Medycyna Wet. 2008, 64 (4B) 555
Artyku³ przegl¹dowy Review
W utrzymaniu homeostazy organizmu bardzo istot-n¹ rolê odgrywa regulacja i kontrola aktywnoci enzy-mów proteolitycznych. Proteoliza jest czêci¹ wielu procesów fizjologicznych, np.: transkrypcji, cykli ko-mórkowych, apoptozy, produkcji hormonów, fibryno-lizy, krzepniêcia krwi, aktywacji dope³niacza, migra-cji czy ró¿nicowania komórek. Proteoliza musi byæ zatem precyzyjnie regulowana. Bia³kowe inhibitory enzymów proteolitycznych, obecne w osoczu krwi i innych p³ynach ustrojowych oraz wnêtrzu komórek, zapewniaj¹ sta³¹ ochronê przed niekontrolowanym wzrostem aktywnoci proteolitycznej. Inhibitory pro-teinaz stanowi¹ oko³o 10% bia³ek osocza krwi. S¹ trze-ci¹ co do wielkoci, po albuminach i immunoglobuli-nach, grup¹ bia³ek osocza krwi. Zaburzenia równowagi proteinazainhibitor prowadz¹ do rozregulowania szla-ków biochemicznych i fizjologicznych. Niekontrolo-wana aktywnoæ proteinaz wywo³uje uszkodzenia tka-nek i w konsekwencji prowadzi do stanów patologicz-nych.
Do najliczniejszej i najlepiej scharakteryzowanej klasy specyficznych inhibitorów proteinaz nale¿¹ in-hibitory proteinaz serynowych. Wykazuj¹ one zdolnoæ hamowania proteinaz serynowych (np. trypsyny, chy-motrypsyny), które w miejscu reaktywnym zawieraj¹ serynê. W obrêbie inhibitorów proteinaz serynowych wyró¿nia siê kilka rodzin, ró¿ni¹cych siê miêdzy sob¹ struktur¹, mas¹ cz¹steczkow¹ oraz mechanizmem re-akcji. Najwa¿niejsze z nich to rodziny: Kunitz, Kazal, Bowman-Birk, inter-á-inhibitory oraz serpiny (16). Inhibitory te bior¹ udzia³ w trawieniu, fibrynolizie, apoptozie, aktywacji dope³niacza, koagulacji krwi, an-giogenezie, funkcjonowaniu centralnego uk³adu
ner-wowego oraz modulowaniu odpowiedzi immunolo-gicznej (2, 9, 11, 15).
Plazma nasienia posiada zdolnoæ hamowania pro-teinaz serynowych, w tym trypsyny (18). Aktywnoæ antytrypsynow¹ plazmy nasienia ssaków wi¹¿e siê g³ównie z hamowaniem akrosyny (trypsyno-podobnej proteinazy akrosomu plemników) lub innych proteinaz akrosomu. W plemnikach wiêkszoci ryb doskona³o-kostnych nie wystêpuje akrosom, a co siê z tym wi¹¿e równie¿ akrosyna. Tym niemniej w plazmie nasie-nia ryb stwierdzono wystêpowanie wysokich pozio-mów aktywnoci antytrypsynowej.
Aktywnoæ antytrypsynow¹ (AT) w plazmie nasie-nia ryb wykryto po raz pierwszy w 1994 roku (7). Wykazano, ¿e plazma nasienia pstr¹ga têczowego (On-corhynchus mykiss), siei amerykañskiej (Coregonus clupeaformis) oraz okonia ¿ó³tego (Perca flavescens) posiada zdolnoæ hamowania trypsyny wo³owej i dor-szowej. Nastêpne prace dotycz¹ce analizy porównaw-czej aktywnoci antytrypsynowej kolejnych gatunków ryb: pstr¹ga potokowego (Salmo trutta m. fario), ród-lanego (Salvelinus fontinalis), siei (Coregonus lava-retus), g³owacicy (Hucho hucho), szczupaka (Esox lucius), leszcza (Abramis brama), miêtusa (Lota lota), karpia (Cyprinus carpio), karasia (Carasius auratus), klenia (Leuciscus cephalus), jelca (Leuciscus idus) oraz bolenia (Aspius aspius) potwierdzi³y uniwersalne wy-stêpowanie aktywnoci AT w plazmie nasienia ryb doskona³okostnych oraz gatunkowe uwarunkowanie ich zmiennoci (5).
