Acta Scientiarum Polonorum. Biotechnologia 4, 2008

Pełen tekst

(1)ACTA SCIENTIARUM POLONORUM Czasopismo naukowe zaoone w 2001 roku przez polskie uczelnie rolnicze. Biotechnologia Biotechnologia 7(4) 2008. Bydgoszcz Kraków Lublin Olsztyn Pozna Siedlce Szczecin Warszawa Wrocaw.

(2) Rada Programowa Acta Scientiarum Polonorum Kazimierz Banasik (Warszawa), Janusz Falkowski (Olsztyn), Florian Gambu (Kraków), Franciszek Kluza (Lublin), Edward Niedwiecki (Szczecin), Janusz Prusiski (Bydgoszcz), Jerzy Sobota (Wrocaw) – przewodniczcy, Stanisaw Socha (Siedlce), Waldemar Uchman (Pozna) Rada Naukowa serii Biotechnologia Danuta Witkowska (Wrocaw) – przewodniczca, Wodzimierz Bednarski (Olsztyn), Wodzimierz Grajek (Pozna), Anna Maraz (Budapeszt, Wgry), Zdzisaw Targoski (Lublin), Vesna Zechner-Krpan (Zagrzeb, Chorwacja). Korekta: Janina Szydowska mgr Elbieta Winiarska-Grabosz amanie Halina Sebzda Projekt okadki Daniel Morzyski. ISSN 1644–065X Wydanie publikacji dofinansowane ze rodków Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocawiu. © Copyright by Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocawiu, Wrocaw 2008. Redaktor Naczelny – prof. dr hab. Andrzej Kotecki ul. Sopocka 23, 50–344 Wrocaw, tel./fax 71 328–12–77 e-mail: wyd@up.wroc.pl http://www.up.wroc.pl Nakad 200 + 16 egz. Ark. wyd. 2,8. Ark. druk. 2,25 Druk i oprawa: Wydawnictwo Tekst Sp. z o.o. ul. Kossaka 72, 85–307 Bydgoszcz.

(3) Acctaa Scci. Pool., Biioteech hnooloogiia 7(44) 200 2 08,, 3--122. TR RA AN NSF FO OR RM MAC CJJE MIK M KR RO OBIIO OLO OG GIC CZ ZN NE W BR WYB RA ANY YC CH H SU SUBS ST TRA AT TÓ ÓW W STE S ER RO OID DO OW WY YCH H SZ ZE ERE EG GU U C18: 191 -NO OR RT TES ST TO OST TE ERO ON NU U I JE J GO O 177D--AL LK KIL LO O- I ET ETIN NY YLO OP PO OCHO OD DN NY YCH H W KU K LT TU URZ ZE E AB ABSIIDIIA COE C ER RUL ULE EA A Ew wa Brrzeezoow wskka, Jadw wigga Dm Dmoochhow wskka--G Gaddyssz Unniw werssyteet Przy P yroodnniczzy we w Wroc W caw wiuu1 Strreszzczeeniee. Bada B any by prrzebbiegg traansfform macjji suubsstrattów steeroiddow wychh szzereegu C188: 19-norrtesstostteroonu i jeego 17D-aalkillo- i ettinyylopochhodnnychh w kuulturrze Abbsidiia coer c ruleea 93. Gów wn obsserw wow wan reakcjj bya b a hyydrooksyylacjja. Stw wierddzono, e kierunnek prze p ebieegu reaakcji uzzaleenioonyy jesst odd sttrukkturyy suubsttratuu. Nie N pod p dstaw wionny na n atom a mie wgla C17 gruup alkkilow w lubb etinyllow w 19-n 1 norteestoosterron traansfform mow wanyy byy do d 15D 1 D-hyydrooksyypochoodneej. Z kooleii w obeecnoocii gruupyy 177D-aalkilow wej: meetylooweej luub etylo e oweej obbserrwoowaano góównnie twoorzeenie 7D D-hyydrooksyypochoodnyych.. W prrzyppadku subbstraatów w stero s oidoowyych zaw wieerajcycch na n atomiee wgl w la C17 C grrup 177D--etinnyloow reakcj cja w kult k turzze Abbsidiia coer c ruleaa prrzebbiegga w znnaczzniee mnniejsszym m stop s niu lubb niee zaachoodzii. Obok O k reaakcjji hydrokksyylacjji obbserrwoowanno reak r kcj wpprow waddzennia wiz w zaniia podw wójnnegoo C6-C C C7. Soowaa klu uczzowee: Absi A idia coeerullea, hyddrokksyllacja, stero s oidyy, mikr m oorgannizm my. WS ST P Mikrooorrgannizm my ze wzgl w lduu na n atw wo prow p waddzenniaa ich hod h dow wli w war w runnkacch labboraatorryjnnychh orazz zddolnno. doo kata k alizoowaaniaa okkreelonycch reak r kcjii stanoowii dogo d odnny maateriia do proowaadzenia biotr b ransformaacjii. Grzy G ybyy z rod r dzaju Absi A idiaa znnanne s z proowaadzeeniaa róónnegoo tyypuu prrzekkszttacce suubsttratóów steeroiidow wycch [Zhhanng i inn. 2004 2 4, Che C en i inn. 20077]. W ód biot Wró b trannsfoorm macji zw wizkóów orgganniczznycch proowaadzoonyych za poomooc orggannizm mów w yywyych znaaczzn gruup staanow wi traansform maccje steeroidów w, gów g wniie ze z wzg w glddu na n ichh akktyw wnoo bioologgiczzn i zwi z zaane z tym t m prrakttyczzne znnaczzeniie w prze p emyylee faarmaaceuutyccznnym m [F Fernnanndess i in.. 200033]. S onne rów r wniee dobbrymi moodeelam mi czsteeczeek z wiel w lom ma reak r ktyw wnyym mi grruppam mi fuunkkcyjjnym mi [Sm mithh 1980 1 0]. Traansform maacje miikroobiooAdrres doo kore k espoondeencjji – Corrrespponndinng authhor: Ewa E a Brze B ezow wskka, Kaateddra Chhemii, Uniiweersyttet Przzyroodniiczyy we w Wro W ocaawiuu, ul. u C.K K. N Norrwidda 25, 500–3775 Wrrocaaw, e--maiil: ewaa.brrzezzowska@uup.w wrocc.pl.

(4) 4. E. Brzezowska, J. Dmochowska-Gadysz. logiczne steroidów mog zachodzi zarówno w obrbie ukadu piercieniowego, jak i w acuchu bocznym. Czsto wykorzystywan praktycznie reakcj jest hydroksylacja, pozwalajca na funkcjonalizacj nieaktywowanych atomów wgla o hybrydyzacji sp3. Polega na wprowadzeniu do czsteczki funkcji tlenowej. Wyniki prac Sir Jonesa [Bell i in. 1972] przeprowadzonych na zwizkach steroidowych pokazuj, e pozycja wprowadzanej grupy hydroksylowej do piercienia steroidowego czsto zaley od oddziaywa przestrzennych, majcych zwizek z miejscem pooenia podstawnika. W naszych wczeniejszych badaniach przeprowadzilimy transformacje zwizków steroidowych: testosteronu i jego pochodnych w kulturze Absidia coerulea [Brzezowska i in. 1996]. Stwierdzilimy, e kierunek przebiegu reakcji uzaleniony by od struktury substratu. W celu zbadania wpywu podstawnika na atomie wgla C17, na przebieg transformacji substratów steroidowych, poddano dziaaniu kultury A. coerulea 19-nortestosteron oraz jego pochodne alkilowe i etinylowe: 17D-metylo-19-nortestosteron, 17D-etylo-19-nortestosteron, 17D-etinylo-19-nortestosteron oraz 17D-etinylo-18-etylo19-nortestosteron. MATERIAY I METODY Uyte do bada substraty: 19-nortestosteron, 17D-metylo-19-nortestosteron, 17D-etylo-19-nortestosteron, 17D-etinylo-19-nortestosteron oraz 17D-etinylo-18-etylo-19-nortestosteron pochodziy z firmy Steraloids INC. Szczep Absidia coerulea 93 otrzymano z kolekcji Instytutu Biologii i Botaniki Akademii Medycznej we Wrocawiu. Mikroorganizm narasta w hodowli wstrzsanej przez okres okoo 4 dni w temperaturze 27RC. Nastpnie do naronitej kultury dodawano substrat. Substraty rozpuszczano w acetonie (ok. 1 cm3) i dodawano w iloci 200 mg do 1 dm3 kultury. Transformacje prowadzono 14 dni w kolbach stokowych o pojemnoci 250 cm3, zawierajcych 50 cm3 poywki o skadzie 3% glukozy i 1% peptonu. Do transformacji preparatywnych uywano kolb o pojemnoci 2 dm3, zawierajcych 500 cm3 poywki. Produkty transformacji ekstrahowano chlorkiem metylenu, a ekstrakty suszono bezwodnym siarczanem magnezu. Surow mieszanin potransformacyjn badano przy uyciu chromatografii cienkowarstwowej (TLC) oraz chromatografii gazowej (GC). Rozdzia produktów prowadzono za pomoc chromatografii kolumnowej pod cinieniem atmosferycznym oraz pod zwikszonym cinieniem (Flash Chromatography). Do chromatografii pod cinieniem atmosferycznym uywano elu krzemionkowego (firmy Merck) o granulacji 70–230 mesh, a do chromatografii pod zwikszonym cinieniem – elu krzemionkowego (Merck) o granulacji 230-400 mesh. TLC wykonywano na pytkach z elem krzemionkowym na podoach: aluminiowym, plastikowym lub szklanym (firmy Merck). Chromatogramy rozwijano w rónych ukadach rozpuszczalników, najczciej w: heksan-aceton 2:1, benzen-eter etylowy-metanol 30:10:0.8, cykloheksan-octan etylu-izporopanol 45:45:10, cykloheksan-octan etylu-aceton 45:45:10, benzen-metanol-octan etylu 7:1:0.8, chloroform-aceton 6:1. Chromatogramy wywoywano przez spryskanie pytki roztworem stonego kwasu siarkowego i etanolu w stosunku objtociowym 1:1.. Acta Sci. Pol..

