Artyku³ przegl¹dowy Review
Makroautofagia jest procesem fizjologicznym, po-legaj¹cym na degradacji bia³ek cytoplazmatycznych o d³ugim okresie pó³trwania oraz usuwaniu uszkodzo-nych organelli komórkowych w strukturach wakuolar-nych zwawakuolar-nych autofagosomami. Fuzja b³on autofago-somów z lizosomami zawieraj¹cymi enzymy hydroli-tyczne prowadzi do utworzenia autofagolizosomów, w których materia³ cytoplazmatyczny zawarty w tych strukturach podlega zniszczeniu (22). Znane s¹ rów-nie¿ dwie inne formy autofagii: mikroautofagia oraz autofagia zale¿na od bia³ek opiekuñczych (tzw. cha-peronów), jednak ze wzglêdu na fakt, i¿ w komórkach eukariotycznych najlepiej poznanym procesem jest makroautofagia, w dalszej czêci bêdzie ona opisywana pod ogólna nazw¹ autofagia.
W warunkach fizjologicznych autofagia s³u¿y ko-mórkom jako mechanizm kontroli jakoci cytoplaz-my i organelli, takich jak: mitochondria czy peroksy-somy, usuwaj¹c na bie¿¹co struktury, które uleg³y zniszczeniu np. pod wp³ywem starzenia siê komórek. Do intensyfikacji tego procesu dochodzi podczas stresu komórkowego, zwi¹zanego z obni¿eniem zawartoci czynników od¿ywczych, hipoksj¹ lub inwazj¹ pato-genów (27). W komórkach nab³onka gruczo³u mleko-wego u byd³a stwierdzono wyrany wzrost iloci auto-fagosomów podczas inwolucji tego narz¹du (39). Gruczo³ mlekowy podlega intensywnym przekszta³-ceniom strukturalnym oraz funkcjonalnym w czasie cyklu laktacyjnego. Cechy te mog¹ predysponowaæ go do inicjowania autofagii w warunkach stresu
komór-Regulacja autofagii przez hormony i czynniki wzrostu
w mammogenezie gruczo³u mlekowego krów
na modelu mammosfer
AGNIESZKA SOBOLEWSKA, GRA¯YNA P£UCIENNICZAK, MA£GORZATA GAJEWSKA*
Zak³ad Bioin¿ynierii Instytutu Biotechnologii i Antybiotyków, ul. Starociñska 5, 02-516 Warszawa
*Katedra Nauk Fizjologicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Nowoursynowska 159, 02-776 Warszawa
Sobolewska A., P³ucienniczak G., Gajewska M.
Hormones and growth factors regulating autophagy in bovine mammary epithelial cells during in vitro mammogenesis in 3D cultures
Summary
Autophagy is an important cellular process responsible for the maintenance of homeostasis in the mammary gland during its development and remodeling. The main function of autophagy is to degrade long-lived proteins and damaged organelles in double-membrane autophagic vacuoles containing hydrolytic enzymes. This process is also involved in the regulation of cell development and death.
Three-dimensional (3D) cell cultures made it possible to recreate in vitro the process of alveoli formation by mammary epithelial cells (MECs). When cultured on extracellular matrix (ECM) components, MECs form 3D acini structures called mammospheres, composed of a single layer of polarized cells and a hollow lumen in the center of the acini. It has been shown that during the process of mammosphere formation, autophagy is induced in the centrally located cells in response to the stress related to their loss of contact with the ECM. Studies have shown that the induction of autophagy is augmented in the presence of sex steroids, which regulate cell survival during starvation conditions. Additionally, these hormones control the process of lumen formation, regulating the rate of apoptotic death in mammospheres. TGF-â1 also induces autophagy in 3D cultures, but the presence of this cytokine inhibits the development of acinar structures. On the other hand, IGF-I stimulates the growth of mammospheres, inducing autophagy in the numerous cells located in the centre of acinar structures, where the availability of nutrition is insufficient. The present review article describes some latest studies that point to the role of the close regulation of autophagy by endocrine and intramammary signals during mammogenesis.
kowego. Dotychczas jednak mechanizm regulacji tego procesu jest ma³o poznany i niewiele jest prac powiê-conych temu tematowi.
Wp³yw hormonów i czynników wzrostu na rozwój gruczo³u mlekowego u byd³a
Na rozbudowê tkanki mi¹¿szowej gruczo³u mleko-wego u byd³a w czasie mammogenezy i laktogenezy bardzo istotny wp³yw maj¹ hormony ci¹¿owe i lakto-genne oraz lokalnie wydzielane czynniki wzrostu.
