Artyku³ przegl¹dowy Review
Weterynaryjna diagnostyka laboratoryjna chorób za-kanych jest podstaw¹ ich skutecznego zwalczania. Ma znaczenie nie tylko w ograniczaniu strat w produkcji zwierzêcej, w tym trzody chlewnej, ale te¿ ze wzglêdu na identyfikowanie w wymienionym rezerwuarze drob-noustrojów zoonotycznych, co jest istotne w zapobie-ganiu chorobom odzwierzêcym cz³owieka. W opraco-wywaniu testów diagnostycznych uwzglêdniane s¹ naj-nowsze osi¹gniêcia bakteriologii, wirusologii, immuno-logii, biologii molekularnej i genetyki.
Standaryzacja i harmonizacja
Z uwagi na niezbêdnoæ standaryzacji i harmonizacji testów diagnostycznych nie tylko w obrêbie kraju, ale równie¿ w skali miêdzynarodowej, du¿¹ rolê odgrywa od lat w tej tematyce z punktu widzenia pañstwowych s³u¿b weterynaryjnych wiatowa Organizacja Zdrowia Zwierz¹t OIE (World Organisation for Animal Health, OIE), Unia Europejska (UE) oraz wiatowa Organiza-cja Zdrowia (World Health Organisation, WHO) (17, 21) obok innych zwi¹zanych z poszczególnymi konty-nentami wzglêdnie regionami organizacji uczestnicz¹-cych w doskonaleniu tych czynnoci.
Oprócz Kodeksu Zdrowia Zwierz¹t L¹dowych OIE (Terrestrial Animal Health Code) (1), zawieraj¹cego wytyczne postêpowania w zapobieganiu i zwalczaniu chorób, w tym dotycz¹ce zalecanych testów i terminów badañ, opublikowano dzie³o wspomagaj¹ce. Jest nim Manual OIE, czyli Podrêcznik Testów Diagnostycznych i Szczepionek dla Zwierz¹t L¹dowych (Manual of
Dia-gnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals), któ-rego szóste wydanie ukaza³o siê w 2008 r. z uwzglêd-nieniem dokonuj¹cego siê postêpu (5, 18). Celem ko-lejnych wydañ tego podrêcznika, znajduj¹cego siê obec-nie w wiêkszoci krajowych instytutów i centralnych laboratoriów weterynaryjnych na wiecie, jest aktua-lizacja wiedzy przede wszystkim w zakresie technik diagnostyki laboratoryjnej. Równie wa¿nym zadaniem Manualu OIE jest ujednolicenie dla potrzeb pañstwo-wych s³u¿b weterynaryjnych stosowania w mo¿liwie wszystkich laboratoriach w diagnostyce ka¿dej konkret-nej choroby zakakonkret-nej z listy chorób zg³aszanych (listed diseases) (26, 29) rekomendowanych testów diagno-stycznych. Warunkuje to zrozumia³y dialog miêdzy spe-cjalist¹ laboratoryjnym a epizootiologiem w ramach kra-ju i w skali miêdzynarodowej. W tym samym celu opra-cowany zosta³ Standard Jakoci OIE i Wytyczne dla Laboratoriów Weterynaryjnych: Choroby Zakane (19). Nieprzestrzeganie wymienionych w cytowanych publi-kacjach warunków mo¿e prowadziæ, jak wspomniano wy¿ej, do niepokrywaj¹cych siê wyników odnonie do tej samej próbki badanej w ró¿nych laboratoriach, w tym odrêbnych pañstw, co mo¿e komplikowaæ obrót zwie-rzêtami i ich produktami.
Diagnostyka laboratoryjna chorób i zespo³ów chorobowych oraz infekcji o przebiegu podklinicznym
Wobec wywo³anych przez wy³¹cznie jeden czynnik etiologiczny chorób zakanych wiñ charakteryzuj¹cych siê ogólnym zaka¿eniem, czyli posocznic¹ (septicaemia),
Diagnostyka laboratoryjna zakanych chorób wiñ
MARIAN TRUSZCZYÑSKI, ZYGMUNT PEJSAKPañstwowy Instytut Weterynaryjny Pañstwowy Instytut Badawczy, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy Truszczyñski M., Pejsak Z.