(5) Transformacje mikrobiologiczne .... 5. Analizy GC wykonywano przy uyciu kapilarnego chromatografu gazowego firmy Hewlett Packard 5890 (FID, gaz nony azot lub wodór) z nastpujcymi wypenieniami: Kolumna Chrompack WCOT Fused Silica, HP-5 (Crosslinked Ph Me Silicone); 30 m, rednica wewntrzna 0.53 mm, grubo wypenienia 0.88 Pm. Program: 200o/1min, narost 8o/1min do 300o/3 min; temp. dozownika 250oC, temp. detektora 300ºC. Kolumna Chrompack WCOT Fused Silica Ultra 1 (Crosslinked Methyl Silicone Gum); 25 m, rednica wewntrzna 0.32 mm, grubo wypenienia 0.17 Pm. Program: 220o/2 min, narost 5o/min do 300o/3 min; temp. dozownika 250oC, temp. detektora 300oC. Pomiary spektralne wykonano nastpujco: widma w podczerwieni na aparacie Specord M-80 firmy Carl-Zeiss-Jena, widma 1H-NMR na aparacie Bruker Avance DRX 300 MHz. WYNIKI W efekcie transformacji 19-nortestosteronu otrzymano skomplikowan mieszanin zwizków, z których wyizolowano wycznie produkt gówny: x 15D-hydroksy-19-nortestosteron 21% izolowanej wydajnoci IR (chloroform) [cm-1]: 3450(OH), 2970(CH), 1690 i 1640(C=O) 1H-NMR G(ppm): 5.8(4-H), 4.1(15E-H), 3.89(17D-H), 0.8(18-H). Transformacja 17D-metylo-19-nortestosteronu daa mieszanin produktów, które rozdzielono metod chromatografii kolumnowej, izolujc trzy gówne produkty: x 7D-hydroksy-17D-metylo-19-nortestosteron 30% izolowanej wydajnoci IR (chloroform) [cm-1]: 3430(OH), 2970(CH), 1680 i 1630(C=O) 1H-NMR G (ppm): 5.92(4-H), 4.03(7E-H), 1.26(17D-CH3), 0.94(18-H). x 15D-hydroksy-17D-metylo-19-nortestosteron 15% izolowanej wydajnoci IR (chloroform) [cm-1]: 3420(OH), 2950(CH), 1670 i 1620(C=O) 1H-NMR G (ppm): 5.83(4-H), 4.1(15E-H), 1.36(17D-CH3), 0.93(18-H). x 17D-metylo-6-dehydro-19-nortestosteron 11% izolowanej wydajnoci IR (chloroform) [cm-1]: 3490(OH), 2970(CH), 1680 i 1630 (C=O, ukad D,E nienasyconego ketonu) 1H-NMR G (ppm): 6.1(6-H), 5.67(4-H), 1.22(17D-CH3), 0.95(18-H). Kolejn transformacj bya transformacja 17D-etylo-19-nortestosteronu, w wyniku której otrzymano równie mieszanin produktów, z której wyizolowano dwa gówne produkty: x 7D-hydroksy-17D-etylo-19-nortestosteron 52% izolowanej wydajnoci IR (chloroform) [cm-1]: 3460(OH), 2960(CH), 1680 i 1630(C=O) 1H-NMR: 5.92(4-H), 4.05(7E-H), 1.4(17D-CH2CH3), 0.92(18-H). x 6-dehydro-17D-etylo-19-nortestosteron 18% izolowanej wydajnoci IR (chloroform) [cm-1]:3460(OH), 2960(CH), 1680 i 1630(C=O) 1H-NMR G (ppm): 6.1(6-H), 5.79(4-H), 1.27(17DCH2CH3),0.98(18-H). Kolejnej transformacji poddano kolejno 17D-etinylo-19-nortestosteron oraz 17D-etinylo-18-etylo-19-nortestosteron. W obu przypadkach stwierdzono brak reakcji.. Biotechnologia 7(4) 2008.

(6) E. Brzezowska, J. Dmochowska-Gadysz. 6 OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW. Przeprowadzone wczeniej badania szeregu C19 – steroidów – testosteronu i jego pochodnych oraz progesteronu wykazay, e miejsce hydroksylacji w kulturze szczepu A. coerulea zaley midzy innymi od obecnoci podstawnika na atomie wgla C17 [Brzezowska i in. 1996]. Stwierdzono, e kierunek przebiegu reakcji uzaleniony jest od struktury substratu. Nie podstawione na atomie wgla C17 grup alkilow substraty steroidowe serii androstanu: testosteron i androstendion transformowane byy gównie do 14D-hydroksypochodnych. Obecno grupy 17D-metylowej zmieniaa miejsce hydroksylacji. Obserwowano regioselektywn hydroksylacj 7D dla 17D-metylotestosteronu, a z substratu z dodatkowym wizaniem podwójnym 17D-metylo-1-dehydrotestosteronu powstawaa mieszanina 7D i 11E alkoholi. Obecnie dziaaniu kultury A. coerulea poddane zostay nastpujce substraty steroidowe: 19-nortestosteron, 17D-metylo-19-nortestosteron, 17D-etylo-19-nortestosteron, 17D-etinylo-19-nortestosteron, 17D-etinylo-18-etylo-19-nortestosteron. Zwizki te wykazuj dziaanie anaboliczne lub gestagenne. W wyniku transformacji 19-nortestosteronu (rys. 1) otrzymano 15D-hydroksy-19-nortestosteron.. OH. OH Absidia Absidia coerulea coerulea. O. OH O. Rys. 1. Transformacja 19-nortestosteronu w kulturze A. coerulea Fig. 1. Transformation of 19-nortestosterone in A. coerulea culture. Struktur otrzymanego zwizku zaproponowano na podstawie analizy widma H-NMR. Zawiera ono charakterystyczny multiplet CHOH w obszarze G=4.1 ppm, który moe zosta przypisany protonowi 15E, co potwierdzaj dane literaturowe dla quasi-aksjalnego protonu 15E [Kirk i in. 1990]. Z kolei triplet odpowiadajcy protonowi 17D jest przesunity w kierunku sabszego pola o ok. 0.023 ppm (G=3.89 ppm) w porównaniu z substratem (G=3.66 ppm). Niewielkie przesunicie angularnej grupy metylowej C-18 o ok. 0.001 ppm (w porównaniu z substratem) jest zgodne z danymi literaturowymi [Zürcher 1963]. Wprowadzenie grupy hydroksylowej w pozycj 15D po raz pierwszy zaobserwowano w wyniku transformacji progesteronu (rys. 2) w kulturze Colletotrichum antirrhini oraz korteksonu (rys. 3) przez szczep Giberella baccata [Charney i Herzog 1967]. 1. Acta Sci. Pol..

(7) Transformacje mikrobiologiczne .... 7. CH3. CH3. C=O. C=O. Colletotrichum Colletotrichum antirrhini antirrhini. OH O. O. Rys. 2. Transformacja progesteronu w kulturze Colletotrichum antirrhini Fig. 2. Transformation of progesterone in a Colletotrichum antirrhini culture CH2OH. CH2OH. C=O. C=O. Giberella Giberella baccata baccata O. OH O. Rys. 3. Transformacja korteksonu w kulturze Gibberella baccata Fig. 3. Transformation of cortexolone in a Gibberella baccata culture. Znane s równie mikrobiologiczne 15D hydroksylacje C18 oraz C19 pochodnych steroidowych w kulturach szczepów z rodzaju Fusarium [Tamm i in. 1963, Koek i wizdor 1998, Wilson i in. 1999]. Hydroksylacj pozycji 15D zaobserwowano równie w wyniku transformacji progesteronu w kulturze Acremonium strictum [Faramarzi i in. 2003]. Hydroksylacja pozycji 15D posiada znaczenie praktyczne w syntezie zwizków wykazujcych dziaanie gestagenne: np. z 18-etylo-19-norandrostendionu w kulturze Penicillium raistickii [Kieslich 1991] mona otrzyma 15D-hydroksypochodne. Reakcja ta stanowi etap poredni dla wprowadzenia wizania podwójnego 15,16-dienowego (rys. 4), które zwiksza aktywno gestagenn D-norgestrelu. O. OH. O. C _=CH Penicillium Penicillium. OH. raistickii raisticki. O. O. O. Rys. 4. Reakcja wprowadzenia grupy hydroksylowej w pozycj 15D dla 18-etylo-19-norandrostendionu w kulturze Penicillium raistickii Fig. 4. Introduction of hydroxy group in 15D position to 18-ethyl-19-norandrostenedione in a Penicillium raistickii culture. Biotechnologia 7(4) 2008.

(8) E. Brzezowska, J. Dmochowska-Gadysz. 8. Z kolei, w wyniku transformacji 17D-metylo-19-nortestosteronu, pochodnej alkilowej 19-nortestosteronu, wyizolowano trzy gówne produkty: 7D-hydroksy-17D-metylo-19-nortestosteron, 15D-hydroksy-17D-metylo-19-nortestosteron oraz 17D-metylo-6-dehydro-19-nortestosteron. Schemat zachodzcych reakcji przedstawiono na rysunku 5. OH CH3. O. coerulea Absidia coerulea Absidia. +. + O. OH. OH CH3. OH CH3. OH CH3. OH O. O. Rys. 5. Transformacja 17D-metylo-19-nortestosteronu w kulturze A. coerulea Fig. 5. Transformation of 17D-methyl-19-nortestosterone in A. coerulea culture. W widmie 1H-NMR 7D-hydroksy-17D-metylo-19-nortestosteronu obecny jest wski sygna przy G=4.04 ppm, charakterystyczny dla ekwatorialnego protonu, co wskazuje na obecno protonu 7E [Smith i in. 1989]. Reakcjami majcymi znaczenie biotechnologiczne s transformacje w pozycji C-7 zwizków steroidowych. Uwaa si j za jeden z pierwszych etapów trawienia przez ywy organizm [Clark i Hufford 1991]. Mikrobiologiczna hydroksylacja pozycji C7 steroidów o ukadzie 4-en-3-onu ma znaczenie przy produkcji aktywnych farmakologicznie zwizków. Przykadowo, 7D-hydroksyandrost-4en-3,17-dion jest wanym metabolitem stosowanym do wytwarzania diuretyków [Mahato i Majumdar 1993, Mahato i Garai 1997]. Niezalenie od syntezy chemicznej pochodnych steroidowych 7D i 7E, które mona otrzyma w wieloetapowej syntezie i z maymi wydajnociami, bardziej korzystn wydaje si moliwo ich uzyskania w wyniku transformacji mikrobiologicznej. Znalazo to wyraz w pracach opublikowanych w cigu ostatnich kilkunastu lat [Templeton i Kumar 1987, Smith i in. 1989, Cotillon i Morfin 1999, Huszcza i Dmochowska-Gadysz 2003]. Struktur drugiego produktu transformacji 17D-metylo-19-nortestosteronu – 15D-hydroksy-17D-metylo-19-nortestosteronu zaproponowano równie na podstawie danych spektralnych. W widmie 1H-NMR powyszego zwizku obecny jest charakterystyczny multiplet CHOH w obszarze G=4.1 ppm, odpowiadajcy protonowi 15E. Acta Sci. Pol..

(9) Transformacje mikrobiologiczne .... 9. [Kirk i in. 1990]. Przesunicie chemiczne angularnej grupy metylowej C-18 (w stosunku do substratu) o ok. 0.05 ppm w kierunku sabszego pola jest zgodne z danymi literaturowymi [Zürcher 1963]. W widmie 1H-NMR trzeciego produktu transformacji 17D-metylo-19-nortestosteronu – 17D-metylo-6-dehydro-19-nortestosteronu o obecnoci dodatkowego wizania podwójnego wnioskuje si na podstawie obecnoci sygnau G=6.2 ppm. Przesunicie chemiczne sygnau protonu winylowego przy atomie wgla C4 o ok. 0.05 ppm, w odniesieniu do substratu, potwierdzaj dane literaturowe [Smith i in. 1989]. Podobne wprowadzenie wizania podwójnego do piercienia B z utworzeniem 6-dehydroproduktu obserwowalimy w wyniku transformacji, w kulturze tego mikroorganizmu, pochodnej testosteronu – 17D-metylotestosteronu [Brzezowska i in. 1996]. Wprowadzenie wizania podwójnego C6-C7 zaobserwowa równie Smith [1989] w reakcji androstendionu w mieszanej kulturze Absidia coerulea i Curvularia lunata. Transformacja 17D-etylo-19-nortestosteronu, kolejnej alkilowej pochodnej 19-nortestosteronu, daa dwa gówne produkty: 7D-hydroksy-17D-etylo-19-nortestosteron i 17D-etylo-6-dehydro-19-nortestosteron (rys. 6).. OH C2H5. O Absidia. coerulea. Absidia coerulea. OH C2H5. OH C2H5 + O. OH. O. Rys. 6. Transformacja 17D-etylo-19-nortestosteronu w kulturze A. coerulea Fig. 6. Transformation of 17D-ethyl-19-nortestosterone in A. coerulea culture. Widmo 1H-NMR 7D-hydroksy-17D-etylo-19-nortestesteronu zawiera charakterystyczny dla ekwatorialnego protonu 7E, wski jednoprotonowy sygna przy G=4.05 ppm [Bloom i Schull 1955].. Biotechnologia 7(4) 2008.