Rola hormonów steroidowych w gruczole mlekowym prze¿uwaczy zosta³a najlepiej poznana w kontekcie fizjologicznego rozwoju tego narz¹du. Steroidy p³cio-we odpowiadaj¹ g³ównie za aktywacjê proliferacji komórek nab³onka gruczo³owego podczas dojrzewa-nia samicy, stymuluj¹c wytwarzanie sieci kanalików mlekowych. Z kolei podczas ci¹¿y zwiêkszone stê¿e-nie estrogenów i progesteronu odpowiada za wyd³u-¿anie przewodów mlekowych oraz tworzenie pêche-rzyków wydzielniczych. Dodatkowo wydaje siê, ¿e 17â-estradiol spe³nia rolê nadrzêdn¹ w stosunku do progesteronu, reguluj¹c wra¿liwoæ komórek nab³on-kowych na progesteron. Wykazano, ¿e ekspresja re-ceptorów dla progesteronu (PR) jest indukowana przez aktywny receptor estrogenowy (ER) (19). 17â-estra-diol reguluje równie¿ ekspresjê prolaktyny odpowie-dzialnej za koñcowy etap funkcjonalnego ró¿nicowa-nia komórek nab³onka wydzielniczego (19). Z kolei prolaktyna kontroluje funkcjonalne ró¿nicowanie ko-mórek nab³onkowych, przygotowuj¹c je do syntezy bia³ek mleka, wydzielanych do wnêtrza pêcherzyków w okresie laktacji (29).
W regulacji rozwoju gruczo³u mlekowego u byd³a uczestnicz¹ tak¿e wydzielane endokrynnie, jak i auto/ parakrynnie czynniki wzrostu. Wród czynników wzro-stu znacz¹c¹ rolê w regulacji i stymulacji proliferacji komórek nab³onkowych w gruczole wykazuj¹: insu-linopodobny czynnik wzrostowy I (IGF-I) oraz naskórkowy czynnik wzrostowy (EGF). Czynniki te posiadaj¹ przede wszystkim w³aciwoci mitogenne i uczestnicz¹ w rozbudowie sieci przewodów mleko-wych w gruczole (15). IGF-I uwa¿any jest za czynnik parakrynny, który poredniczy w rozwoju narz¹du pod-czas mammogenezy i latogenezy poprzez przekazy-wanie komórkom sygna³ów od hormonu wzrostu (32). Z kolei EGF jest czynnikiem wykazuj¹cym ekspresjê w gruczole przede wszystkim w czasie laktacji (9). Wykazano jednak, ¿e nale¿y on równie¿ do pozytyw-nych regulatorów proliferacji komórek nab³onkowych, przyczyniaj¹c siê do rozbudowy tkanki wydzielniczej. Istniej¹ tak¿e dowody wiadcz¹ce o roli EGF w prze-kazywaniu sygna³ów mitogennych, pochodz¹cych od estrogenu do komórek zlokalizowanych w obszarze, tzw. koñcowych zawi¹zków gruczo³owych TEBs (terminal end buds) powstaj¹cych przewodów mleko-wych (1). Nale¿y zaznaczyæ, ¿e EGF posiada równie¿ w³asne receptory docelowe w komórkach nab³onka gruczo³u mlekowego, dziêki czemu swoicie pobudza
wzrost tych komórek, a receptory dla IGF-I reguluj¹ strukturê komórek, dzia³aj¹c za porednictwem bia³-ka IRS-1. Ponadto prowadzone badania wybia³-kaza³y, i¿ EGF podwy¿sza ekspresjê bia³ek wi¹¿¹cych IGF (IGFBPs), reguluj¹c w ten sposób dzia³anie IGF-I na komórki nab³onkowe (1).
Czynnikiem wzrostu, wykazuj¹cym w gruczole mle-kowym dzia³anie przeciwstawne w stosunku do wcze-niej omawianych bia³ek, jest transformuj¹cy czynnik wzrostowy beta 1 (TGF-â1). W wielu typach komó-rek pe³ni on przede wszystkim funkcjê czynnika anty-proliferacyjnego oraz proapoptotycznego (3). Badania in vivo na myszach wykaza³y, i¿ hamuje on wyd³u-¿anie i rozbudowê przewodów mlekowych oraz ró¿-nicowanie pêcherzyków wydzielniczych w gruczole (13). Ponadto wydaje siê, ¿e cytokina ta mo¿e regulo-waæ dzia³anie promitotycznego czynnika wzrostowego IGF-I poprzez zwiêkszenie stê¿enie bia³ek IGFBP-3 oraz IGFBP-4 w komórkach nab³onka gruczo³u mle-kowego byd³a (12). Jest wiêc prawdopodobne, ¿e wza-jemne zale¿noci pomiêdzy szlakami komórkowymi indukowanymi przez TGF-â1 i IGF-I pozwalaj¹ na w³aciw¹ kontrolê proliferacji oraz ró¿nicowania ko-mórek nab³onka gruczo³owego podczas rozwoju tego narz¹du.
