales C., Craig A., Mackie I., Malmheden Yan I., Ferm M., Martinez I., Jessen F., Smelt A., Luten J.: Identification of fish speciesafter cooking by SDS-PAGE and urea IEF: a collaborative study. J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 2653-2658. 15.Eugster A., Ruf J., Rentsch J., Koppler R.: Quantification of beef, pork,
chicken and turkey proportion in sausages: use of matrix-adapted standards and comparison of single versus multiplex PCR in an interlaboratory trial. Eur. Food Res. Tech. 2009, 230, 55-61.
16.Fajardo V., González I., Dooley J., Garret S., Brown H. M., García T., Martín R.: Application of polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism analysis and lab-on-a-chip capillary electrophoresis for the specific identification of game and domestic meats. J. Sci. Food Agric. 2009, 89, 843-847.
17.Heinert H. H., Brehmer H., Baumann H. J., Klinger A.: Animal species examination of native muscle meat by means of standard gel electrophoresis (PAGE). Testing the reproducibility of examination results. Fleischwirtschaft 1998, 68, 386-389.
18.Hird H., Hold G., Christholm J., Reece P., Russel V. J., Brown J., Goodier R., MacArthur R.: Development of a method for quantification of of haddock (Melanogrammus aeglefinus) in commercial products usinc real-time PCR. Europ. Food Res. Technol. 2005, 220, 633-637.
19.Hofmann K.: Principal problems in the identification of meat species of slaughter animals using electrophoretic methods, [w:] Patterson R. L. S. (ed.): Biochemical identification of meat species. Elsevier, London 1985, 9-31. 20.Hossner K. L., Yemm R. S., Sonnenshein S. E., Mason G. L., Cummings B. A.,
Reddy M. C., Sofos J. N., Scanga J. A., Tatum J. D., Smith G. C., Belk K. E.: Comparison of immunochemical (enzyme-linked immunosorbent assay) and immunohistochemical methods for the detection of central nervous system tissue in meat products. J. Food Prot. 2006, 69, 644-650.
21.Hsieh Y. H., Sheu S. C., Bridgman R. C.: Development of a monoclonal anti-body specific to cooked mammalian meats. J. Food Ptot 1998, 61, 476-481. 22.Hunt D. J., Parkes H. C., Lumley I. D.: Identification of the species of origin of raw and cooked meat products using oligonucleotide probes. Food. Chem. 1997, 60, 437-442.
23.Jones S. J., Patterson R. L.: Double-antibody ELISA for detection of trace amounts of pig meat in raw meat mixtures. Meat Sci. 1985, 15, 1-13. 24.Jonker K. M., Tilburg J. J., Hagele G. H., de Boer E.: Species identification
in meat products using real-time PCR. Food Addit. Contam. Part A Chem. Anal. Control Expo. Risk Assess. 2008, 25, 527-533.
25.Kaupe B., Winter A., Fries R., Erhardt G.: DGAT1 polymorphism I Bos indicus and Bos taurus cattle breeds. J. Diar. Res. 2004, 71, 182-187. 26.Kesmen Z., Gulluce A., Sahin F., Yetim H.: Identification of meat species by
TaqMan-based real-time PCR assay. Meat Sci. 2009, 82, 444-449. 27.Laube I., Zagon J., Broll H.: Quantitative determination of commercially
relevant species in foods by real-time PCR. Internat. J. Food Sci. Technol. 2007, 42, 336-341.
28.Lees M.: Food authenticity and traceability. Woodhead Publishing Ltd. and CRC Press LLC, 2003.
29.Martín R., Azcona J. I., García T., Hernández P. E., Sanz B.: Sandwich ELISA for detection of horse meat in raw meat mixtures using antisera to muscle soluble proteins. Meat Sci. 1988, 22, 143-153.
30.Martín R., Wardale R. J., Jones S. J., Hernández P. E., Patterson R. L.: Monoclonal antibody sandwich ELISA for the potential detection of chicken meat in mixtures of raw beef and pork. Meat Sci. 1991, 30, 23-31. 31.Matsunaga T., Chikuni K., Tanabe R., Muroya S., ShibataK., Yamada J.,
Shimura Y.: A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 1999, 51, 143-148.
32.Patterson R. L., Jones S. J.: Review of current techniques for the verification of the species origin of meat. Analyst 1990, 115, 501-506.
33.Rehbein H.: Fish species identification by isoelectric focusing of sarco-plasma proteins. Electrophoresis84 Proc. of the 4th Meeting of the
Inter-national Electrophoresis Society, Gottingen 1984, s. 471-473.
34.Rodríguez-Ramírez R., González-Cordóva A. F., Vallejo-Cordoba B.: Review: Authentication and traceability of food from animal origin by poly-merase chain reaction-based capillary electrophoresis. Anal. Chem. Acta 2011, 685, 120-126.
35.Ró¿ycki M.: Metody identyfikacji gatunkowoci ¿ywnoci pochodzenia zwie-rzêcego. Pol. J. Human Nutr. 2000, 27 supl., 352-354.
36.Ró¿ycki M.: Zastosowanie elektroforezy i reakcji ³añcuchowej polimerazy (PCR) do identyfikacji gatunkowoci miêsa. Praca dokt. Pañstwowy Instytut Weterynaryjny PIB, Pu³awy 2011.
37.Saez R., Sanz Y., Toldra F.: PCR-based fingerprinting techniques for rapid detection of animal species in meat products. Meat Sci. 2004, 66, 659-665. 38.Schönherr J.: Analysis of products of animal origin in feeds by determina-tion of carnosine and related dipeptides by high-performance liquid chromato-graphy. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 1945-1950.
39.Skarpeid H. J., Kvaal K., Hildrum K. I.: Identification of animal species in ground meat mixtures by multivariate analysis of isoelectric focusing protein profiles. Electrophoresis 1998, 19, 3103-3109.
40.Targoñski Z., Stój A.: Zafa³szowania ¿ywnoci i metody ich wykrywania. ¯ywnoæ. Nauka. Technologia. Jakoæ. 2005, 4 supl., 30-40.
41.Vallejo-Cordoba B., Cota-Rivas M.: Meat species identification by linear discriminant analysis of capillary electrophoresis protein profiles. J. Capil. Elctroph. 1998, 5, 171-175.
42.Verkaar E. L. C., Nijman I. J., Bougata K., Lenstra J. A.: Differentiation of cattle species in beef by PCR-RFLP of mitochondrial and satellite DNA. Meat Sci. 2002, 60, 365-369.
43.Wang Q., Zhang X., Zhang H. Y., Zhang J., Chen G. Q., Zhao D. H., Ma H. P., Liao W. J.: Identification of 12 animal species meet by T-RFLP on the 12 rRNA-gene. Meat Sci. 2010, 85, 265-269.
44.Wolf C., Rentsch J., Hubner P.: PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: A reliable method for species identification. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 1350-1355.
Adres autora: dr Brenard Wasiñski, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: wasinski@piwet.pulawy.pl