(10) E. Brzezowska, J. Dmochowska-Gadysz. 10. Z kolei w widmie 1H-NMR 6-dehydroproduktu obecny jest dwuprotonowy sygna przy G=6.2 ppm, wiadczcy o obecnoci dodatkowego wizania podwójnego. Przesunicie chemiczne sygnau protonu winylowego, dla ukadu 4,6-dieno-3-ketonu, przy atomie wgla C4 (o okoo 0.05 ppm w odniesieniu do substratu) potwierdzaj dane literaturowe [Smith i in. 1989]. Podobne wprowadzenie wizania podwójnego do piercienia B z utworzeniem 6-dehydroproduktu obserwowano w kulturze A. coerulea w wyniku transformacji 17D-metylotestosteronu [Brzezowska i in. 1996] i 17D-metylo-19-nortestosteronu. W dalszej kolejnoci przeprowadzono transformacj substratów zawierajcych na atomie wgla C17 grup 17D-etinylow: 17D-etinylo-19-nortestosteron i 17D-etinylo18-etylo-19-nortestosteron. Stwierdzono, e wyej wymienione substraty nie ulegaj przeksztaceniu w kulturze A. coerulea. Zahamowanie reakcji moe by spowodowane tym, e steroidowe pochodne etinylowe mog by nieodwracalnymi inhibitorami cytochromu P-450 [Zeelen 1990]. Taka etinylowa pochodna jest utleniana do reaktywnego oksirenu, który nastpnie reaguje z enzymem. W wyniku tej reakcji nastpuje inaktywacja enzymu (rys. 7). OH. OH. + HO. O. nieaktywny enzym. HO. Rys. 7. Przebieg nieodwracalnej inhibicji cytochromu P-450 w wyniku dziaania etinylowych pochodnych steroidowych. Fig. 7. The course of irreversible inhibition of cytochrome P-450 as a result of the action of ethynyl steroid derivatives. Podobny hamujcy wpyw grupy 17D-etinylowej na przebieg reakcji zaobserwowano w wyniku bada przeprowadzonych przez

(11) aklej-Marvi a i in. [1986], podczas transformacji zwizków steroidowych w kulturze Rhizopus nigricans. Autorzy stwierdzili, e obecno na atomie wgla C17 grupy 17D-etinylowej wywouje specyficzny wpyw na przebieg transformacji. Transformowane byy zwizki steroidowe zawierajce na atomie wgla C17 grup 17E hydroksylow lub 17D-metylow oraz substraty z grup 17D-etinylow. W przypadku steroidów z grup 17E hydroksylow lub 17D-metylow otrzymywane byy produkty reakcji hydroksylacji z dobrymi wydajnociami, natomiast zwizki zawierajce na atomie wgla C17 grup 17D-etinylow – przeksztacane w mniejszym stopniu lub wcale. Równie w wyniku bada przeprowadzonych przez Hansona i in. [1996], dotyczcych transformacji testosteronu i jego alkilowych oraz etinylowych pochodnych w kulturze Cephalosporium aphidicola, stwierdzono, e obecno grupy 17D-etinylowej moe by utrudnieniem transformacji 17D-etinylotestosteronu w kulturze tego mikroorganizmu.. Acta Sci. Pol..

(12) Transformacje mikrobiologiczne .... 11. WNIOSKI 1. Najbardziej typow reakcj prowadzon przez system enzymatyczny Absidia coerulea jest reakcja wprowadzenia grupy hydroksylowej do szkieletu steroidowego. 2. Kierunek przebiegu reakcji uzaleniony jest od struktury substratu. Nie podstawiony na atomie wgla C17 grup alkilow 19-nortestosteron przeksztacany by do 15D-hydroksypochodnej, podczas gdy jego 17D-alkilowe (metylowe i etylowe) pochodne ulegay transformacji, dajc gównie 7D-hydroksypochodne bdce produktami hydroksylacji w piercieniu B. 3. W przypadku zwizków steroidowych zawierajcych grup 17D-etinylow reakcja w kulturze szczepu A. coerulea przebiega w znacznie mniejszym stopniu lub nie zachodzi. 4. Obok reakcji hydroksylacji steroidów system enzymatyczny A. coerulea katalizuje rzadko prowadzone przez grzyby wprowadzenie wizania podwójnego C6-C7. PIMIENNICTWO Bell A.M., Cherry P.C., Clark J.M., Denny W.A., Sir Ewart Jones. R.H., Meakins G.D., Woodgate P.D., 1972. Microbiological hydroxylation of steroids. Part IV. The pattern of dihydroxylation of monooxygenated 5D-androstanes with cultures of the fungus Calonectria decora. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 2081–2095. Bloom B.M., Schull G.M., 1955. Epoxidation of unsaturated steroids by microorganisms. J. Am. Chem. Soc., 77, 5767–5768. Brzezowska E., Dmochowska-Gadysz J., Koek T., 1996. Biotransformation XXXIX. Metabolism of Testosterone, Androstenedione, Progesterone and Testosterone Derivatives in Absidia coerulea Culture. J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 57, 5/6, 357–362. Charney W., Herzog H.L., 1967. Microbial Transformation of Steroids. A Handbook, Academic Press, New York and London, 269. Chen K., Tong W.Y., Wei D.Z., Jiang W., 2007. The 11E hydroxylation of 16,17D-epoxyprogesterone and the purification of the 11E-hydroxylase from Absidia coerulea IBL02. Enzyme and Microbial Technology. 41, 71–79. Clark M.A., Hufford D.J., 1991. The use of microorganisms for the study of drug metabolism: An update. Medicinal Research Reviews, 11, 5, 473–501. Cotillon A.C., Morfin R., 1999. Transformation of 3-hydroxy-steroids by Fusarium moniliforme 7D-hydroxylase. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 68, 229–237. Faramarzi M.A., Yazdi M.T., Amini M., Zarrini G., Shafiee A., 2003. Microbial hydroxylation of progesterone with Acremonium strictum. FEMS Microbiology Letters, 222, 183–186. Fernandes P., Cruz A., Angelova B. Pinheiro H.M. i Cabral J. M. S., 2003. Enzyme and, Microbial conversion of steroid compounds: recent developments. Microbial Technology. 32, 688–70. Hanson J.R., Nasir H. i Parvez A., 1996. The hydroxylation of testosterone and some relatives by Cephalosporium aphidicola. Phytochemistry. 42, 411-415. Huszcza E., Dmochowska-Gadysz J., 2003. Transformation of testosterone and related steroids by Botrytis cinerea. Phytochemistry. 62, 155-158. Kieslich K., 1991. Biotransformations of industrial use. Acta Biotechnol., 11, 559–570. Kirk D.N., Toms H.C., Douglas Ch. i White K., 1990. A survey of the high – field 1H-NMR spectra of the steroid hormones, their hydroxylated derivatives and related compounds. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 1567–1594.. Biotechnologia 7(4) 2008.

(13) 12. E. Brzezowska, J. Dmochowska-Gadysz. Koek T., wizdor A., 1998. Biotransformation XLV. Transformations of 4-Ene-3oxo Steroids in Fusarium Culmorum Culture. J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 67, 63–69. Mahato S.B., Majumdar I., 1993. Current trends in microbial steroid biotransformation. Phytochemistry. 34, 883–898. Mahato S.B., Garai S., 1997. Advances in microbial steroid biotransformation. Steroids. 62, 4, 332–345. Smith L.L., 1980. Terpenoids and Steroids 4. Overton K.H. (Ed.). Smith K.E., Latif S. i Kirk D.N., 1989. Microbial transformations of steroids – V. Transformation of progesterone by whole cells and extracts of Botryosphaerica obtusa. J. Steroid Biochem., 33, 927–934. Tamm C., Gubler A., Juhas G., Weiss-Berg E. i Zurcher W., 1963. Über die substratspecifitat der Hydroxylierung von Androstan und Pregnandenvaten durch Fusarium lini. Helv. Chim. Acta., 46, 889–906. Templeton J.F., Kumar V. P.S., 1987. New hydroxylation products of progesterone with Mucor griseocyanus. Journal of Natural Products. 50, 463–467. Wilson M.R., Gallimore W.A., Reese P.B., 1999. Steroid transformations with Fusarium oxysporum var. cubense and Colletotrichum musae. Steroids., 64, 834–843. Zeelen F. J., 1990. Medicinal Chemistry of Steroids. Timmerman H. (Ed.). Zhang B., Zhu H., Liu X., 2004. Effect of Supercritical Fluids on C11E-hydroxylation activity of Absidia coerulea. Biotechnol. Prog. 20 (6), 1885–1887. Zürcher R.F., 1963. Protonenresonanzspektroskopie und Steroidstruktur II. Die lage der C-18 und C-19-Methylsignale in Abhangigkeit von den Substituenten am steroidgerust. Helv. Chim. Acta., 46, 2054–2088.

(14) aklej-Mavri M., Beli I. i Gottlieb H.E., 1986. The bioconversion of 17D-ethynyl steroids with 11D-hydroxylase of Rhizopus nigricans. FEMS., 33, 117–120.. MICROBIAL TRANSFORMATION OF C18 STEROIDS: 19-NORTESTOSTERONE AND ITS 17D-ALKYL AND ETHYNYL DERIVATIVES IN ABSIDIA COERULEA CULTURE Abstract. The strain of Absidia coerulea 93 was used to investigate the transformations of C18 steroids: 19-nortestosterone and its 17D-alkyl and ethynyl derivatives. 19-nortestosterone and its 17D-alkyl derivatives were transformed, forming hydroxylated products. It was found that the position of the introduced hydroxyl group depended on the structure of the substrate: 19-nortestosterone underwent hydroxylation at C15, whereas 19-nortestosterone 17D-alkyl derivatives were predominantly hydroxylated at 7D-position. Besides hydroxylation introduction of double bond C6-C7 was observed. It was noticed that 19-nortestosterone 17D-ethynyl derivatives were not transformed in Absidia coerulea culture. Key words: Absidia coerulea, hydroxylation, steroids, microorganisms. Zaakceptowano do druku – Accepted for print: 15.12.2008 Do cytowania – For citation: Brzozowska E., Dmochowska-Gadysz J., 2008. Transformacje mikrobiologiczne wybranych substratów steroidowych szeregu C18: 19-nortestosteronu i jego 17D-alkilo- i etinylopochodnych w kulturze Absidia coerulea. Acta Sci. Pol. Biotechnol. 7(4), 3–12.. Acta Sci. Pol..