Laboratory diagnosis of infectious swine diseases Summary
This paper discusses important issues that have to be taken into account in the laboratory diagnosis of infectious animal diseases, particularly swine diseases. Some of the most fundamental issues are standard-ization and harmonstandard-ization of diagnostic tests in the international scale. Different approaches to test selection are related to the etiology of the infectious disease. The paper mentions diseases caused by one pathogen, diseases of multifactorial etiology and subclinical infections. The importance of a disease-free herd is underlined particularly for eradication and the possibility of exporting animals. The difference between qualitative and quantitative results is defined. The number of samples used and the gold standard, as well as the sensitivity and specificity of diagnostic tests are characterized. The DIVA strategy is mentioned. The value of laboratory diagnosis in dealing with disease syndromes and infections caused by facultativly pathogenic microorganisms is described. Limitations of laboratory tests in the diagnosis of infectious swine diseases are also enumerated.
jak np. pryszczyca, klasyczny pomór wiñ, afrykañski pomór wiñ, przy wystêpowaniu doæ czêsto nietypo-wych objawów klinicznych i zmian sekcyjnych, w pe³-ni trafne ich rozpoznape³-nie wymaga zastosowape³-nia okre-lonych laboratoryjnych testów diagnostycznych (5).
Wa¿n¹ i najczêciej wystêpuj¹c¹ obecnie u wiñ gru-pê chorób, nazywanych zespo³ami lub syndromami chorobowymi, stanowi¹ infekcje o etiologii wieloczyn-nikowej, czyli wywo³ane przy udziale kilku drobno-ustrojów, sporód których z regu³y jeden gatunek ini-cjuje zachorowanie (11, 23-25). W odniesieniu do ich prawid³owego rozpoznania niezbêdne jest wykorzysta-nie wyników badañ laboratoryjnych.
Znane s¹ te¿ infekcje, które obok postaci klinicznej maj¹ przebieg podkliniczny (np. salmonelloza wiñ). Zw³aszcza w tym drugim przypadku diagnostyczne ba-danie laboratoryjne jest wy³¹czn¹ podstaw¹ identyfiko-wania i eliminoidentyfiko-wania tego rodzaju rezerwuarów zaka-¿enia. W efekcie przeciwdzia³a to szerzeniu siê infekcji do stad wiñ od nich wolnych.
Stado zwierz¹t wolne od chorób zakanych
Ujemny wynik diagnostyki laboratoryjnej w odnie-sieniu do grupy wiñ stanowi warunek uznania takiego stada za wolne od okrelonej choroby (disease freedom). Nie wykazanie tym sposobem nosicieli i siewców okre-lonych drobnoustrojów chorobotwórczych umo¿liwia wydanie zgody na transport zwierz¹t z takiej fermy do innego miejsca w kraju lub za granicê. Natomiast wy-nik dodatni wyklucza, wed³ug Kodeksu Zdrowia Zwie-rz¹t L¹dowych OIE (1), b¹d ca³y kraj, b¹d jego czêæ (9) z realizowania eksportu wiñ lub ich produktów do innych krajów.
Dowiadczenia z Danii w ramach realizowanych pro-gramów utrzymywania ferm wiñ wolnych od drobno-ustrojów chorobotwórczych (specific patogen free, SPF) wskazuj¹, ¿e roczna reinfekcja stad wywo³ana przez Mycoplasma hyopneumoniae wynosi 10-15% (14, 15). Prowadzenie tego rodzaju monitoringu mo¿liwe jest wy³¹cznie przy sta³ym korzystaniu z odnonych labora-toryjnych testów diagnostycznych.
W przypadkach spornych miêdzy laboratorium diag-nostycznym kraju, z którego pochodz¹ eksportowane winie i laboratorium odbiorcy, co do wystêpowania in-fekcji u wiñ, rozstrzyganie sporu le¿y w gestii labora-toriów referencyjnych OIE lub innych renomowanych organizacji (20).
Diagnostyczne badania jakociowe i ilociowe
Laboratoryjne metody jakociowe, dotycz¹ce izola-cji i identyfikaizola-cji czynnika etiologicznego daj¹ b¹d wynik dodatni, b¹d ujemny. W grê nie wchodzi ele-ment oceny ilociowej (bardziej lub mniej dodatni albo bardziej lub mniej ujemny), by mo¿na stwierdziæ, czy mamy do czynienia np. z klasycznym pomorem wiñ lub ró¿yc¹ wiñ.
Diagnostyczne badania ilociowe odgrywaj¹ rolê przy wykrywaniu przyczyn zespo³ów chorobowych wywo-³anych przez drobnoustroje wystêpuj¹ce ubikwitarnie
np. PCV2. W tym przypadku o uznaniu PCV2 za przy-czynê zachorowañ wiñ np. na PMWS decyduje nie sam fakt wykrycia PCV2, ale dowiedzenie obecnoci du¿ej iloci tego wirusa w badanych wêz³ach ch³onnych (25). Próby diagnostyczne, w których istotnym czynnikiem s¹ przeciwcia³a swoiste dla czynnika wywo³uj¹cego cho-robê, umo¿liwiaj¹ ilociow¹ ocenê towarzysz¹cej zaka-¿eniu odpowiedzi immunologicznej, dostarczaj¹c infor-macji do wnioskowania o przebiegu infekcji.