Regulacja autofagii przez hormony steroidowe i laktogenne podczas mammogenezy
Indukcjê autofagii podczas tworzenia pêcherzyków wydzielniczych po raz pierwszy wykazano w bada-niach in vitro prowadzonych na ludzkich komórkach nab³onka gruczo³u sutkowego z zastosowaniem kul-tur przestrzennych (3D) (7, 11). W metodzie tej ko-mórki nab³onkowe hodowane s¹ na wyekstrahowanych bia³kach macierzy zewn¹trzkomórkowej (ECM extracellular matrix), tworz¹c agregaty, zwane mam-mosferami, które ró¿nicuj¹ siê w struktury pêcherzy-kowe przypominaj¹ce budow¹ pêcherzyki wydzielni-cze gruczo³u mlekowego (2, 8). Zaobserwowano, ¿e podczas tworzenia mammosfer komórki znajduj¹ce siê wewn¹trz struktury przestrzennej wykazuj¹ cechy autofagii (7). Mo¿e to byæ zwi¹zane ze stresem wyni-kaj¹cym z obni¿enia poda¿y sk³adników pokarmowych oraz sygna³ów pochodz¹cych od ECM. W wyniku d³ugotrwa³ego braku kontaktu z pod³o¿em komórki te podlegaj¹ mierci apoptotycznej i dochodzi do two-rzenia wiat³a pêcherzyka (7). Zjawisko to wykazano równie¿ w badaniach prowadzonych na bydlêcych komórkach linii BME-UV1 nab³onka gruczo³u mle-kowego hodowanych w kulturach 3D (34). O aktywa-cji autofagii podczas tworzenia struktur pêcherzyko-wych przez komórki BME-UV1 wiadczy³ wzrost poziomu aktywnej formy bia³ka LC3 (LC3-II), które jest uznawane za g³ówny marker autofagii lokalizu-j¹cy siê na powierzchni b³on autofagosomalnych (34). Ponadto zastosowano bia³ko fuzyjne GFP-LC3 (sprzê-¿enie LC3 z bia³kiem zielonej fluorescencji GFP (green fluorescence protein)), co umo¿liwi³o analizê
lokalizacji tego markera autofagii w komórkach. Ob-serwacje z u¿yciem mikroskopu konfokalnego wyka-za³y, ¿e najwy¿sza agregacja GFP-LC3 wystêpuje w centralnej czêci struktur przestrzennych (34).
Mechanizm regulacji autofagii w rozwoju gruczo³u mlekowego u byd³a dotychczas nie zosta³ do koñca poznany. Badania w³asne wykaza³y, i¿ w obecnoci 17â-estradiolu komórki nab³onka gruczo³owego linii BME-UV1 tworzy³y prawid³owo rozwiniête struktury pêcherzykowe na sk³adnikach ECM, a podczas tego procesu dochodzi³o do wzmo¿onej indukcji autofagii (34). Obserwacje z u¿yciem mikroskopu konfokalnego wykaza³y, i¿ zarówno apoptoza, jak i autofagia doty-czy³y komórek zlokalizowanych centralnie w powsta-j¹cych mammosferach, poniewa¿ agregacjê bia³ka GFP-LC3 obserwowano w centralnej czêci struktur (ryc. 1). Wyranie te¿ wzrasta³ poziom aktywnej kas-pazy-3 w hodowli, co wiadczy³o o intensywnym przebiegu apoptozy (34). Dotychczasowe badania do-tycz¹ce rozwoju gruczo³u mlekowego wskazywa³y g³ównie na mitogenny wp³yw steroidów p³ciowych na komórki nab³onka gruczo³owego w okresie dojrzewa-nia, dziêki czemu mo¿e dochodziæ do stymulacji wy-twarzania sieci przewodów mlekowych. Wyniki ba-dañ w³asnych po raz pierwszy pokaza³y, ¿e steroidy mog¹ równie¿ regulowaæ powstawanie pêcherzyków wydzielniczych poprzez indukcjê autofagii w komór-kach nab³onkowych. Potwierdzaj¹ to wczeniejsze wyniki dowiadczeñ prowadzonych na komórkach
linii BME-UV1, rosn¹cych w klasycznych kulturach jednowarstowych w obecnoci 17â-estradiolu lub pro-gesteronu (33). Badania te równie¿ pokazywa³y zwiêk-szenie aktywacji autofagii w komórkach pod wp³ywem zastosowanych steroidów. Mechanizm regulacji auto-fagii mo¿e mieæ tu pod³o¿e genomowe, wówczas ste-roidy p³ciowe, dzia³aj¹c w kompleksie ze specyficz-nymi dla siebie receptorami wewn¹trzkomórkowymi regulowa³yby transkrypcjê genów zwi¹zanych z auto-fagi¹. Z drugiej strony, obecnie znane jest równie¿ dzia³anie niegenomowe hormonów steroidowych. Mog¹ one aktywowaæ wewn¹trzkomórkowe, wtórne przekaniki szlaków sygna³owych (14). Tego typu sygna³y indukowane s¹ w komórkach bardzo szybko w ci¹gu kilku minut od przy³¹czenia hormonu do receptora (6). Wykazano, i¿ jedn¹ ze cie¿ek sygna³o-wych regulowanych na tej drodze jest szlak PI3K/Akt, który indukowany jest dziêki interakcji receptora estrogenowego (ER) z podjednostk¹ regulatorow¹ p85á kinazy PI3K (23). Receptory estrogenowe zwi¹-zane z b³onami maj¹ równie¿ zdolnoæ oddzia³ywania z bia³kiem efektorowym Shc, którego fosforylacja uruchamia kaskadê sygna³ow¹ zwi¹zan¹ ze szlakiem kinaz aktywowanych przez mitogen (MAPK): MAPK/ ERK (35). Kim i wsp. (18) wykazali, ¿e szlak ten, indukowany przez estrogeny, jest równie¿ powi¹zany ze szlakiem integrynowym poprzez kinazê Src, która poredniczy w indukcji sygna³ów proliferacyjnych i uruchamia aktywacjê MAP kinaz. Mo¿liwe jest wiêc,
Ryc. 1. Zdjêcia z mikroskopu konfokalnego przedstawiaj¹ce lokalizacjê procesu autofagii w strukturach przestrzennych tworzonych przez komórki nab³onka gruczo³u mlekowego u byd³a linii BME-UV1 transfekowanych wektorem GFP-LC3; komórki hodowano na Matrigelu w obecnoci prolaktyny, 17â-estradiolu, IGF-I, TGF-â1 przez okres 12 dni. Punktowe wie-cenie bia³ka fuzyjnego GFP-LC3 wiadczy o indukcji autofagii w komórkach
¿e efekt dzia³ania steroidów zale¿ny jest od po³o¿enia komórek w tkance mi¹¿szowej. W komórkach bêd¹-cych w bezporednim kontakcie z macierz¹ zewn¹trz-komórkow¹ przewa¿a efekt mitogenny steroidów, prze-kazywany poprzez aktywne receptory steroidowe (PR lub ER). Dzia³anie to podlega regulacji poprzez szlak integrynowy. Z kolei komórki zlokalizowane w cen-tralnej czêci powstaj¹cych struktur pêcherzykowych, pozbawione oddzia³ywañ z ECM indukuj¹ autofagiê, której efekt ochronny jest wzmacniany w obecnoci steroidów p³ciowych (11). D³ugotrwa³e pozbawienie tych komórek kontaktu z ECM powoduje jednak ak-tywacjê apoptozy, która w koñcowej fazie tworzenia struktur pêcherzykowych odpowiada za powstanie pustego wiat³a (34).