Aktywnoæ inhibitorów proteinaz serynowych zwi¹-zana jest z cechami jakociowymi nasienia oraz od-zwierciedla sezonowe zmiany jego sk³adu. Aktywnoæ
Inhibitory proteinaz serynowych plazmy nasienia ryb
MARIOLA WOJTCZAK, JOANNA NYNCA, ANDRZEJ CIERESZKOZak³ad Biologii Nasienia Instytutu Rozrodu Zwierz¹t i Badañ ¯ywnoci PAN, ul. Tuwima 10, 10-747 Olsztyn Wojtczak M., Nynca J., Ciereszko A.
Serine proteinase inhibitors of fish seminal plasma
Summary
The seminal plasma of teleost fish contains a species-specific system of proteins with anti-trypsin activity. Serine proteinase inhibitors are one of the main proteins of fish seminal plasma and their electrophoretic pattern is similar to blood plasma. Anti-trypsin activity correlates with protein and sperm concentration. To date one of the proteinase inhibitors of seminal plasma of common carp and rainbow trout has been identified. It belongs to the serpin family and is similar to á1-antiproteinase. A characteristic feature of this inhibitor is the ability to form an irreversible complex with serine proteinases. Serine proteinase inhibitors of fish seminal plasma may participate in the protection of reproductive tissue and spermatozoa from proteolytic attack.
Medycyna Wet. 2008, 64 (4B) 556
antytrypsynowa plazmy nasienia ryb koreluje ze stê-¿eniem bia³ka i koncentracj¹ plemników (3). Poziom aktywnoci AT zale¿y od okresu sezonu rozrodczego (3, 5). Wykazano, ¿e pod koniec sezonu rozrodczego pstr¹ga têczowego oraz siei nastêpuje obni¿enie ak-tywnoci antytrypsynowej w plazmie nasienia równo-leg³e do spadku stê¿enia bia³ka (24).
Stwierdzono istnienie odmiennych, specyficznych dla rodziny profili aktywnoci AT w plazmie nasienia ryb karpiowatych i ³ososiowatych. Plazma nasienia ryb karpiowatych charakteryzuje siê wystêpowaniem wspólnego modelu profilu aktywnoci AT (23). Typo-wy profil inhibitorów ryb karpiowatych sk³ada siê z trzech frakcji (I-III) o aktywnoci antytrypsynowej (ryc. 1). Frakcja I (o wolnym tempie migracji) cha-rakteryzuje siê zró¿nicowanym, zale¿nym od gatunku tempem migracji elektroforetycznej. W przeciwieñ-stwie do tej frakcji, ró¿nice w tempie migracji elek-troforetycznej inhibitorów frakcji II (o porednim tempie migracji) s¹ mniejsze. Podobnie jak dla ryb karpiowatych, w plazmie nasienia ryb ³ososiowatych wykazano istnienie wspólnego profilu aktywnoci AT. Typowy profil aktywnoci AT sk³ada siê z dwóch pasm (frakcja I i III) o wolnym tempie migracji, pasma (frak-cja II) o porednim tempie migracji oraz pasma o szyb-kim tempie migracji (4). Specyficznoæ gatunkowa wyra¿a siê w ró¿nicy tempa migracji poszczególnych pasm aktywnoci AT.