Istniej¹ 2 rodzaje wyników ilociowych testów sero-logicznych. Pierwszy, jak seroneutralizacja (SN), wyra-¿a siê koñcowym rozcieñczeniem lub mianem. W dru-gim, jak np. test immunoenzymatyczny ELISA, okre-lenie iloci przeciwcia³ w badanej próbie (odpowiedni-ka miana surowicy przy zastosowaniu innych testów serologicznych, np. odczynu aglutynacji) dokonuje siê przez porównanie gêstoci optycznej, czyli OD surowi-cy badanej z OD surowisurowi-cy standardowej (czyli surowisurowi-cy kontrolnej dodatniej o progowym jednoznacznie dodat-nim stê¿eniu przeciwcia³). W tym celu dzieli siê war-toæ OD surowicy badanej, czyli pobranej do badania próbki (S, sample próbka), przez wartoæ OD surowi-cy kontrolnej dodatniej zestawu (P, positive dodatni). Otrzymana liczba charakteryzuj¹ca stosunek S/P okre-la iloæ przeciwcia³ obecnych w surowicy badanej. War-toci S/P ni¿sze od ustalonej warWar-toci progowej (np. 0,4) uznawane s¹ za wyniki ujemne. Nie oznacza to, ¿e surowica, dla której w tecie ELISA uzyskano wartoæ S/P ni¿sz¹ ni¿ 0,4 nie zawiera przeciwcia³. Mog¹ byæ one obecne, jednak ich poziom znajduje siê poni¿ej za³o¿o-nego progu czu³oci daza³o¿o-nego testu diagnostyczza³o¿o-nego.
Zró¿nicowanie w wynikach ilociowych testów se-rologicznych wiêkszej liczby osobników zaka¿onych tym samym drobnoustrojem pochodzi z dwóch róde³: a) biologicznych ró¿nic indywidualnych w odpowiedzi zwierz¹t (wiñ) zaka¿anych w relacji do niezaka¿anych, b) z ró¿nej czu³oci u¿ytego w kilku miejscach testu.
Wynik badania serologicznego mo¿e te¿ zale¿eæ od: dawki zakanej, trwania infekcji, przebiegu kliniczne-go, ciê¿kiego wzglêdnie ³agodnego lub podkliniczne-go, od tepodkliniczne-go, czy choroba ma charakter systemowy, czy miejscowy, czy stanowi wynik infekcji mieszanej. Pe-wien wp³yw na powy¿sze mo¿e mieæ wiek, wzglêdnie kondycja zwierzêcia. Na poziom odpowiedzi immuno-logicznej wp³yw mo¿e te¿ mieæ inna infekcja oraz szcze-pienie przeciw tej infekcji lub innym infekcjom, co ³¹-czy siê z tzw. negatywn¹ faz¹ odpornoci. Tego rodzaju dodatkowe czynniki mog¹ nawet prowadziæ do fa³szy-wie dodatnich lub fa³szyfa³szy-wie ujemnych wyników sero-logicznych, co jednak nie dewaluuje wartoci badañ serologicznych w diagnostyce chorób zakanych wiñ, zw³aszcza ze wzglêdu na badanie z regu³y du¿ej liczby zwierz¹t kilkakrotnie w cyklu produkcyjnym.
Istniej¹ tkwi¹ce w laboratorium przyczyny ró¿nic w wynikach badañ serologicznych tej samej próbki su-rowicy. Odnosz¹ siê do sprawnoci pracuj¹cych wyko-nawców technicznych, jak równie¿ odczytuj¹cych wy-niki. W grê wchodzi te¿ ró¿na jakoæ zestawów
diagno-stycznych, a nawet poszczególnych odczynników, za-le¿nie od serii produkcji.
Powy¿sze potwierdza koniecznoæ pos³ugiwania siê testami wystandaryzowanymi i przyjêtymi za optymal-ne oraz dysponowanie wykonuj¹cym badania sprawnym i zaanga¿owanym personelem (4, 7).
Liczby pobieranych do badañ próbek
Liczba pobieranych do badañ diagnostycznych pró-bek zale¿y od szeregu czynników. Na przyk³ad, je¿eli na podstawie badañ klinicznych i sekcyjnych istnieje znacz¹ca podstawa do podejrzenia wyst¹pienia choro-by, wtedy liczba próbek do badañ laboratoryjnych mo¿e byæ niewielka. W innych sytuacjach, kiedy zaka¿enie ma przebieg nietypowy czy podkliniczny, konieczne jest pobranie wiêkszej liczby próbek. Trzydzieci próbek na stado wiñ daje prawdopodobieñstwo wykrycia w 95% co najmniej 1 pozytywnego (czyli zaka¿onego) rzêcia, jeli infekcja wystêpuje u co najmniej 10% zwie-rz¹t. Przy mniej czu³ych testach liczba pobieranych do badañ laboratoryjnych próbek musi byæ wiêksza (7).