Innym znanym hormonem, który odgrywa istotn¹ rolê w prawid³owym rozwoju tkanki wydzielniczej gruczo³u mlekowego jest prolaktyna. Nasze badania wskazuj¹ jednak, i¿ sama prolaktyna nie jest czynni-kiem maj¹cym decyduj¹cy wp³yw na indukcjê auto-fagii podczas tworzenia mammosfer (34). Przyspie-sza ona jednak proces funkcjonalnego ró¿nicowania komórek nab³onka wydzielniczego. Przy braku pro-laktyny w rodowisku gruczo³owym obserwuje siê wy-kszta³cenie przewodów i przewodzików mlekowych, jednak nie dochodzi do powstawania pêcherzyków wydzielniczych, a nab³onek nie wykazuje zdolnoci sekrecyjnych (4). Prolaktyna nie tylko uruchamia ka-skadê sygna³ow¹, prowadz¹c¹ do aktywacji kinazy Jak2 oraz czynnika transkrypcyjnego Stat5, odpo-wiedzialnego za inicjacjê transkrypcji genów bia³ek mleka. Wp³ywa ona równie¿ na uwalnianie insuliny, zapewniaj¹c tym samym komórkom przystosowania metaboliczne niezbêdne do produkcji i sekrecji mleka (5). Ponadto prolaktyna wp³ywa na prawid³ow¹ pola-ryzacjê komórek tworz¹cych pêcherzyki wydzielnicze. Reguluje po³o¿enie oraz przepuszczalnoæ obwódek zwieraj¹cych, umo¿liwiaj¹c w czasie laktacji w³aci-wie ukierunkowan¹ sekrecjê sk³adników mleka do wiat³a pêcherzyka (30). W oddzia³ywaniach prolak-tyny na komórki nab³onka gruczo³u mlekowego uczest-niczy tak¿e macierz zewn¹trzkomórkowa. Wykazano, ¿e wyciszenie genu podjednostki â1-integryny, prze-kazuj¹cej komórkom nab³onka gruczo³owego sygna-³y od ECM, hamowa³o aktywnoæ szlaku Jak2/Stat5 indukowanego przez prolaktynê (25). Wydaje siê wiêc, ¿e podczas tworzenia struktur pêcherzykowych przez komórki linii BME-UV1 prolaktyna wzmacnia³a przede wszystkim sygna³y prowadz¹ce do polaryzacji oraz funkcjonalnego ró¿nicowania, natomiast obser-wowana autofagia indukowana by³a g³ównie jako pro-ces wtórny.