(15) Acctaa Scci. Pool., Biioteech hnooloogiia 7(44) 200 2 08,, 133-222. WYK W KO OR RZ ZYS ST TAN NIIE GL LIICE ER RO OLU U OD DP PADO OW WE EG GO O DO O BI BIOS SY YN NTE EZ ZY Y KW KWAS SU U CY CYTR RY YN NOW W GO WEG O PR RZ ZEZ Z YA ARR RO OW WIA AL LIP PO OLYT TIC CA A WR WRAT ATIISL LA AVIIA A AW WG77* Annita Ry R wiisskaa Unniw werssyteet Przy P yroodnniczzy we w Wroc W caw wiuu1 Strreszzczeeniee. Odpa O adow wy gliccerool z proodukkcji bioodieesla,, zaw wieerajcy 3500 g·ddm-3 glliceroluu, zasstossowanoo jakko subs s stratt w proocesie bios b ynteezyy kw wasuu cyytrynnow wegoo prrzezz muutannta octa o anow weggo Y. Y lipollyticca Wra W atisllavia AWG A G7 w hod h dowlli feed-bbatcch. W czas c sie 1400 h proocessu uyyty w baddaniiachh szzczeep prod p dukowaa 133, 1 ,4 g·dm g m-3 kw wasuu cyytrynnow wegoo i 2,77 g·dm-3 kw wasuu izoocyytrynnow wegoo z szyybkooci prroduukcj cji i wyydajnnoci kw wasuu cyytrynnow wegoo, odpo o o- -11 wiednnio 0,95 0 5 g·ddm-3 h i 0,67 g·gg-1. St S eniie caakoowitte pozo p ostaaychh kw wassów orgganiicznnychh: kw wasuu jabbkooweego,, -kketoogluutarooweego i fuumaarow weggo nie n prze p ekraaczaao 6 g·dm-3 . Pona P adtoo, w hoddow wli sttwieerdzzono obbecnno pooliooli, taki t ich jak j eryytryttol i mannnitoll, kttóryych steniie w osio odpoowieedniio 9,8 9 i 2,77 g·ddm-3 . na kocu proocessu wyno. Soowaa klluczzow we: kw was cytrrynoowyy, glice g eroll oddpaddow wy, hoddow wla fedd-baatchh, Yarro Y owiia lippolytticaa. WS ST P Dyyrekktyw wa Unnii Eur E ropejskkiejj 200033/300/EC C z dnnia 8 maj m a 2003 2 3 r. wpproowadziia zap z pis stosow wannia doddatkku biookom mponeentóów (biioettanoolu i biod b diessla)) doo paaliw w konw k wenncjoonaalp zez kraaje czonkkow wskie Uni U ii Euro E opej ejskkiej w iloci 5,775% % do 2010 2 0 r.. i 20% 2 % do d nycch prz 20220 rokku. W zw wizzkuu z tym m nak n kazeem dyynam micczniie zac z za rozw r wijaa si prooduukcjja estrrów w mety m ylow wycch wy w szzychh kw wassów w tuuszzczoowyychh FA AM ME (fat ( tty acid a d meth m hyl estterss), tzw w. biod b diessla. Doo prroduukccji tego t o biokkom mponnenntu uyywaane s oleeje rolinnne, npp. rzzepaakow wy,, paalm mow wy, sooneccznnikoowyy, sojo s owyy luub tus t szczze zwierzzce [Fukkudda i inn. 200 2 1, Maarchhettti i in. 20007]. W prrzyszooci duuee naadziiejee bd zw wizzanee z wyykorrzysstanniem m do d proodukcji biod b diessla tusszczów w poc p hoddzenniaa mikr m obiioloogicczneegoo uzzysskiw wannegoo z hoodow wli alg i drroddyy [D Dunnahhay i in. i 19996,, Ratle R edgge i Wyn W nn 20002, Raatleedgee 2004 2 4,. * Bada B aniaa reaalizoowaane w rama r achh graantuu MN NiS SW 2P006T T 0444 300 w lataach 20006––20009. Adrres do kooressponndenncji – Coorressponndinng autthorr: Anit A a R Ryw wisska, Kaateddra Biootecchnoologgii i Mikr M robiioloogii

(16) yywnnocci, Uniw U werrsytet Przy P yroddnicczy wee Wro W caw wiu, ull. C.K C K. Norw N widaa 25, 2 50––3755 Wroc W caw w, e--maail: anit a ta.ryywinnska@ @up.w wrooc.pl.

(17) 14. A. Rywiska. Guschina i Harwood 2006, Li i in. 2006]. Rodzaj zastosowanego oleju do produkcji biodiesla i stopie jego rafinacji ma duy wpyw na przebieg procesu transestryfikacji triacyloglicerydów i na jako uzyskanego produktu [Altiparmak i in. 2007]. FAME mog by stosowane jako paliwo do silników z zaponem samoczynnym (Diesla) lub do systemów grzewczych [Hirschmann i in. 2005]. Produktem ubocznym w procesie otrzymywania estrów metylowych jest glicerol. Szacuje si, e w niedalekiej przyszoci w Europie bdzie powstawao ok. 1 miliona ton surowego glicerolu rocznie. Zagospodarowanie tak duej iloci taniego glicerolu wymaga poszukiwania nowych metod jego waloryzacji w cenniejsze produkty chemiczne. Jednym z interesujcych rozwiza jest wykorzystanie go jako róda wgla i energii w procesach mikrobiologicznych. Glicerol by z powodzeniem wykorzystywany w procesach fermentacyjnych do biosyntezy 1,3-propanodiolu [Chen i in. 2003, Papanikolaou, Aggelis 2003], kwasu bursztynowego [Lee i in. 2001], wodoru i alkoholu etylowego [Ito i in. 2005], czy dihydroksyacetonu [Bories i in. 1991]. W procesach tlenowych glicerol jako substrat stosowano do produkcji Single-Cell-Oil [Papanikolaou i in. 2008], erytrytolu [Rymowicz i in. 2008], drody paszowych [Juszczyk i in. 2005] i kwasu cytrynowego [Papanikolaou i in. 2002, Rymowicz i in. 2006]. Wedug bada Rymowicza i in. [2006] oraz Papanikolaou i in. [2002] proces biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu przez drode Yarrowia lipolytica zachodzi z wydajnoci ok. 60%, a stenie kocowe kwasu w brzeczce jest w zakresie od 73 do 140 gdm-3. Takie wyniki s na tyle korzystne, e proces drodowej fermentacji cytrynowej na glicerolu moe by interesujcym alternatywnym rozwizaniem technologicznym do procesu pleniowego z udziaem grzybów Aspergillus niger. W procesie biosyntezy kwasu cytrynowego stosowano zarówno glicerol o czystoci technicznej, jak i glicerol odpadowy o rónym stopniu oczyszczenia i zawartoci glicerolu [Levinson i in. 2007]. Glicerol odpadowy moe zawiera take niewielkie iloci estrów, metanol oraz znaczne iloci soli [Papanikolaou i in. 2008]. Zanieczyszczenia te mog mie istotny wpyw na przebieg wzrostu drody i proces produkcji kwasu cytrynowego. Niewiele jest bada powiconych wykorzystaniu surowców o niskiej zawartoci glicerolu w takich procesach biosyntezy. Celem pracy jest ocena przydatnoci odpadowego glicerolu pochodzcego z produkcji estrów metylowych o niskiej zawartoci glicerolu do biosyntezy kwasu cytrynowego przez szczep Y. lipolytica Wratislavia AWG7 w hodowli fed-batch. MATERIAY I METODY Mikroorganizm. W badaniach stosowano szczep drody Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7 o gadkim fenotypie kolonii, otrzymany przez Rywisk i in. [2003]. Szczep jest mutantem octanowym (oct-), pochodzi z kolekcji wasnej Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii

(18) ywnoci Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocawiu, a przechowywano go na skosach YM, w temp. 4° C. Podoa. Podoe inokulacyjne miao skad (gdm-3): glicerol – 50,0; ekstrakt drodowy – 3,0; ekstrakt sodowy – 3,0; bactopepton – 5,0; woda destylowana do 1 litra. Do podoa produkcyjnego uyto nastpujcych skadników (gdm-3): glicerol – 90,0; NH4Cl – 3,0; MgSO4 x 7H2O – 1,0; KH2PO4 – 0,2; ekstrakt drodowy – 1,0; woda wodocigowa – do 1 litra. W czasie hodowli podoe produkcyjne dwukrotnie (po 24 i 48 h) zasilono roztworem glicerolu odpadowego (po ok. 220 cm3), tak aby stenie cakowite glicerolu wynosio 200 gdm-3 (przy objtoci roboczej zbiornika 1,3 dm3).. Acta Sci. Pol..

(19) Wykorzystanie glicerolu .... 15. Surowiec. W badaniach stosowano oczyszczony glicerol odpadowy pochodzcy z produkcji estrów metylowych (biorafineria SG BODDINS GmbH, Niemcy), zawierajcy 350 gdm-3 glicerolu i 0,65 gdm-3 NaCl. Warunki prowadzenia hodowli. Hodowle inokulacyjne prowadzono na wstrzsarce rotacyjnej typu Elpan przy 160 rpm w 250 cm3 kolbach stokowych zawierajcych 25 cm3 podoa inokulacyjnego przez 72 godz. w temp. 30°C. Do zaszczepienia podoa produkcyjnego w bioreaktorze uywano 50 cm3 zawiesiny komórek namnoonych w hodowli inokulacyjnej. Bezporednio po zaszczepieniu objto podoa produkcyjnego wynosia ok. 0,85 dm3. Proces biosyntezy kwasu cytrynowego by prowadzony w 3,5-litrowym bioreaktorze typu BIOFLO III (New Brunswick, USA), o objtoci roboczej zwikszajcej si od 0,85 do 1,3 dm3, przy szybkoci przepywu powietrza 0,2 vvm, szybkoci obrotowej mieszada 600 rpm, w temp. 30°C. W czasie procesu pH utrzymywano automatycznie na poziomie 5,5 za pomoc 40% NaOH. Metody analityczne. Biomas oznaczano metod wagow. Kwas izocytrynowy (ICA) oznaczano metod enzymatyczn przy udziale dehydrogenazy cytrynianowej [Goldberg i Ellis 1983]. Stenie kwasu cytrynowego (KC), kwasu fumarowego (FUM), kwasu jabkowego (MAL), kwasu -ketoglutarowego (KET), glicerolu (GLY), erytrytolu (ER) i mannitolu (MAN) oznaczano metod HPLC na kolumnie Aminex HPX87H podczonej do detektorów UV (=210 nm) i RI w temperaturze pokojowej. Szybko przepywu fazy ciekej (20 mM H2SO4) przez kolumn wynosia 0,6 cm3·min-1. Spis uytych symboli qKC = szybko waciwa produkcji kwasu cytrynowego – specific citric acid production rate (gg-1h-1) QKC = szybko produkcji kwasu cytrynowego – volumetric citric acid production rate (gdm-3h-1) YKC = wydajno cakowita kwasu cytrynowego – total yield of citric acid (gg-1) OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW Szczegóowej analizie poddano przebieg procesu biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu przez szczep Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7 w hodowli fed-batch. Stenie cakowite glicerolu w tym procesie wynosio 200 gdm-3. Cakowite wyczerpanie glicerolu nastpio w 140 h hodowli (rys. 1). Zawarto. biomasy w 24 h hodowli wynosia 26 gdm-3, jednak po kadym zasileniu podoa hodowlanego roztworem glicerolu zwikszaa si objto robocza reaktora z 0,85 do 1,3 dm3, co spowodowao obnienie zawartoci biomasy do ok. 14,5 gdm-3 w 60 h hodowli. Czynnikiem limitujcym wzrost drody Y. lipolytica Wratislavia AWG7 by NH4Cl na poziomie 3 gdm-3. W przypadku stosowania surowców odpadowych naley liczy si z obecnoci w nich rónych zanieczyszcze, w tym dodatkowych róde azotu, które mog zwikszy stenie biomasy, inne mog ogranicza wzrost drody. W analogicznej hodowli tego szczepu poprowadzonej w podou z czystym glicerolem ilo biomasy bya wysza i wynosia 19 gdm-3 [Rywiska i in. 2009]. Prawdopodobnie, wykorzystany w niniejszej pracy surowiec zawiera czynniki, które hamuj wzrost drody. W 140 h procesu fed-batch uzyskano 133,4 g·dm-3 kwasu cytrynowego z wydajnoci 0,67 g·g-1 (tab. 1). Ten sam szczep produkowa znacznie nisze iloci kwasu. Biotechnologia 7(4) 2008.