Z³oty standard
W odniesieniu do ustanawiania testów standardowych istniej¹ 4 wzajemnie wykluczaj¹ce siê kategorie wyni-ków:
rzeczywicie pozytywne wyniki (dodatnie w tecie z próbk¹ od wiñ rzeczywicie zaka¿onych),
fa³szywie negatywne (ujemne w tecie z próbk¹ od wiñ rzeczywicie zaka¿onych),
fa³szywie pozytywne (dodatnie w tecie z próbk¹ od wiñ niezaka¿onych),
rzeczywicie negatywne (ujemne w tecie z próbk¹ od niezaka¿onych wiñ).
Wa¿nym czynnikiem w eliminowaniu lub ogranicza-niu fa³szywie dodatnich lub fa³szywie ujemnych wyni-ków laboratoryjnych badañ diagnostycznych jest pos³u-giwanie siê w poszczególnych laboratoriach Manualem OIE, w tym tzw. z³otym standardem, wobec którego po-równuje siê wyniki badanej próbki, otrzymane metod¹ w tym laboratorium wykonywan¹ i dopiero wtedy, kie-dy s¹ identyczne, j¹ stosuje. Niezbêdnych standardów (zazwyczaj dodatnie, s³abo dodatnie, ujemne surowice) w szeregu przypadków dostarczaj¹ miêdzynarodowe laboratoria referencyjne OIE, UE lub WHO (20, 22). Niestety, nie ma to miejsca w odniesieniu do wszyst-kich chorób zakanych wiñ (7). Pozytywny wp³yw na jakoæ diagnostycznych badañ laboratoryjnych maj¹ wewnêtrzne i zewnêtrzne audyty zapewniania jakoci (quality assurance), przeprowadzane od kilku lat okre-sowo w laboratoriach diagnostycznych.
Na potrzeby obrotu miêdzynarodowego w zwi¹zku z handlem zagranicznym wiñ testy polecane (recom-mended) i alternatywne (alternative), prezentowane przez wiatow¹ Organizacjê Zdrowia Zwierz¹t (OIE) w Pod-rêczniku Standardów Testów Diagnostycznych i Szcze-pionek (5) maj¹ rangê tak zwanych z³otych standardów. Takimi testami w przypadku: choroby Aujeszkyego jest ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay, test
immunoenzymatyczny) i VN (Virus neutralisation, czyli test neutralizacji wirusa); w³onicy identyfikacja mi-kroskopowa czynnika chorobowego i ELISA; afrykañ-skiego pomoru wiñ ELISA i IFA (Indirect fluoresent antibody test, czyli test poredni fluoryzuj¹cych prze-ciwcia³); klasycznego pomoru wiñ ELISA i FAVN (Fluorescent antibody virus neutralisation, neutraliza-cja wirusa immunofluoryzuj¹cymi przeciwcia³ami) oraz NPLA (Neutralizing peroxidase-linked assay, seroneu-tralizacja peroksydazowa); brucelozy wiñ ELISA, BBAT (Buffered Brucella antygen test, test z buforowa-nym antygenem Brucella) i FPA (Fluorescence polari-sation assay, test fluoryzacyjno-polaryzacyjny); zespo-³u rozrodczo-oddechowego wiñ (PRRS) ELISA, IFA i IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay, immu-noperoksydazowy test w komórkowej hodowli jedno-warstwowej); choroby pêcherzykowej wiñ VN i ELI-SA; picornawirusowego zapalenia mózgu i rdzenia wy-wo³anego przez Teschovirus (dawniej choroba cieszyñ-ska) VN; zakanego zapalenia ¿o³¹dka i jelit (TGE) VN i ELISA. Procedury wykonywania wymienionych testów przedstawione s¹ w Manualu OIE (5).
Niekiedy w z³otym standardzie ³¹czonych jest kilka metod. Przyk³adowo, Bager i Petersen (2) porównywali trzy pod³o¿a wybiorcze do izolacji salmonelli z ka³u wiñ. Je¿eli chocia¿ na jednej z tych po¿ywek izolowa-no z tej samej próbki salmonelle, to wynik uznawaizolowa-no za dodatni. Gdyby jednak pos³u¿ono siê tylko jedn¹, ale inn¹ po¿ywk¹, mo¿na by uzyskaæ wynik ujemny przy badaniu tego samego materia³u. Zatem pos³ugiwanie siê kilkoma po¿ywkami do badania wiêkszej liczby próbek ka³u, a nie jedn¹, reprezentuje tu umownie z³oty stan-dard. W cytowanych badaniach okaza³o siê bowiem, ¿e stosuj¹c z osobna jedn¹ po¿ywkê i porównuj¹c w ten sposób otrzymane wyniki z wynikiem pos³ugiwania siê równoczenie trzema po¿ywkami, co uznawano za licz-bê izolatów równ¹ 100%, w przypadku bulionu Rappa-port-Vassiliadisa, sk¹d przesiewano hodowlê bakteryj-n¹ na agar z zieleni¹ brylantow¹, wykryto salmonelle w 88% próbek, w porównaniu z 51% izolatów w przy-padku bulionu z selenitem.