Regulacja autofagii przez czynniki wzrostu podczas mammogenezy
Czynniki wzrostu oddzia³uj¹ na komórki nab³onka gruczo³u mlekowego poprzez aktywacjê szlaków ini-cjuj¹cych proliferacjê. G³ównym z nich jest szlak PI3K/
Akt (20, 26, 31, 37). Udowodniono, ¿e w prawid³owo rozwijaj¹cych siê strukturach pêcherzykowych kontakt komórek nab³onkowych z ECM decyduje o aktywno-ci tej aktywno-cie¿ki sygna³owej. Dlatego te¿ zewnêtrzny pier-cieñ komórek, utrzymuj¹cy sta³y kontakt z pod³o¿em przy pomocy receptorów integrynowych, wykazuje aktywacjê kinaz PI3K oraz Akt d³u¿ej ni¿ komórki znajduj¹ce siê we wnêtrzu mammosfer (7). Yanochko i Eckhart (38), stosuj¹c model kultur 3D, wykazali, i¿ nadekspresja receptora dla IGF-I (IGFIR) w ludzkich komórkach nab³onka gruczo³u sutkowego linii MCF--10A prowadzi³a do powstawania du¿ych struktur prze-strzennych o nieregularnym kszta³cie i wype³nionym rodku, a fenotyp ten by³ zale¿ny od obecnoci w ro-dowisku liganda (IGF-I). Ponadto, w strukturach tych komórki wykazywa³y podwy¿szon¹ fosforylacjê/akty-wacjê kinazy Akt oraz kinazy mTOR, co skutkowa³o podwy¿szon¹ aktywnoci¹ proliferacyjn¹ i zahamowa-niem apoptozy. Zastosowanie inhibitora kinazy PI3K (LY294002) powodowa³o, i¿ komórki z nadekspresj¹ IGFIR by³y w stanie utworzyæ prawid³owe struktury pêcherzykowe. Z kolei rapamycyna inhibitor kinazy mTOR nie powodowa³a odwrócenia nieprawid³owe-go fenotypu, co sugeruje, i¿ ci¹g³a aktywacja IGFIR, prowadz¹ca do aktywacji szlaku komórkowego pored-niczonego przez kinazê Akt, nie prowadzi³a jedynie do indukcji mTOR, lecz aktywowa³a tak¿e alternatyw-ne cie¿ki prze¿ycia. Wyniki cytowanych badañ s¹ zbie¿ne z obserwacjami w³asnymi, prowadzonymi na bydlêcych komórkach nab³onka gruczo³owego linii BME-UV1. Dodanie do po¿ywki IGF-I skutkowa³o wytworzeniem du¿ych organoidów komórkowych, nie wykazuj¹cych struktury pêcherzykowej ani prawid-³owej polaryzacji. Podczas ca³ego okresu hodowli komórek linii BME-UV1 na sk³adnikach ECM w obec-noci IGF-I zachowane by³y po³¹czenia miêdzykomór-kowe we wszystkich komórkach tworz¹cych mammo-sfery (34). Sugeruje to, i¿ obecny w po¿ywce IGF-I silnie indukowa³ cie¿kê PI3K/Akt w komórkach linii BME-UV1, prowadz¹c do ich nadmiernej prolifera-cji. Badania te znajduj¹ potwierdzenie u Liu i wsp. (24), którzy wykazali, i¿ sta³a aktywnoæ kinazy PI3K uniemo¿liwia osi¹gniêcie przez komórki w³aciwej, szczytowo-podstawnej polaryzacji podczas tworzenia struktur przestrzennych. Zastosowanie IGF-I powodo-wa³o równie¿ hamowanie apoptozy w komórkach na-b³onka gruczo³u mlekowego u byd³a, co dodatkowo t³umaczy osi¹ganie przez tworzone struktury prze-strzenne wiêkszych rozmiarów (34). Jednoczenie pod wp³ywem dzia³ania IGF-I obserwowano wzrost akty-wacji autofagii w mammosferach. Obserwacje przy u¿yciu mikroskopii konfokalnej wykaza³y, i¿ komór-ki podlegaj¹ce autofagii znajduj¹ siê w centralnej czê-ci powstaj¹cych struktur, o czym wiadczy³a punkto-wa fluorescencja bia³ka fuzyjnego GFP-LC3 (ryc. 1). Wydaje siê zatem, i¿ podczas tworzenia struktur pê-cherzykowych w obecnoci IGF-I indukcja autofagii w komórkach zlokalizowanych w centralnej czêci
struktur pêcherzykowych mog³a nie byæ bezporedni¹ reakcj¹ tych komórek na dzia³anie czynnika wzrostu, lecz mieæ charakter wtórny. W powstaj¹cych du¿ych mammosferach kontakt z ECM mia³a bowiem jedynie czêæ najbardziej zewnêtrznych komórek, co powo-dowa³o narastanie warunków ograniczonego dostêpu do czynników od¿ywczych wewn¹trz struktury. Jed-noczenie komórki podlega³y ci¹g³ej stymulacji IGF-I obecnym w rodowisku. Sygna³y mog³y byæ przeka-zywane do wnêtrza struktur, poniewa¿ komórki te w toku rozwoju mammosfer nie utraci³y po³¹czeñ miê-dzykomórkowych. Indukcja autofagii pozwala³a wiêc przetrwaæ komórkom trudne warunki i kontynuowaæ wzrost. Przedstawione wyniki pokazuj¹, ¿e oddzia-³ywanie IGF-I na komórki nab³onka gruczo³u mleko-wego, niepodlegaj¹ce ¿adnej dodatkowej regulacji, nie zapewnia prawid³owego rozwoju pêcherzyków wydzielniczych. W warunkach in vivo musi zatem wystêpowaæ cis³a kontrola sygna³ów mitogennych, indukowanych przez te czynniki wzrostu lub przez inne czynniki wewn¹trzgruczo³owe. Zapewniaj¹ one funk-cjonalne ró¿nicowanie komórek nab³onkowych oraz wytworzenie w³aciwej organizacji tkanki wydzielni-czej. W regulacji sygna³ów indukowanych przez czyn-niki wzrostu bior¹ m.in. udzia³ hormony ci¹¿owe i lak-togenne oraz bia³ka wi¹¿¹ce IGF IGFBPs. Wykaza-no, i¿ estrogeny