(20) A. Rywiska. 16. cytrynowego (88,1 g·dm-3) z wydajnoci 0,44 gg-1 (z 200 g·dm-3 glicerolu) w hodowli periodycznej [Rymowicz, in. 2006]. Wedug wielu autorów system fed-batch, w którym substrat jest dodawany w kilku porcjach lub w sposób cigy, jest lepszym rozwizaniem hodowlanym w przypadku stosowania wysokich ste substratu [Levišauskas i in. 2006, Limtong i in. 1987]. Ponadto, wydajno produktu jest generalnie wysza w porównaniu do procesów okresowych [Kim i in. 2007]. Wysokie kocowe stenie kwasu cytrynowego w brzeczce oraz wydajno cakowita kwasu cytrynowego w przeprowadzonym procesie fed-batch przez szczep Wratislavia AWG7 s porównywalne z wynikami uzyskanymi przez innych autorów [Levinson i in. 2007, Papanikolaou i Aggelis 2003, Papanikolaou i in. 2008]. Levinson i in. [2007] analizowali uzdolnienia do produkcji kwasu cytrynowego z czystego glicerolu dwudziestu siedmiu szczepów z gatunku Y. lipolytica, dwóch szczepów Aciculoconidium aculeatum oraz trzech szczepów Candida sp. Najwysz koncentracj kwasu cytrynowego (21,8 g·dm-3) oraz najwysz wydajno (0,545 g·g-1), otrzymano w hodowli szczepu Y. lipolytica NRRL YB-423, przy pocztkowym steniu glicerolu 40 g·dm-3. Szczep Y. lipolytica ACA-DC 50109 zastosowany przez Papanikolaou i in. [2008] w podou zawierajcym 164 g·dm-3 surowego glicerolu produkowa tylko 62,5 g·dm-3 kwasu cytrynowego z wydajnoci 0,56 g·g-1, a wic nisz ni szczep Wratislavia AWG7 uyty w niniejszej pracy, a po zakoczeniu procesu w 600 h hodowli w podou wci znajdowao si 52,5 g·dm-3 glicerolu. Natomiast wysze wartoci wydajnoci kwasu cytrynowego uzyskiwano w procesach z udziaem rónych szczepów Y. lipolytica, gdzie jako substrat stosowano etanol [Arzumanov i in. 2000], n-parafiny [Crolla i Kennedy 2001], olej rzepakowy [Kamzolova i in. 2005] lub sacharoz [Förster i in. 2007]. Wedug Anastassiadis i Rhem [2006] szczep Candida oleophila ATCC 20177 produkowa kwas cytrynowy z glukozy z wydajnoci 0,41–0,51 g·g-1. GLY. X. ICA 50. 120. 40. 90. 30. 60. 20. 30. 10. 0. 0 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 140. X, ICA (g dm-3). KC, GLY (g dm-3). KC 150. 160. Czas – Time (h). Rys. 1. Produkcja biomasy [X], kwasu cytrynowego (KC), kwasu izocytrynowego (ICA) oraz zuycie glicerolu [GLY] przez Y. lipolytica Wratislavia AWG7 w hodowli fed-batch. Roztwór glicerolu (350 gdm-3) by wprowadzony do bioreaktora periodycznie w 24 i 48 h do cakowitego stenia 200 gdm-3, co pokazuj strzaki Fig. 1. Biomass (X), citric acid (KC) and isocitric acid (ICA) and uptake of glycerol (GLY) during fed-batch culture of Y. lipolytica Wratislavia AWG7. Glycerol solution (350 gdm-3) was periodically fed into the fermentor at 24 and 48 h until the total concentration of 200 gdm-3 was reached after the initiation of the fed-batch mode indicated by an arrow. Acta Sci. Pol..

(21) Wykorzystanie glicerolu .... 17. Tabela 1. Parametry kinetyczne wzrostu i biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu odpadowego przez szczep Y. lipolytica Wratislavia AWG7 Table 1. Kinetic parameters of growth and citric acid fermentation from crude glycerol by strain of Y. lipolytica Wratislavia AWG7 strain Parametr Parameter Czas – Time Biomasa – Biomass Kwas cytrynowy – Citric acid Kwas izocytrynowy – Isocitric acid YKC QKC qKC. (h) (gdm-3) (gdm-3) (gdm-3) (gg-1) (gdm-3h-1) (gg-1h-1). Glicerol odpadowy Crude glycerol 140 14,5 133,4 2,7 0,67 0,95 0,066. Podstawow wad drodowej fermentacji cytrynowej jest nagromadzanie w rodowisku hodowlanym produktu ubocznego, jakim jest kwas izocytrynowy. W zalenoci od uytego substratu kwas izocytrynowy stanowi nawet do 50% sumy kwasów cytrynowych. Wedug wczeniejszych bada stwierdzono, e mutanty oct- cechuj si nisk produkcj kwasu izocytrynowego zarówno w hodowlach z glukoz, jak i z glicerolem [Rymowicz i in. 2005, 2006, Rywiska i in. 2006]. W przeprowadzonej hodowli fed-batch z udziaem szczepu Wratislavia AWG7 ilo tego produktu ubocznego bya niska i wynosia na kocu hodowli 2,7 g·dm-3, co wpywao na uzyskanie wysokiej czystoci procesu (ok. 98%), a kwas izocytrynowy stanowi 2% sumy wytworzonych kwasów cytrynowych. W zalenoci od zastosowanego glicerolu (odpadowy lub czysty) i typu hodowli (okresowa wstrzsarkowa lub wgbna okresowa w bioreaktorze) stenie kwasu izocytrynowego w hodowlach mutantów octanowych wynosio od 0,3 do 5,8 g·dm-3 [Rymowicz i in. 2005, 2006]. Dla porównania, w hodowli z udziaem szczepu dzikiego typu, Y. lipolytica A-101, w podou z glicerolem odpadowym i z glicerolem czystym otrzymano 12,6 i 17,8 g·dm-3 kwasu izocytrynowego, co stanowio odpowiednio 15,8 i 21,1% kwasu izocytrynowego w sumie kwasów (dane niepublikowane). W badaniach Levinson i in. [2007] sporód 27 szczepów wyselekcjonowanych do procesu produkcji kwasu cytrynowego z glicerolu tylko jeden produkowa mniej ni 10% kwasu izocytrynowego. Badano równie obecno innych metabolitów porednich z cyklu Krebsa, takich jak: kwas jabkowy, fumarowy i -ketoglutarowy w rodowisku hodowlanym. Ich sumaryczna ilo nie przekraczaa jednak 6 g·dm-3 (rys. 2). Uzyskane w tym zakresie wyniki trudno jest porówna z wynikami innych autorów, poniewa w dostpnej literaturze brak danych na temat ubocznej produkcji poredników cyklu Krebsa czy glikolizy. W omawianym w niniejszej pracy procesie, równolegle z nadprodukcj kwasu cytrynowego, tworzone byy alkohole cukrowe, takie jak erytrytol i mannitol, których stenia na kocu hodowli wynosiy odpowiednio 9,8 i 2,7 g·dm-3 (rys. 3). Zdolno. drody Y. lipolytica do nadprodukcji polioli z glicerolu bya obserwowana podczas procesu biosyntezy kwasu cytrynowego w hodowlach innego szczepu, równie mutanta octanowego, Y. lipolytica Wratislavia K1 [Rymowicz i in. 2008, Rywiska i in. 2008]. Szczep ten w hodowlach fed-batch, w zalenoci od sposobu dozowania i pocztkowego stenia glicerolu, produkowa (z 200 g·dm-3 glicerolu) wysze iloci erytrytolu, w zakresie od 41 do 81 g·dm-3 [Rymowicz i in. 2008]. Natomiast w procesach okresowych,. Biotechnologia 7(4) 2008.

(22) A. Rywiska. 18. w których pocztkowe stenie czystego glicerolu byo dwukrotnie nisze i wynosio 100 g·dm-3, stenie erytrytolu i mannitolu na kocu hodowli wynosio odpowiednio 19,3 i 10,2 g·dm-3 [Rywiska i in. 2008]. Na uwag zasuguje fakt, e podczas gdy szczep Wratislavia K1 nagromadza erytrytol przez cay czas trwania procesu, szczep Wratislavia AWG7 po obnieniu stenia glicerolu utylizuje wolno oba poliole, co moe mie wpyw na zwikszenie wydajnoci kwasu cytrynowego (rys. 3). KET. MAL 6. 0,45. 5. 0,36. 4. 0,27. 3. 0,18. 2. 0,09. 1. 0. MAL (g dm-3). FUM, KET, (g dm-3). FUM 0,54. 0 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 140. 160. Czas – Time (h). Rys. 2. Produkcja kwasu fumarowego (FUM), -ketoglutarowego (KET) i jabkowego (MAL) podczas procesu biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu odpadowego przez szczep Y. lipolytica Wratislavia AWG7 w hodowli fed-batch Fig. 2. Production of fumaric acid (FUM), -ketoglutaric acid (KET) and malic acid (MAL) during fed-batch production of citric acid from crude glycerol by Y. lipolytica Wratislavia AWG7 strain ER. MAN. 12 MAN, ER (g dm-3). 10 8 6 4 2 0 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 140. 160. Czas – Time (h). Rys. 3. Produkcja erytrytolu (ER) i mannitolu (MAN) przez Y. lipolytica Wratislavia AWG7 z glicerolu odpadowego w hodowli fed-batch Fig. 3. Production of erythritol (ER) and mannitol (MAN) by Y. lipolytica Wratislavia AWG7 on glycerol medium in fed-batch cultivation system. Acta Sci. Pol..