Dla niektórych chorób wirusowych SN lub inne testy serologiczne u¿ywane s¹ jako standard, w stosunku do którego ocenia siê wartoæ nowych testów serologicz-nych. Przyk³adowo, Weigel i wsp. (27) porównywali wartoæ dwóch testów ELISA z SN do wykrywania prze-ciwcia³ dla wirusa choroby Aujeszkyego a zw³aszcza jego glikoproteiny X, a Lanza i wsp. (9) porównywali capture ELISA z SN dla serodiagnozy TGE.
Czu³oæ i swoistoæ
Inna jest definicja czu³oci testu wykonywanego w celu rozpoznania choroby zakanej oraz dla celów epidemiologicznych, a czu³oci testu stosowanego w analityce. W pierwszym przypadku chodzi o wykry-cie mo¿liwie du¿ej liczby zwierz¹t danego stada rze-czywicie pozytywnych (13). W drugim przypadku, czyli badañ analitycznych, okrelenie czu³oæ dotyczy wy-krywania za pomoc¹ testu: wystêpuj¹cej w próbce
naj-mniejszej liczby bakterii lub najnaj-mniejszej iloci DNA, toksyny, wzglêdnie przeciwcia³a. Immunologicznie bar-dziej czu³y test (ELISA w porównaniu z SN) wykrywa zatem przeciwcia³a wczeniej w trakcie procesu in-fekcyjnego u indywidualnej wini. W diagnozie stada, w którym wystêpowanie zwierz¹t zaka¿onych jest red-nie do wysokiego, a wired-nie s¹ w ró¿nych stadiach in-fekcji potrzeba wysokiej czu³oci testu nie musi byæ szczególnie du¿a dla sformu³owania rozpoznania, ¿e w stadzie wystêpuj¹ winie zaka¿one. Taki wynik od-nosi siê do wchodz¹cego w grê stada, a nie wy³¹cznie do jednego lub kilkunastu zbadanych osobników.
PCR zastosowany do identyfikacji Mycoplasma (M.) hyopneumoniae, jak podaje Blanchard i wsp. (3), ma zdolnoæ wykrywania do 400 drobnoustrojów w jednej próbce. Je¿eli badana jest próbka z tchawiczo-oskrze-lowej pop³uczyny, to PCR prawid³owo wykrywa³o 101/ 116 eksperymentalnie zaka¿onych wymienionym drob-noustrojem wiñ.
Pojêcie swoistoci odnosi siê do testu, który popraw-nie identyfikuje popraw-niezaka¿one wipopraw-nie jako rzeczywicie negatywne, a zaka¿one jako rzeczywicie pozytywne. Test z 90% swoistoci¹ prawid³owo klasyfikuje 90% niezaka¿onych wiñ jako negatywne i 10% wiñ jako zaka¿one (fa³szywie pozytywne).
Fa³szywie pozytywny wynik mo¿e byæ zwi¹zany z po-dobieñstwem antygenowym lub innych w³aciwoci (np. DNA) czynnika wywo³uj¹cego chorobê i odrêbnych gatunków drobnoustrojów b¹d wywo³uj¹cych inne cho-roby ni¿ ta, o któr¹ chodzi, b¹d drobnoustrojów nie-chorobotwórczych. Przyk³adowo, Fittipaldi i wsp. (6), badaj¹c próbki z migda³ków wiñ przy u¿yciu PCR w kierunku Actinobacillus pleuropneumoniae, uzyski-wali, obok wyników trafnych, równie¿ fa³szywie dodat-nie, wskazuj¹ce na wystêpowanie: A. suis, A. minor, A. equuli, A. lignieresi, A. porcitonsillarum, Streptococ-cus suis i Haemophilus parasuis.
W wiêkszoci sytuacji terenowych po¿¹dane jest dysponowanie w diagnostyce laboratoryjnej mo¿liwie najwy¿sz¹ swoistoci¹ i czu³oci¹ u¿ywanych testów. Nabywaj¹cy winie i przedstawiciele administracji we-terynaryjnej zazwyczaj domagaj¹ siê testów o czu³oci i swoistoci bliskiej 100%, by minimalizowaæ ryzyko wprowadzenia na swój teren patogenów i chorób. Po-dobny kierunek argumentacji reprezentuj¹ hodowcy stad wiñ, którzy domagaj¹ siê tego rodzaju testów w celu maksymalizowania bezpieczeñstwa dla nabywaj¹cych oferowanych knurów i pierwiastek do remontu stada w innych fermach. To samo dotyczy akcji zwi¹zanych z eradykacj¹ choroby zakanej oraz utrzymaniem statu-su stada wolnego np. od M. hyopneumoniae.