reguluj¹ cie¿ki sygna³owe induko-wane zarówno przez IGF-I, jak i EGF (15). Dzia³anie estrogenów polega na regulacji szlaków indukowanych przez IGF-I, ale równie¿ na indukcji IGFBP4, bêd¹ce-go inhibitorem tebêd¹ce-go czynnika wzrostu (23). Z kolei prolaktyna, wystêpuj¹ca w du¿ym stê¿eniu pod koniec ci¹¿y i w czasie laktacji hamuje ekspresjê tego bia³ka, umo¿liwiaj¹c czynnikowi IGF-I ponowne przekazywa-nie sygna³ów prze¿ycia do komórek nab³onkowych (36). Obecnoæ w rodowisku wewn¹trzgruczo³owym czynnika wzrostu TGF-â1 równie¿ mo¿e przyczyniaæ siê do regulacji procesu mammogenezy. Badania w³a-sne pokaza³y, ¿e komórki linii BME-UV1 nab³onka gruczo³u mlekowego u byd³a hodowane w obecnoci TGF-â1 tworzy³y mniejsze struktury pêcherzykowe, o nieprawid³owej polaryzacji oraz zahamowanym ró¿nicowaniu (34). Spowodowane mog³o to byæ zdol-noci¹ TGF-â1 do indukowania procesu przejcia komórek nab³onkowych w komórki mezenchymalne w procesie zwanym EMT (epithelial-to-mesenchymal transition) (21). Zaburzenia w tworzeniu struktur mo¿-na t³umaczyæ tak¿e antyproliferacyjnymi oraz proapop-totycznymi w³aciwociami tego czynnika wzrostu. Wykazano, ¿e TGF-â1 powodowa³ zahamowanie two-rzenia siê wiat³a pêcherzyków wydzielniczych (25) oraz prowadzi³ do jednoczesnej, znacznej indukcji autofagii i apoptozy (34). Indukcja autofagii nie ogra-nicza³a siê do centralnego obszaru struktur, lecz obej-mowa³a praktycznie wszystkie komórki struktury prze-strzennej, o czym wiadczy³o punktowe wiecenie agregatów bia³ka fuzyjnego GFP-LC3 (ryc. 1). Auto-fagia indukowana przez ten czynnik wzrostu mo¿e byæ traktowana jako wczesna obronna odpowied
komó-rek nab³onkowych na dzia³anie silnego, proapoptotycz-nego czynnika, a zatem powsta³e warunki stresogen-ne, jednak d³u¿sza ekspozycja komórek na dzia³anie TGF-â1 prowadzi³a ostatecznie do mierci ca³ych struktur (34). Dodatkowo badania Ewana i wsp. (10) pokazuj¹ mo¿liwoæ wystêpowania wzajemnych za-le¿noci pomiêdzy promitotycznym wp³ywem estro-genów a antyproliferacyjnym wp³ywem TGF-â1 na komórki nab³onkowe rosn¹ce w hodowlach 3D. Naj-nowsza teoria zak³ada, i¿ kontakt komórek z macierz¹ zewn¹trzkomórkow¹ umo¿liwia wydzielanemu auto/ parakrynnie czynnikowi TGF-â1 hamowanie prolife-racji komórek nab³onka gruczo³u mlekowego induko-wanej przez hormony steroidowe, jednak oddzia³ywa-nie komórek z pod³o¿em poprzez receptory integry-nowe chroni komórki przed dzia³aniem apoptogennym tej cytokiny (17).
Podsumowanie
Podsumowuj¹c mo¿na wnioskowaæ, i¿ hormony i czynniki wzrostu wywieraj¹ istotny wp³yw na kszta³-towanie siê struktur pêcherzykowych przez komórki nab³onka gruczo³u mlekowego podczas mammoge-nezy. Hormony, takie jak steroidy p³ciowe, stymuluj¹ tempo tworzenia pêcherzyków wydzielniczych, przy-czyniaj¹c siê nie tylko do w³aciwej polaryzacji ko-mórek nab³onkowych, ale równie¿ do indukcji apop-tozy oraz autofagii, uczestnicz¹cych w rozwoju tych struktur. Wydaje siê, i¿ istnieje szczególna wspó³-zale¿noæ autofagii i apoptozy w tworzeniu w pe³ni wykszta³conych pêcherzyków wydzielniczych w gru-czole mlekowym. Autofagia pojawia siê jako pierw-sza w centralnie po³o¿onych komórkach, pocz¹tkowo chroni¹c je przed stresem wywo³anym brakiem kon-taktu z macierz¹ zewn¹trzkomórkow¹. Brak konkon-taktu z ECM kreuje stan, w którym komórki nie otrzymuj¹ odpowiednich sygna³ów ¿yciowych, co powoduje indukcjê autofagii jako mechanizmu mobilizuj¹cego rezerwy aminokwasowe i energetyczne, szczególnie w obliczu nasilenia wp³ywu czynników stresowych o dzia³aniu apoptotycznym. W kolejnym etapie roz-woju struktur pêcherzykowych pojawia siê apoptoza, powoduj¹c mieræ komórek, w celu oczyszczenia wia-t³a struktur. W tym z³o¿onym procesie mammogenezy zadaniem czynników wzrostu o dzia³aniu mitogennym, takich jak IGF-I jest m.in. hamowanie procesu mier-ci w komórkach, które utramier-ci³y kontakt z mamier-cierz¹ zewn¹trzkomórkow¹, co wzmaga indukcjê ochronne-go procesu autofagii. Z kolei TGF-â1 mo¿e zaburzaæ proces tworzenia struktur pêcherzykowych poprzez swoje dzia³anie antyproliferacyjne oraz powodowaæ hamowanie procesu polaryzacji komórek nab³onko-wych. TGF-â1 powoduje tak¿e siln¹ indukcjê apopto-zy i autofagii, zatem aktywacja synteapopto-zy tego capopto-zynnika wzrostowego w okresie rozwoju gruczo³u mlekowe-go musi podlegaæ cis³ej kontroli przez inne czynniki endokrynne oraz wewn¹trzgruczo³owe, aby proces rozwoju struktur pêcherzykowych móg³ przebiegaæ prawid³owo.