(23) Wykorzystanie glicerolu .... 19. Dynamika procesu biosyntezy kwasu cytrynowego w czasie hodowli bya zrónicowana. W fazie spowolnionego wzrostu, pomidzy 20–46 h hodowli, objtociowa szybko produkcji kwasu cytrynowego (QKC) ksztatowaa si w zakresie od 1,7 do 2,6 g·dm-3h-1 (rys. 4). W kolejnych godzinach hodowli, kiedy komórki byy w fazie stacjonarnej, szybko produkcji kwasu cytrynowego obniaa si do ok. 0,52 g·dm-3h-1 w 95 h hodowli i utrzymywaa si na takim poziomie do koca procesu. Szybko waciwa produkcji kwasu cytrynowego wynosia w tym czasie okoo 0,038 g·g-1h-1 (rys. 4). Podobne obnianie si dynamiki produkcji kwasu cytrynowego byo obserwowane podczas biosyntezy kwasu cytrynowego z hydrolu glukozowego przez dziki szczep Y. lipolytica A-101 [Wojtatowicz i Rymowicz 1991] oraz z glukozy przez szczep Candida olephila ATCC 20177 [Anastassiadis i in. 2002]. Warto jednak podkreli , e rednia szybko objtociowa produkcji kwasu cytrynowego, liczona dla caego procesu, bya wysoka i wynosia QKC= 0,95 g·dm-3h-1 (tab. 1), nieznacznie tylko nisza ni w hodowli z czystym glicerolem, 1,16 g·dm-3h-1 [Rywiska i in. 2009]. q 0,2. 3. 0,15. 2. 0,1. 1. 0,05. 0. 0 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 140. qKC (g g-1h-1). QKC (g dm-3 h-1). Q 4. 160. Czas – Time (h). Rys. 4. Objtociowa szybko produkcji kwasu cytrynowego (QKC) i szybko waciwa produkcji kwasu cytrynowego (qKC) podczas procesu biosyntezy kwasu cytrynowego z glicerolu odpadowego przez szczep Y. lipolytica Wratislavia AWG7 w hodowli fed-batch Fig. 4. Volumetric citric acid production rate (QKC) and specific citric acid production rate (qKC) during citric acid biosynthesis from crude glycerol by Y. lipolytica Wratislavia AWG7 strain in fed-batch culture. Podsumowujc wyniki bada, mona stwierdzi , e glicerol odpadowy pochodzcy z produkcji estrów metylowych o niskiej zawartoci glicerolu (350 g·dm-3) jest bardzo dobrym ródem wgla do biosyntezy kwasu cytrynowego dla szczepu Y. lipolytica Wratislavia AWG7 w systemie fed-batch. Zanieczyszczenia obecne w surowcu pozostaway bez wpywu na dynamik i wydajno procesu biosyntezy kwasu cytrynowego, które byy wysokie i wynosiy odpowiednio 133,4 g·dm-3 i 0,67 g·g-1. Ponadto proces fermentacji charakteryzowa si wysok czystoci z uwagi na nisk zawarto kwasu izocytrynowego, metabolitów porednich cyklu Krebsa oraz polioli.. Biotechnologia 7(4) 2008.

(24) 20. A. Rywiska. PIMIENNICTWO Altiparmak D., Keskin A., Koca A., Gürü M., 2007. Alternative fuel properties of tall oil fatty acid methyl esters-diesel fuel blends. Bioresource Technol. 98, 241–246. Anastassiadis S., Aivasidis A., Wandrey C., 2002. Citric acid production by Candida strains under intracellular nitrogen limitation. Appl. Micrrobiol. Biotechnol. 60, 81–87. Anastassiadis S., Rhem H.J., 2006. Citric acid production from glucose by yeast Candida oleophila ATCC 20177 under batch, continuous and repeated batch cultivation. Electron. J. Biotechnol. 9, 26–39. Arzumanov T.E., Shishkanova N.V., Finogenova T.V., 2000. Biosynthesis of citric acid by Yarrowia lipolytica repeat-batch on culture on ethanol. Appl. Micrrobiol. Biotechnol. 53(5), 525– 529. Bories A.C., Claret C., Soucaille P., 1991. Kinetic study and optimisation of the production of dihydroxyacetone from glycerol using Gluconobacter oxydans. Process Biochemistry 26(4), 243–248. Chen X., Xiu Z., Wang J., Zhang D., Xu P., 2003. Stoichiometric analysis and experimental investigation of glycerol bioconversion to 1,3-propanediol by Klebsiella pneumoniae under microaerobic conditions. Enzyme Microb. Technol. 33(4), 386–394. Crolla A., Kennedy K.J., 2001. Optimization of citric acid production from Candida lipolytica Y-1095 using n-paraffin. J. Biotechnol. 89, 27–40. Dunahay T.G., Jarvis E.E., Dais S.S., Roessler P.G., 1996. Manipulation of microalgal lipid production using genetic engineering. Appl. Biochem. Biotechnol. 57–58, 223–231. Förster A., Aurich A., Mauersberger S., Barth G., 2007. Citric acid production from sucrose using a recombinant strain of the yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 1409– 1417. Fukuda H., Kondo A., Noda H., 2001. Biodiesel fuel production by transesterification of oils. Journal of Bioscience and Bioengineering. 92(5), 405–416. Goldberg D., Ellis G., 1983. Isocitrate dehydrogenase, [in:] Bergmeyer HU (ed). Methods of enzymatic analysis. Verlag Chemie, Weinheim, 3, 183–190. Guschina I.A., Harwood J.L., 2006. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Prog. Lipid Res. 45, 160–186. Hirschmann S., Baganz K., Koschik I., Vorlop K.D., 2005. Development of an integrated bioconversion process for the production of 1,3-propanediol from raw glycerol waters. Landbauforschung Völkenrode 55, 261–267. Ito T., Nakashimada Y., Senba K., Matsui T., Nishio N., 2005. Hydrogen and ethanol production from glycerol-containing wastes discharged after biodiesel manufacturing process. Journal of Bioscience and Bioengineering 100(3), 260–265. Juszczyk P., Musia I., Rymowicz W., 2005. Dobór szczepów drody do produkcji biomasy z glicerolu odpadowego. Acta Scient. Polon. Biotechnol. 4(1–2), 65–76. Kamzolova S.V., Morgunov I.G., Aurich A., Perevoznikova O.A., Shishkanova N.V., Finogenova T.V., Stottmeister U., 2005. Lipase secretion and citric acid production in Yarrowia lipolytica yeast grown on animal and vegetable fat. Food Technol. Biotechnol. 43, 113–122. Kim Y.H., Kang S.W., Lee J.H., Chang H.I., Yun C.W., Paik H.D., Kang C.W., Kim S.W., 2007. High cell density fermentation of Saccharomyces cerevisiae JUL3 in fed-batch culture for the production of ß-glucan. J. Ind. Eng. Chem. 13(1), 153–158. Lee P.C., Lee W.G., Lee S.Y., Chang H.N., 2001. Succinic acid production with reduced byproduct formation in the fermentation of Anaerobiospirillum succiniciproducens using glycerol as a carbon. Biotechnology and Bioengineering 72(1), 41–48.. Acta Sci. Pol..

(25) Wykorzystanie glicerolu .... 21. Levinson W.E., Kurtzman C.P., Kuo T.M., 2007. Characterization of Yarrowia lipolytica and related species for citric acid production from glycerol. Enzyme Microb. Technol. 41, 292– 295. Levišauskas D., Galvanauskas V., Simutis R., Žilinskas A., Žilinskas J., 2006. Optimization of biomass production in fed-batch culture by feed and dilution controlactions. Information Technol. Control 35(4), 383–390. Li Y.H., Liu B., Zhao Z.B., Bai F.W., 2006. Optimization of Culture Conditions for Lipid Production by Rhodosporidium toruloides. Chin. J. Biotechnol. 22(4), 650–656. Limtong S., Kishimoto M., Seki T., Yoshida T., Taguchi H., 1987. Simulation and optimization of fed-batch culture for ethanol production from molasses. Bioprocess Eng. 2, 141–147. Marchetti J.M., Miguel V.U., Errazu A.F., 2007. Possible methods for biodiesel production. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 11, 1300–1311. Papanikolaou S., Aggelis G., 2003. Modelling aspects of the biotechnological valorization of crude glycerol: production of citric acid by Yarrowia lipolytica and 1,3-propanediol by Clostridium butyricum. J. Chem. Technol. Biotech. 78(5), 542–547. Papanikolaou S., Fakas S., Fick M., Chevalot I., Galiotou-Panayotou M., 2008. Biotechnological valorisation of raw glycerol discharged after bio-diesel (fatty acid methyl esters) manufacturing process: Production of 1,3-propanediol, citric acid and single cell oil. Biomass Bioen. 32, 60–71. Papanikolaou S., Muniglia L., Chevalot I., Aggelis A., Marc I., 2002. Yarrowia lipolytica as a potential producer of citric acid from raw glycerol. J. Appl. Microbiol. 92, 737–744. Ratledge C., Wynn J.P., 2002. The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginous microorganisms. Adv. Appl. Microbiol. 51, 1–51. Ratledge C., 2004. Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for Single Cell Oil production. Biochimie 86 (11), 807–815. Rymowicz W., Juszczyk P., Rywiska A.,

(26) arowska B., Musia I., 2005. Produkcja kwasu cytrynowego z odpadowego glicerolu przez drode Yarrowia lipolytica. Biotechnologia monografie 2 (2), 46–54. Rymowicz W., Rywiska A., Gadkowski W., 2008. Simultaneous production of citric acid and erythritol from crude glycerol by Yarrowia lipolytica Wratislavia K1. Chem. Pap. 62(3), 1–8. Rymowicz W., Rywiska A.,

(27) arowska B., Juszczyk P., 2006. Citric acid production from crude glycerol by acetate mutants of Yarrowia lipolytica. Chem. Pap. 60(5), 391–394. Rywiska A., Skrzypiski A., Juszczyk P., Boruczkowski T., Rymowicz W., 2008. Charakterystyka procesu biosyntezy kwasu cytrynowego i polioli z glicerolu i glukozy przez drode Yarrowia lipolytica. Acta Scient. Polon. Biotechnol. 7(1), 27–38. Rywiska A., Rymowicz W.,

(28) arowska B., Wojtatowicz M., 2009. Biosynthesis of citric acid from glycerol by acetate mutants of Yarrowia lipolytica in fed-batch fermentation. Food Technol. Biotechnol (w druku). Rywiska A., Wojtatowicz M., Wielebiska A., 2003. Otrzymywanie mutantów fil- drody Yarrowia lipolytica do produkcji kwasu cytrynowego. Acta Scient. Polon. Biotechnol. 2(1-2), 11–20. Wojtatowicz M., Rymowicz W., 1991. Effect of inoculum on kinetics and yield of citric acids production on glucose by Yarrowia lipolytica A-101. Acta Aliment. Pol., XVII /XLI/ (2), 137–141.. Biotechnologia 7(4) 2008.