Strategia DIVA
Kolejnym problemem jest ró¿nicowanie serologicz-ne w przypadku wyniku pozytywserologicz-nego, czy winie by³y szczepione przeciw chorobie Aujeszkyego lub klasycz-nemu pomorowi wiñ lub czy s¹ bezobjawowymi nosi-cielami chorobotwórczego wirusa. W tym celu
opraco-wane zosta³y specjalne testy, które umo¿liwiaj¹ odró¿-nienie przeciwcia³ wywo³anych przez wirus szczepion-kowy specjalnie w tym celu genetycznie modyfikowa-ny od przeciwcia³ wytworzomodyfikowa-nych pod wp³ywem wirusa zjadliwego. Powy¿sze okrelane jest jako strategia DIVA (Differentiation of Infected from Vaccinated Animals) (16, 27).
Diagnostyka laboratoryjna zespo³ów chorobowych
Poodsadzeniowy wielonarz¹dowy zespó³ wyniszcza-j¹cy (post-weaning multisystemic wasting syndrom, PMWS) jest przyk³adem wp³ywu wiêkszej liczby czyn-ników na pojawienie siê klinicznego przebiegu choro-by (12). W takim przypadku, mimo ¿e laboratorium mo¿e wesprzeæ identyfikacjê drobnoustrojów potencjal-nie mog¹cych braæ udzia³ w wywo³ywaniu schorzenia lub obni¿ce wyników produkcyjnych, udzia³ czynników zakanych w porównaniu do rodowiskowych przyczyn niezakanych jest w stanie oceniæ wy³¹cznie terenowy lekarz weterynarii.
W chorobach o z³o¿onej etiologii trudne jest okrele-nie roli poszczególnych gatunków drobnoustrojów ze wzglêdu na ich warunkow¹ chorobotwórczoæ. Jednak-¿e wykazano, Jednak-¿e w PMWS g³ównym czynnikiem ini-cjuj¹cym jest PCV2, a w enzootycznej pneumonii wiñ M. hyopneumoniae (11, 23). Stwierdzenia te, uzyskane dziêki mikrobiologicznej diagnostyce, w tym ilocio-wej ocenie wystêpowania patogenu, s¹ pomocne w wy-borze odpowiedniej profilaktyki swoistej i ewentualnej antybiotykoterapii przy równoczesnym wprowadzeniu niezale¿nie od tego korekt zapewniaj¹cych dobrostan.
Drobnoustroje warunkowo chorobotwórcze
Choroby wiñ wywo³ane przez warunkowo chorobo-twórcze drobnoustroje, np. kolibakterioza, stanowi¹ pewien problem w diagnostyce laboratoryjnej w tym sensie, ¿e 100% zwierz¹t w stadzie mo¿e byæ ich nosi-cielami np. szczepu Escherichia coli serogrupy 0138 lub 0139, a mimo to ¿adne zwierzê nie zachorowuje w jednym przypadku, a w drugim, identycznym w sen-sie nosicielstwa takich drobnoustrojów, zachorowuje na kolibakteriozê wiñ znaczny ich odsetek. Trudno wtedy mówiæ o czu³oci i swoistoci testu, który wykrywaæ mo¿e wszystkie zwierzêta zaka¿one, a mimo to nie ma to znaczenia w aspekcie wyst¹pienia choroby.
Inne potrzeby
W pewnych sytuacjach zmierzaj¹cych do okrelenia roli etiologicznej izolatu konieczna jest bli¿sza charak-terystyka szczepu wyosobnionego od pad³ego zwierzê-cia. Znaczenie maj¹ wtedy molekularne metody diag-nostyki laboratoryjnej, umo¿liwiaj¹ce wykazanie, czy choroba zwi¹zana jest z wyst¹pieniem nowego, bardziej zjadliwego w obrêbie gatunku, szczepu bakterii lub wirusów. Niekiedy istnieje potrzeba ró¿nicowania pato-gennego wirusa terenowego od blisko spokrewnione-go, krzy¿owo reaguj¹cego wirusa, np. p³ucnego koro-nawirusa wiñskiego od jelitowego korokoro-nawirusa (TGE)
lub szczepów szczepionkowych PRRS od szczepów te-renowych (10), co, jak wynika z cytowanych prac, jest mo¿liwe.