Pimiennictwo
1.Ankrapp D. P., Bennett J. M., Haslam S. Z.: Role of epidermal growth factor in the acquisition of ovarian steroid hormone responsiveness in the normal mouse mammary gland. J. Cell Physiol. 1998, 174, 251-260.
2.Barcellos-Hoff M. H., Aggeler J., Ram T. G., Bissell M. J.: Functional dif-ferentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development 1989, 105, 223-235. 3.Benson J. R.: Role of transforming growth factor beta in breast
carcinogene-sis. Lancet Oncol. 2004, 5, 229-239.
4.Brisken C., Kaur S., Chavarria T. E., Binart N., Sutherland R. L., Weinberg R. A., Kelly P. A., Ormandy C. J.: Prolactin controls mammary gland deve-lopment via direct and indirect mechanisms. Dev. Biol. 1999, 210, 96-106. 5.Brisken C., Rajaram R. D.: Alveolar and lactogenic differentiation. J.
Mam-mary Gland Biol. Neoplasia. 2006, 11, 239-248.
6.Cheskis B. J., Greger J. G., Nagpal S., Freedman L. P.: Signaling by estro-gens. J. Cell Physiol. 2007, 213, 610-617.
7.Debnath J., Mills K. R., Collins N. L., Reginato M. J., Muthuswarny S. K., Brugge J. S.: The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell 2002, 111, 29-40.
8.Debnath J., Muthuswamy S. K., Brugge J. S.: Morphogenesis and oncogene-sis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional base-ment membrane cultures. Methods 2003, 30, 256-268.
9.DiAugustine R. P., Richards R. G., Sebastian J.: EGF-related peptides and their receptors in mammary gland development. J. Mammary Gland Biol. Neopl. 1997, 2, 109-117.
10.Ewan K. B., Shyamala G., Ravani S. A., Tang Y., Akhurst R., Wakefield L., Barcellos-Hoff M. H.: Latent transforming growth factor-beta activation in mammary gland: regulation by ovarian hormones affects ductal and alveolar proliferation. Am. J. Pathol. 2002, 160, 2081-2093.
11.Fung Ch., Lock R., Gao S., Salas E., Debnath J.: Induction of autophagy during Extracellular Matrix detachment promotes cell survive. Mol. Biol. Cell. 2008, 19, 797-806.
12.Gajewska M., Motyl T.: IGF-binding proteins mediate TGF-â1-induced apoptosis in bovine mammary epithelial BME-UV1 cells. Comp. Biochem. Physiol. Part C. 2004, 139, 65-75.
13.Gorska A. E., Joseph H., Derynck R., Moses H. L., Serra R.: Dominant--negative interference of the transforming growth factor beta type II receptor in mammary gland epithelium results in alveolar hyperplasia and differentia-tion in virgin mice. Cell Growth Differ. 1998, 9, 229-238.
14.Hammes S. R., Levin E. R.: Extranuclear steroid receptors: nature and actions. Endocr. Rev. 2007, 28, 726-741.
15.Imagawa W., Pedchenko V. K., Helber J., Zhang H.: Hormone/growth factor interactions mediating epithelial/stromal communications in mammary gland development and carcinogenesis. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2002, 80, 213-230.
16.Karantza-Wadsworth V., Patel S., Kravchuk O., Chen G., Mathew R., Jin S., White E.: Autophagy mitigates metabolic stress and genome damage in mammary tumorigenesis. Genes Dev. 2007, 21, 1621-163.
17.Katz E., Streuli C. H.: The extracellular matrix as an adhesion checkpoint for mammary epithelil function. Int. J. Biochem. 2007, 39, 715-726. 18.Kim H., Laing M., Muller W.: c-Src-null mice exhibit defects in normal
mammary gland development and ERalpha signaling. Oncogene 2005, 24, 5629-5636.
19.Lamote I., Meyer E., Massart-Leen A. M., Burnvenich C.: Sex steroids and growth factors in the regulation of mammary gland proliferation, differentia-tion and involudifferentia-tion. Steroids 2004, 69, 145-159.
20.LaRocca J., Pietruska J., Hixon M.: Akt1 Is essential for postnatal mammary gland development, function, and the expression of Btn1a1. PLoS One 2011, 6(9), e24432.