(29) A. Rywiska. 22. THE USE OF CRUDE GLYCEROL FOR CITRIC ACID BIOSYNTHESIS BY YARROWIA LIPOLYTICA WRATISLAVIA AWG7 Abstract. Crude glycerol from biodiesel industry, containing 350 g·dm-3 of glycerol, was used as a substrate for citric acid production by acetate negative mutant of Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7 in fed-batch experiment. This strain produced 133,4 g·dm-3 of citric acid and 2,7 g·dm-3 of isocitric acid, unwanted product in this process, in 140 h of cultivation. As a results the volumetric citric acid production rate and the citric acid yield reached 0,95 g·dm-3h-1 and 0,67 g·g-1, respectively. The total amount of other organic acids such as malic, fumaric and -ketoglutaric acid produced by the Wratislavia AWG7 strain no exceed 6 g·dm-3.Polioles such as erythritol and as well as mannitol were produced in this process also. Concentration of these by-products at the and of process were 9,8 i 2,7 g·dm-3, respectively. Key words: citric acid, raw glycerol, fed-batch system, Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7. Zaakceptowano do druku – Accepted for print: 15.12.2008 Do cytowania – For citation: Rywiska A., 2008. Wykorzystanie glicerolu odpadowego do biosyntezy kwasu cytrynowego przez Yarrowia lipolytica Wratislavia AWG7. Acta Sci. Pol. Biotechnol. 7(4), 13–22.. Acta Sci. Pol..

(30) Acctaa Scci. Pool., Biioteech hnooloogiia 7(44) 200 2 08,, 233-334. PR RO OD DUK KC CJJA PO OZ ZA AKO OM MÓ ÓR RK KO OW WYCH H HY HYD DR ROL LA AZ Z PR RZ ZEZ Z SZ SZCZE EP PY YA AR RRO OW WIIA LI LIPO OL LYT TIC ICA A PO OC CH HODZ Z C CE Z SE ER RA* Mareek Szzotyssikk, Józ J zeffa Ch Chrzaanoow wskka, Mon M nikka

(31) e

(32) lazzkoo, N dbalsskaa, Xy Xymeenaa Po P om mskka, Piot P tr Jus J szcczyyk,, Joannnaa Nied Wojttatoow wiczz Mariia Wo Unniw werssyteet Przy P yroodnniczzy we w Wroc W caw wiuu1 Strreszzczeeniee. Prze P edmioteem badda bya ocen o na zdo z lnoci bioosynntezzy zewn z ntrrzkoomóórkoowyych enzzym mów prooteoolityycznnychh i lipo l olityycznnychh prrzezz pi szcz s zepóów dro d dyy Yarro Y owiia lippolytticaa: JIII1aa, JIII1b, JIII1c,, PIII6a,, PIII6b wyyizolow wanyych z polsk p kichh seerów w pllenniow wychh. Poo 488 goodziinacch ich i hoddow wli na n pod p doaach zaw wieerajcycch rón r ne ród da wgla i azot a tu oznnaczanno zaarów wnoo wzzrosst drroddy, jakk i akty a ywnno. wyytwarzaanych prze p ez nie n prot p teazz woobecc kaazeiiny w pH p 7,5 i hemo h ogloobinny w pH p 3,0 3 orazz lippaz woobecc triibuttyryyny i ollejuu maalaaneggo. W zallennocci odd zaastoosow waneegoo w poddou hodo h owlaanyym ród da wg w gla i azzotuu stw wierrdzoomie wzzrosstu bad b danyych szcczeppów w droddy. Wszystkiie no isttotnee zrrónnicoowaanie w pozziom Y lipo l lyticca w hodo h owllachh naa poodoou zaw wierrajcym m gluk g koz i kaze k ein, odpo o oszcczeppy Y. wiednnio jako j o róódoo wgla w a i azot a tu, osi o gay wzro w ost w graniicacch 1,5– 1 –2,1 · 108 kom k m · mL m -1. waddzennie w miej m jscee gluukoozy olejjów w rolinnnycch spow s woddow wao obnnieeniee licczbyy icch Wpprow kom mórrek w poddou hodo h owllanyym. Poodobbny efeekt wyw woaa subbstyytuccja kazzeinyy prost p tszyymii róódaami azootu oraaz innnym mi biakam mi. Wyyjteek stan s nowi szzczeep JII1 J 1c, któr k regoo poopulacjja niez n aleniee odd wpro w owaddzoneggo do d med m dium m rróda azot a tu wyk w kazyywaaa zbli z onn Z ianaa skkaduu poodooa wppyw waaa takke na bioosynntez ennzymów w hydr h rolittyczzliczzebno . Zmi nych u drroddy.. Doodattek gluukozzy spprzyyja zakkwaaszeeniuu roodowisska, co stym mullow wao proowej.. Wys W szy pooziom biosynntezyy teej dukkcj zeewnntrrzkoomóórkoowejj prroteeinazy asppartyylow prooteinnazzy obse o erwoowaano rów wniee w obec o cnoci biaek serrwattkow wycch w poodoouu. Zaastoosow wannie nato n omiaast oliw wy z oliweek prow p wadzzioo do alkkalizzacji poodooa hoddow wlanegoo i inntennsyffikaacji synntezzy prot p teinaazyy serynoweej. Oliw wa z oliw o wek oraaz poz p zostaae oleeje rol r linnne dynnam mizoowaay tak t e prroduukccj enzy e ymóów lipo l olityycznnychh. Soowaa klu uczzowee: Yarr Y rowia lipollyticca, prot p teinnazyy, lippazyy, biosy b ynteeza * Pracaa wyykonnana w ram machh prrojekktu Minnisteerstw wa Nau N uki i Szkkolnnictw wa Wy W szeego Nr 2 P006T T 0500 288.. M ek Szo S tysiik, Kat K tedraa Techhnologiii Suurow wAdrres do korrespponddenccji – Correespoonding autthorr: Mare ców w Zwie Z erzcycch i Zaarzdzaaniaa Jaakoci, Uniw U werssytet Przyrrodnniczzy we w Wrrocawiiu, ul. C.K K. Norrwidda 25/2 2 27 50–3 5 375 Wrrocaw,, e-m maiil: mare m ek.szolttysik@ @up.wrooc.ppl.

(33) 24. M. Szotysik i in.. WSTP Hydrolazy, a wród nich proteazy i lipazy stanowi wan grup enzymów wykorzystywanych w przemyle ywnociowym. Prowadzone przy ich udziale modyfikacje biaek i tuszczu umoliwiaj przebieg wielu operacji technologicznych, a take przyczyniaj si do otrzymywania nowych produktów [Fox 1995, Vakhlu, Kour 2006]. Wanym ródem pozyskiwania enzymów stay si mikroorganizmy [Kumar i Talagi 1999, Nasciemento i Martins 2004, 2006]. Szczególnie atrakcyjnym gatunkiem wykazujcym zdolno do biosyntezy hydrolaz s drode Yarrowia lipolytica. Dotychczas ich zastosowanie w praktyce sprowadzao si jednak gównie do otrzymywania kwasu cytrynowego [Förster i in. 2007, Crolla, Kennedy 2004, Komzolova i in. 2003]. Wiele szczepów tych drody, izolowanych z produktów ywnociowych bogatych w biako i tuszcz, moe by ródem pozakomórkowych enzymów hydrolizujcych te skadniki [van den Tempel, Jacobson 1998, Czajgucka 2003]. Wród nich obecne s: proteinaza serynowa, aktywna w rodowisku zasadowym i proteinaza aspartylowa, dziaajca w rodowisku kwanym [Ogrydziak 1988, 1993, Gloger i in. 1997, Motaba i in. 1997], a u niektórych szczepów proteinaza aktywna w neutralnym pH [Ogrydziak 1993]. Obok enzymów proteolitycznych drode te syntezuj take enzymy lipolityczne, hydrolizujce triacyloglicerole, gównie w rodowisku zasadowym [Navotny i in. 1988, Corzo, Revah 1999, Destan i in. 1997, Aloulou i in. 2007, Yu i in. 2007a, b]. Obok warunków rodowiskowych takich jak: pH, temperatura prowadzenia hodowli, obecno jonów metali czy stenie tlenu rozpuszczalnego wanym czynnikiem wpywajcym na poziom biosyntezy pozakomórkowych enzymów u drody jest rodzaj i stenie róde wgla i azotu w podou [Singaglia i in. 1994, Corzo, Revah 1999, Kumar, Talagi 1999, Guerzoni i in. 2001, Gdula i in. 2002, Fickers i in. 2004, Lopes i in. 2008]. Jak wykazano w licznych badaniach, dobór odpowiednich warunków hodowli drobnoustrojów umoliwia otrzymywanie nowych i taszych preparatów enzymatycznych, które mog znale zastosowanie w wielu gaziach przemysu [Ikram-ul-Haq i in. 2003, Nescimento, Martins 2004, 2006]. Celem podjtych bada bya ocena zdolnoci produkcji pozakomórkowych proteaz i lipaz, o zrónicowanej swoistoci wobec wybranych substratów, przez drode Y. lipolytica wyizolowane z polskich serów pleniowych, co pozwolioby na wybór sporód nich najlepszego szczepu do otrzymywania preparatów enzymatycznych przydatnych w przemyle ywnociowym, szczególnie mleczarskim. MATERIA I METODY Przedmiotem bada byo pi szczepów drody Yarrowia lipolytica: JII1a, JII1b, JII1c, PII6a, PII6b wyizolowanych z serów z przerostem pleniowym Rokpol [Wojtatowicz i in. 2001], pochodzcych z kolekcji Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii

(34) ywnoci Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocawiu. Hodowl drody prowadzono na poywkach przygotowanych poprzez wymian jednego ze skadników podoa YCG o skadzie (g L-1): ekstrakt drodowy (YE) (1,7), kazeina (2,0), glukoza (10,0). W miejsce glukozy, jako ródo wgla, wprowadzano: oliw z oliwek, olej sonecznikowy, olej kukurydziany, olej rzepakowy, olej malany lub glicerol, a w miejsce kazeiny, stanowicej ródo azotu, wprowadzano: bactopepton. Acta Sci. Pol..