Ograniczenia diagnostyki laboratoryjnej
Negatywny wynik zbadanych próbek laboratoryjnych niekoniecznie wyklucza obecnoæ patogenu jako przy-czyny choroby, zw³aszcza wtedy, kiedy zastosowany test cechuje siê ni¿szego stopnia czu³oci¹ i swoistoci¹. Fa³szywie ujemne wyniki, jak nie wykazanie czynnika wirusowego lub bakteryjnego, mimo ¿e wystêpuje w organizmie wini, mo¿na uzyskaæ z ró¿nych powo-dów. S¹ nimi nierównomierna koncentracja, a nawet brak we wchodz¹cych w grê próbkach czynnika choro-bowego. D³u¿szy okres choroby mo¿e prowadziæ do zmniejszenia iloci czynnika chorobowego poni¿ej gra-nicy wykrywalnoci u¿ytego testu. To samo mo¿e doty-czyæ wykrywania przeciwcia³ swoistych. Test mo¿e uwzglêdniaæ identyfikacjê wy³¹cznie okrelonej grupy szczepów danego gatunku drobnoustroju. Warunki, w których przetrzymywano próbki do badañ, te¿ mog¹ odegraæ istotn¹ rolê w formu³owaniu b³êdnych wyni-ków, np. wysoka temperatura, czas zbyt d³ugi od pobra-nia do wykonapobra-nia próby. Identyfikacja wa¿nych diagno-stycznie odcinków DNA mo¿liwa jest nawet po bardzo d³ugim czasie. Jednak¿e fa³szywie negatywne wyniki w przypadku próbek z ka³u, przy zastosowaniu PCR, w kierunku ró¿nych jelitowych patogenów, mog¹ byæ uzyskane bezporednio po pobraniu materia³u do ba-dañ. Przyczyn¹ fa³szywie ujemnych wyników PCR mog¹ byæ hamuj¹ce substancje wystêpuj¹ce w kale. Opraco-wano metody wykrywania tych inhibitorów (8). Fa³szy-wie ujemne wyniki infekcji bakteryjnych mog¹ wystê-powaæ, jeli winie by³y traktowane przed badaniem antybiotykami.
Wydaje siê, ¿e najczêstsz¹ przyczyn¹ wyników fa³-szywie ujemnych s¹ b³êdy pope³niane w trakcie pobie-rania próbek (le pobrane wymazy z nosa, zbyt póno pobrane próbki od pad³ych zwierz¹t, wybór niew³aci-wych osobników do próbkobrania, etc.).
Podsumowanie
W odnosz¹cej siê do przedstawionego tekstu konklu-zji wolno stwierdziæ, ¿e w³aciwie wykonywana diagno-styka laboratoryjna stanowi niezbêdny i bardzo wa¿ny dzia³ w kompleksowym zwalczaniu chorób zakanych zwierz¹t, w tym wiñ. Dostarcza te¿ najwa¿niejszych dowodów ich eradykacji, czyli niewystêpowania na geo-graficznie okrelonym obszarze. Warunkiem jest jednak wysoka kompetencja wykonuj¹cych badania specja-listów, nowoczesne wyposa¿enie laboratoriów oraz wspó³praca z renomowanymi laboratoriami referencyj-nymi na wiecie. Równoczenie konieczne jest wspó³-dzia³anie diagnostów z administracj¹ weterynaryjn¹ danego pañstwa i terenow¹ s³u¿b¹ weterynaryjn¹. Ich przedstawiciele powinni reprezentowaæ wysoki poziom zawodowy i wiadomoæ, co do mo¿liwoci wykorzy-stywania wyników laboratoryjnych w praktyce.
Pimiennictwo
1.Anon.: OIE Terrestrial Animal Health Code. Paris 2010.
2.Bager F., Petersen J.: Sensitivity and specificity of different methods for the isolation of Salmonella from pigs. Acta Vet. Scand. 1991, 32, 473-481. 3.Blanchard B., Kobisch M., Bové J. M., Saillard C.: Polymerase chain reaction
for Mycoplasma hyopneumoniae detection in tracheobronchiolar washings from pigs. Molec. Cell Probes 1996, 10, 15-22.
4.Drew T. W.: Comparative serology of porcine reproductive and respiratory syndrome in eight European laboratories, using immonoperoxidase monolayer assay and enzyme-linked immunosorbent assay. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1995, 14, 761-775.
5.Edwards S. (ed.): OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (mammals, birds and bees). Paris 2008.
6.Fittipaldi N., Broes A., Harel J., Kobisch M., Gottschalk M.: Evaluation and field validation of PCR tests for detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in subclinically infected pigs. J. Clin. Microbiol. 2003, 41, 5085-5093. 7.Gardner I. A., Blanchard P. C.: Interpretation of laboratory results. [w:]
Straw B. E., Zimmerman J. J., DAllaire S., Taylor D. J.: Diseases of Swine. Iowa State University Press, Ames 2006, 219-239.