21.Lenferink A. E., Magoon J., Cantin C., OConnor-McCourt M. D.: Investi-gation of three new mouse mammary tumor cell lines as models for trans-forming growth factor (TGF)-beta and Neu pathway signaling studies: iden-tification of a novel model for TGF-beta-induced epithelial-to-mesenchymal transition. Breast Cancer Res. 2004, 6, 514-530.
22.Lemasters J. J., Qian T., He L., Kim J. S., Elmore S. P., Cascio W. E., Brenner D. A.: Role of mitochondrial inner membrane permeabilization in necrotic cell death, apoptosis and autophagy. Antioxid. Redox. Signal. 2002, 4, 769-781.
23.Li R. W., Capuco A. V.: Canonical pathways and networks regulated by estro-gen in the bovine mammary gland. Funct. Integr. Genomics. 2008, 8, 55-68. 24.Liu H., Radisky D. C., Wang F., Bissell M. J.: Polarity and proliferation are controlled by distinct signaling pathways downstream of PI3-kinase in breast epithelial tumor cells. J. Cell Biol. 2004, 164, 603-612.
25.Mailleux A. A., Overholtzer M., Bruggle J. S.: Lumen formation during mammary epithelial morphogenesis: insights from in vitro and in vivo models. Cell Cycle. 2008, 7, 57-62.
26.Marshman E., Green K. A., Flint D. J., White A., Streuli C. H., Westwood M.: Insulin-like growth factor bidning protein 5 and apoptosis in mammary epi-thelial cells. J. Cell Sci. 2003, 116(Pt 4), 675-682.
27.Mizushima N.: The pleiotropic role of autophagy: from protein metabolizm to bactericide. Cell Death Differ. 2005, 12, 1535-1541.
28.Naylor M. J., Li N., Cheung J., Lowe E. T., Lambert E., Marlow R., Wang P., Schatzmann F., Winter Mantel T., Schuetz G., Clarke A. R., Mueller G., Hynes N. E., Streuli C. H.: Ablation of beta1 integrin in mammary epithe-lium reveals a key role for integrin in glandular morphogenesis and differen-tiation. J. Cell Biol. 2005, 171, 717-728.
29.Neville M. G., McFadden T. B., Forsyth L.: Hormonal regulation of mammary differentiation and milk secretion. J. Mammary Gland Biol. Neopl. 2002, 7, 49-66.
30.Nguyen D. A., Parlow A. F., Neville M. C.: Hormonal regulation of tight junction closure in the mouse mammary epithelium during the transition from pregnancy to lactation. J. Endocrinol. 2001, 170, 347-356.
31.Ramljak D., Christine M., Coticchia C. M., Nishanian T. G., Motoyasu Saji M., Ringel M. D., Conzen S. D., Dicksona R. B.: Epidermal growth factor inhibition of c-Myc-mediated apoptosis through Akt and Erk involves Bcl-xL upregulation in mammary epithelial cells. Exper. Cell Research 2003, 287, 397-410.
32.Ruan W., Catanese V., Wieczorek R., Feldman M., Kleinberg D. L.: Estradiol enhances the stimulatory effect of insulin-like growth factor-I (IGF-I) on mammary development and growth hormone-induced IGF-I messenger ribo-nucleic acid. Endocrinol. 1995, 136, 1296-1302.
33.Sobolewska A., Gajewska M., Zarzyñska J., Gajkowska B., Motyl T.: IGF-I, EGF and sex steroids regulate autophagy in bovine mammary epithelial cells via mTOR pathway. Eur. J. Cell Biol. 2009, 88, 117-130.
34.Sobolewska A., Motyl T., Gajewska M.: Role and regulation of autophagy in the development of acinar structures formed by bovine BME-UV1 mammary epithelial cells. Eur J. Cell Biol. 2011, 90, 854-864.
35.Song R. X., McPherson R. A., Adam L., Bao Y., Shupnik M., Kumar R., Santen R. J.: Linkage of rapid estrogen action to MAPK activation by ERalpha-Shc association and Shc pathway activation. Mol. Endocrinol. 2002, 16, 116-127.
36.Tonner E., Barber M. C., Travers M. T., Logan A., Flint D. J.: Hormonal control of insulin-like growth factor binding protein-5 (IGFBP-5) produc-tion in the involuting mammary gland of the rat. Endocrinol. 1997, 138, 5101-5107.
37.Wickenden J. A., Watson C. J.: Key signaling in mammary gland develop-ment and cancer. Signalling downstream of PI3 kinase in mammary epithe-lium: a play in 3 Akts. Breast Cancer Res. 2010, 12, 202.
38.Yanochko G. M., Eckhart W.: Type I insulin-like growth factor receptor over-expression induces proliferation and anti-apoptotic signaling in a three--dimensional culture model of breast epithelial cells. Breast Cancer Res. 2006, 8, R18.
39.Zarzynska J., Gajkowska B., Wojewódzka U., Dymnicki E., Motyl T.: Apo-ptosis and autophagy in involuting bovine mammary gland is accompanied by up-regulation of TGF-â1 and suppression of somatotropic pathway. Polish J. Vet. Sci. 2007, 10, 1-9.
Adres autora: dr Ma³gorzata Gajewska, ul. Nowoursynowska 159, 02-776 Warszawa; e-mail: malgorzata_gajewska@sggw.pl