(35) Produkcja pozakomórkowych hydrolaz .... 25. (Oxoid, UK), soyton, tryptose, casamino acids (Difco, USA) i biaka serwatkowe. Hodowl prowadzon w niemodyfikowanym podou YCG przyjto jako standardow. Jako inokulum zastosowano 24 h hodowl drody prowadzon w wytrzsarce, w podou YM (o skadzie (g L-1): ekstrakt drodowy (3,0), ekstrakt sodowy (3,0), bactopepton (5,0), glukoza (20,0), któr dodawano w iloci 2% do hodowli waciwej. Hodowle waciwe drody prowadzono w 50 mL podoa w kolbach o objtoci 300 mL na wytrzsarce (160 rpm) przez 48 h, w temp. 28ºC, a kady wariant przygotowano w trzech powtórzeniach. Po zakoczeniu okresu inkubacji w zawiesinach oznaczano poziom komórek drodowych poprzez ich zliczanie w komorze Thoma, a nastpnie hodowle wirowano (7000 g, 15 min, temp. 4ºC). W klarownym supernatancie oznaczano poziomy aktywnoci proteolitycznej i lipolitycznej. Aktywno proteolityczn wzgldem kazeiny oraz kwasowo denaturowanej hemoglobiny jako substratów, odpowiednio w pH 7,5 i 3,0, badano wg Chrzanowskiej i Koaczkowskiej [1998]. Za jednostk aktywnoci proteolitycznej (1 U) w warunkach eksperymentu przyjto przyrost absorbancji A = 0,01, oznaczanej w spektrofotometrze Beckman DU 640. Aktywno lipolityczn oznaczano testem dyfuzyjnym [Sztajer i in. 1988] wobec 1% tributyryny (Sigma) i 1% oleju malanego z Victoria blue jako substratów, nanoszc 100 μl preparatu enzymatycznego do studzienek w podou agarowym z odpowiednim substratem i inkubowano w temp. 37ºC. Po 72 godzinach dokonywano pomiaru strefy przejanie wokó studzienek. Poziom aktywnoci lipolitycznej okrelano w oparciu o krzyw standardow sporzdzon dla lipazy z Candida cylindracea (Sigma) o aktywnoci 5390 U mg-1. Pomiary aktywnoci przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a prezentowane wyniki stanowi redni z uzyskanych podczas pomiarów wartoci. OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW Gatunek Y. lipolytica naley do niekonwencjonalnych drody wykazujcych zdolno wzrostu w rodowisku bogatym w hydrofobowe zwizki takie jak alkany, kwasy tuszczowe czy oleje [Spencer i in. 2002]. Izolowane s one m.in. z produktów ywnociowych bogatych w biako i tuszcz, jak np. sery [Wojtatowicz i in. 2001]. Moliwo. wykorzystywania rónych substratów wie si z du zdolnoci tych drody do produkcji zewntrzkomórkowych enzymów proteolitycznych i lipolitycznych, umoliwiajcych im pozyskiwanie niezbdnych skadników odywczych z rónych prekursorów obecnych w rodowisku [Barth, Galibardin 1997, Fickers i in. 2003]. Poszczególne szczepy Y. lipolytica wykazuj jednak due zrónicowanie w rodzaju i iloci syntetyzowanych enzymów, na co wpyw maj równie warunki rodowiska, w którym wystpuj [Kumar, Talagi 1999, Fickers i in. 2003]. Waciwy dobór warunków hodowli oraz skadników podoa hodowlanego jest jednym z najtaszych i najwydajniejszych sposobów stymulacji produkcji enzymów przez mikroorganizmy [Kumar i Talagi 1999]. Potencjalne zastosowanie drody Y. lipolytica w biotechnologii, jako róda enzymów hydrolitycznych, wymaga zatem dokadnego scharakteryzowania warunków ich hodowli, umoliwiajcego optymalny wzrost oraz pozyskiwanie preparatów enzymatycznych o podanej swoistoci. Pochodzce z serów szczepy Y. lipolytica JII1a, JII1b, JII1c, PII6a i PII6b kultywowane na podou YCG (przyjtym jako standardowe) zawierajcym glukoz i kazein,. Biotechnologia 7(4) 2008.

(36) M. Szotysik i in.. 26. jako ródo odpowiednio wgla i azotu, osigay najwyszy wzrost na poziomie 1,5– 2,1 · 108 kom · mL-1 (rys. 1, 2). Wprowadzenie w miejsce glukozy olejów rolinnych spowodowao obnienie poziomu wzrostu badanych szczepów (rys. 1). Jakkolwiek spadek ten by najmniejszy w obecnoci oliwy z oliwek. Populacja szczepu JII1a w obecnoci tego zamiennika glukozy osigna liczebno rzdu 108 kom · mL-1, natomiast plon biomasy pozostaych badanych drody by niszy, w przedziale 5,6–6,02 · 107 kom · mL-1. Dobre efekty przynioso te wprowadzenie oleju kukurydzianego. W hodowli zawierajcej ten substytut glukozy najlepiej rozwija si szczep JII1a, osigajc liczebno 7,08 · 107 kom · mL-1, najsabiej natomiast szczep PII6a (3,98 · 107 kom · mL-1). Wprowadzenie do medium hodowlanego olejów: sonecznikowego, malanego czy rzepakowego skutkowao znaczco sabszym wzrostem badanych drody w porównaniu z podoem YCG. W obecnoci tych róde wgla najwiksz liczebno. 3,97 · 107 kom · mL-1 odnotowano dla szczepów JII1a i JII1c w podou odpowiednio z olejem sonecznikowym i rzepakowym. Najsabszy przyrost populacji osigajcy poziom 1,07 · 107 kom · mL-1 odnotowano natomiast dla szczepów JII1c i JII1b, rosncych na podoach zawierajcych odpowiednio olej sonecznikowy i malany. 8,5. JII1a. log kom·mL-1 – log cells mL-1. JII1b JII1c. 8. PII6a PII6b. 7,5. 7. 6,5. olej rzepakowy rapeseed oil. olej malany butter oil. olej kukurydziany maize oil. olej sonecznikowy sunflower oil. oliwa z oliwek olive oil. YCG. 6. ródo wgla – Carbon source. Rys. 1. Wielko populacji drody Y. lipolytica w hodowlach zawierajcych róne róda wgla Fig. 1. Y. lipolytica yeast population number in cultures containing different carbon source. Acta Sci. Pol..

(37) Produkcja pozakomórkowych hydrolaz .... 27. 8,5. JII1a JII1b JII1c. 8. PII6a. log j.t.c mL -1 – log cfu mL-1. PII6b. 7,5. 7. 6,5. biaka serwatkowe whey proteins. casamino acids. tryptose. soyton. bactopepton. kazeina casein. 6. ródo azotu – Nitrogen source. Rys. 2. Wielko populacji drody Y. lipolytica w hodowlach zawierajcych róne róda azotu Fig. 2. Y. lipolytica yeast population number in cultures containing different nitrogen source. Wymiana kazeiny na inne ródo azotu takie jak bactopepton, soyton, tryptose, casamino acids czy biaka serwatkowe wpywaa na obnienie poziomu wzrostu (rys. 2). Wyjtek stanowi szczep JII1c, który niezalenie od wprowadzonego róda azotu osiga liczebno rzdu 108 kom · mL-1. W przypadku pozostaych szczepów zmiana róda azotu w poywce powodowaa obnienie namnoenia komórek. Stosunkowo najlepszym substytutem kazeiny okaza si bactopepton, w obecnoci którego poziom wzrostu szczepów JII1a i JII1c wynosi odpowiednio 1,12 · 108 i 1,58 · 108 kom · mL-1. Poziom wzrostu pozostaych szczepów na tym podou by niszy rednio o jeden rzd logarytmiczny i zawiera si w granicach od 4,46 · 107 j kom · mL-1 dla szczepu PII6a do 7,07 · 107 kom · mL-1dla szczepu PII6b. W obecnoci pozostaych substytutów kazeiny szczepy JII1a, JII1b, PII6a i PII6b wykazyway znaczco niszy poziom wzrostu. Wród tych hodowli najwysze liczebnoci wynoszce 7,07 · 107 kom · mL-1 i 5,6 · 107 kom · mL-1 odnotowano odpowiednio dla szczepu JII1a rosncego na podou zawierajcym tryptose oraz dla szczepu PII6b rosncego na podou zawierajcym biaka. Biotechnologia 7(4) 2008.

(38) 28. M. Szotysik i in.. serwatkowe. Najsabszy natomiast wzrost badane szczepy Y. lipolytica wykazyway na podou zawierajcym casamino acids. We wszystkich badanych hodowlach drody Y. lipolytica oceniono poziom zewntrzkomórkowej aktywnoci proteolitycznej i lipolitycznej. Wykazano wyrany wpyw skadników podoa hodowlanego na rodzaj i poziom generowanej aktywnoci proteolitycznej, podczas gdy zrónicowanie pomidzy poszczególnymi szczepami w danym podou czsto nie byo znaczce. Aktywno enzymów proteolitycznych oznaczano w pH 3,0 i 7,5 (tab. 1, 2). W przypadku wszystkich badanych szczepów zmiana róda wgla z glukozy na oleje rolinne, szczególnie oliw z oliwek, stymulowaa biosyntez proteinazy serynowej, aktywnej w pH 7,5, natomiast niekorzystnie wpywaa na biosyntez proteinazy aspartylowej, dziaajcej w pH 3,0 (tab. 1). Zwizane jest to prawdopodobnie z regulatorowym wpywem pH na ekspresj proteaz Y. lipolytica [Gloger i in. 1997]. Zastosowanie olejów rolinnych jako róde wgla prowadzio do wyranej alkalizacji rodowiska (pH 7,8), promujc ekspresj proteinazy serynowej (tab. 1). Podobn zaleno pomidzy poziomem syntezy alkalicznej proteinazy przez mikroorganizmy, a stopniem alkalizacji medium hodowlanego obserwowano w wielu innych badaniach [Glazer i Nikaido 1995, Kumar, Talagi 1999]. Take w badaniach Gduli i in. [2002], prowadzonych na szczepach Y. lipolytica izolowanych z gleby i hodowanych na poywkach zawierajcych róne stenie glukozy, wykazano, e podwyszenie stenia tego skadnika prowadzi do obnienia kocowego pH, co stymulowao produkcj proteinazy aspartylowej, hamujc jednoczenie produkcj proteinazy serynowej. Z kolei w hodowlach na podoach o niskim pH wyranie dominowaa aktywno. proteolityczna w pH 3,0 (tab. 2). Najwyszy poziom proteinazy aktywnej w rodowisku kwanym odnotowano w hodowli prowadzonej z dodatkiem biaek serwatkowych. Poziom aktywnoci tego enzymu oznaczony dla szczepu JII1b, PII6a i PII6b przewysza wartoci odnotowane w hodowli prowadzonej na podou YCG i zamyka si w granicach 440–570 UmL-1. Obecno w podou tryptose czy bactopeptonu równie stymulowaa produkcj kwanej proteinazy. Wprowadzenie biaek innych ni kazeina powodowao znaczce obnienie aktywnoci ujawniajcej si w pH 7,5 bd te jej cakowity zanik. Najniszy poziom sekrecji pozakomórkowych proteinaz zarówno serynowej, jak i aspartylowej zaobserwowano w hodowlach, w których wykorzystano atwo dostpne substraty peptonowe takie jak: soyton i casamino acids. Podobny, hamujcy wpyw skadników peptonowych podoa na biosyntez zewntrzkomórkowych proteinaz przez mikroorganizmy obserwowali take inni badacze [Kumar, Talagi 1999, Gdula i in. 2002]. W badanych hodowlach drody oceniono take poziom zewntrzkomórkowej aktywnoci lipolitycznej. Podobnie jak w przypadku enzymów proteolitycznych zauwaono wyrany wpyw skadników podoa hodowlanego na poziom ich biosyntezy. Znacznie wyraniej natomiast widoczne byy rónice pomidzy szczepami Y. lipolytica w ich wraliwoci na skadniki podoa, zwaszcza w przypadku róde wgla. Zaobserwowano take rónice w swoistoci produkowanych lipaz, oznaczanych wobec dwóch substratów: oleju malanego i tributyryny. Stosunkowo najlepszym zamiennikiem glukozy, stymulujcym aktywno lipolityczn, okazaa si oliwa z oliwek (tab. 1). W hodowlach wszystkich szczepów, z wyjtkiem JII1a, odnotowano od kilku do kilkudziesiciu razy wysz ni w hodowli na podou standardowym aktywno lipolityczn wobec oleju malanego. Szczególnie. Acta Sci. Pol..