8.Jacobson M., Englund S., Ballagi-Pordany A.: The use of a mimic to detect polymerase chain reaction-inhibitory substances in feces examined for the presence of Lawsonia intracelluaris. J. Vet. Diagn. Invest. 2003, 15, 268-273. 9.Lanza I., Rubio P., Mufioz M., Ckmenes P.: Comparison of a monoclonal
anti-body capture ELISA (MACELISA) to indirect ELISA and virus neutralization test for the serodiagnosis of transmissible gastroenteritis virus. J. Vet. Diagn. Incest. 1993, 5, 21-25.
10.Mengeling W. L., Vorwald A. C., Lager K. M., Brockmeier S. L.: Comparison among strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus for their ability to cause reproductive failure. Am. J. Vet. Res. 1996, 57, 834-839. 11.Pejsak Z., Truszczyñski M.: Tematyka 21 Kongresu IPVS w Vancouver. Czêæ
II. Zaka¿enia wiñ wywo³ane przez Mycoplasma hyopneumoniae. ¯ycie Wet. 2010 (w druku).
12.Pogranichniy R. M., Yoon K. J., Harms P. A., Sorden S. D., Daniels M.: Case-control study on the association of porcine circovirus type 2 and other swine viral pathogens with postweaning multisystemic wasting syndrome. J. Vet. Diagn. Invest. 2002, 14, 449-456.
13.Saah A. J., Hoover D. R.: Sensitivity and specificity reconsidered: The meaning of these terms in analytical and diagnostic settings. Ann. Intern. Med. 1997, 126, 91-94.
14.Sørensen V., Barfod K., Feld N. C.: Evaluation of a monoclonal blocking ELISA and IHA for antibodies to Mycoplasma hyopneumoniae in SPF-pig herds. Vet. Rec. 1992, 130, 488-490.
15.Sørensen V., Barfod K., Feld N. C., Vraa-Andersen L.: Application of enzyme-linked immunosorbent assay for the surveillance of Mycoplasma hyopneumo-niae in pigs. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epizoot. 1993, 12, 593-604.
16.Straw B. E., Zimmerman J. J., DAllaire S., Taylor D. J.: Diseases of Swine. Blackwell Publishing, Iowa State University Press, Ames 2006.
17.Truszczyñski M.: Miêdzynarodowy Urz¹d Epizootii powstanie i dzia³alnoæ. Medycyna Wet. 2004, 60, 215-219.
18.Truszczyñski M. (ed.): OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. Office International des Epizooties (OIE). Paris 2000.
19.Truszczyñski M. (ed.): OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. Paris 2003.
20.Truszczyñski M.: The role and importance of veterinary laboratories in the prevention and control of infectious diseases of animals. Rev. Sci. Tech. Off. int. Epiz. 1998, 17, 405-410.
21.Truszczyñski M.: Weterynaryjna profilaktyka zoonoz. Medycyna Wet. 2008, 64, 1363-1367.
22.Truszczyñski M., Blancou J.: The role of the Office International des Epizootie in the standardisation of biologicals. Develop. Biol. Standard. 1992, 72, 95-98. 23.Truszczyñski M., Pejsak Z.: Chorobotwórczoæ cirkowirusów ze szczególnym uwzglêdnieniem poodsadzeniowego, wielonarz¹dowego zespo³u wyniszczaj¹-cego wiñ. Medycyna Wet. 2008, 64, 379-382.
24.Truszczyñski M., Pejsak Z.: Immunosupresja jako przyczyna chorób wiñ o etio-logii wieloczynnikowej. Medycyna Wet. 2010, 66, 370-373.
25.Truszczyñski M., Pejsak Z.: Rola cirkowirusa PCV2 w wywo³ywaniu zaburzeñ w rozrodzie wiñ. Medycyna Wet. 2009, 65, 6-8.
26.Truszczyñski M., Wijaszka T.: Zast¹pienie listy A i B jedn¹ list¹ chorób zg³asza-nych do OIE. Medycyna Wet. 2005, 61, 234-235.
27.Weigel E. M., Hall W. F., Scherba G., Siegel A. M., Hahn E. C., Lehman J. R.: Evaluation of the sensitivity and specificity of two diagnostic tests for anti-bodies to pseudorabies virus glycoprotein X. J. Vet. Diagn. Invest. 1992, 4, 238-244.
28.Wijaszka T., Truszczyñski M.: Kompartmentalizacja pozytywne rozwi¹zanie dla handlu miêdzynarodowego zwierzêtami i ich produktami. Medycyna Wet. 2007, 63, 259-260.
29.Wijaszka T., Truszczyñski M.: Nowa lista chorób zg³aszanych do OIE. Medy-cyna Wet. 2006, 62, 1455.
Adres autora: prof. dr hab. Marian Truszczyñski, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: mtruszcz@piwet.pulawy.pl