Inhibitory proteinaz serynowych plazmy nasienia ryb wykazuj¹ podobieñstwo obrazu elektroforetycznego oraz chromatograficznego w porównaniu z inhibito-rami osocza krwi (4, 23). Zarówno w plazmie nasie-nia, jak równie¿ w osoczu krwi karpia wykazano obec-noæ inhibitorów frakcji I i II (ryc. 2). Wystêpowanie zwi¹zku pomiêdzy bia³kami krwi i plazmy nasienia pstr¹ga têczowego zosta³o opisane przez Loir i wsp. (13). Badacze ci udowodnili, ¿e wiele bia³ek obecnych
w plazmie nasienia wykazuje takie same w³aciwoci antygenowe, jak bia³ka osocza krwi. Tak¿e Mak i wsp. (14) oraz Wojtczak i wsp. (21) wykazali podobieñstwo pomiêdzy á1-antyproteinaz¹ plazmy nasienia i osocza krwi zarówno pstr¹ga têczowego, jak i karpia. Na pod-stawie tych wyników mo¿na sugerowaæ, ¿e inhibitory frakcji I i II wystêpuj¹ce w plazmie nasienia i osoczu krwi ryb, mog¹ byæ transportowane z krwi do nasie-nia. Mo¿liwe jest tak¿e, ¿e bia³ka te mog¹ byæ czê-ciowo syntetyzowane w uk³adzie rozrodczym oraz czêciowo transportowane z krwi. Skinner i wsp. (17) wykazali, ¿e bia³ka wchodz¹ce w sk³ad plazmy nasie-nia mog¹ pochodziæ z dwóch róde³. Autorzy ocenili, ¿e 10-20% transferyny w p³ynie sieci j¹der u tryka pochodzi z krwi, a pozosta³e 80-90% jest syntetyzo-wane w j¹drach przez komórki Sertoliego. Podobne zale¿noci stwierdzono tak¿e dla transferyny plazmy nasienia karpia (22). Wyjanienie pochodzenia bia³ek plazmy nasienia ryb wymaga dalszych badañ.
Inhibitory frakcji I i II obecne s¹ tak¿e w luzie kar-pia (12). Przypuszczalnie, podobnie jak w przypadku plazmy nasienia, inhibitory te pochodz¹ z krwi. Hjel-meland (10) wykaza³, ¿e inhibitory proteinaz wyizo-lowane ze luzu i surowicy krwi dorsza posiadaj¹ iden-tyczn¹ ruchliwoæ elektroforeiden-tyczn¹, punkt izoelek-tryczny, sk³ad aminokwasowy i masê cz¹steczkow¹. Inhibitory proteinaz obecne w luzie posiadaj¹ zdol-noæ hamowania wzrostu chorobotwórczych wirusów i bakterii (1, 25), najprawdopodobniej poprzez inak-tywacjê proteinaz drobnoustrojów. Analogicznie mo¿-na za³o¿yæ, ¿e podobne w³aciwoci mog¹ mieæ inhi-bitory frakcji I i II obecne w luzie karpia.
Niezale¿nie od wspomnianych podobieñstw inhibi-torów proteinaz serynowych w p³ynach ustrojowych i wydzielinach zwierz¹t istniej¹ tak¿e specyficzne in-hibitory. Nasze badania (12) doprowadzi³y do identy-fikacji unikalnych inhibitorów osocza i plazmy
nasie-1 2 3 4 5 6
Frakcja I Frakcja II
Frakcja III
Ryc. 1. Profile elektroforetyczne aktywnoci antytrypsyno-wej (jasne pasma) w plazmie nasienia wybranych gatunków ryb karpiowatych. 1 leszcz, 2 lin, 3 karp, 4 p³oæ, 5 ja, 6 kleñ
Ryc. 2. Profile elektroforetyczne aktywnoci antytrypsyno-wej plazmy nasienia i osocza krwi karpia. Frakcje I i II wspólne dla plazmy nasienia i osocza krwi, frakcja III spe-cyficzna dla plazmy nasienia, inhibitor wysokocz¹steczkowy specyficzny dla osocza krwi
Plazma
nasienia Osoczekrwi
Frakcja I Frakcja II Frakcja III Frakcja I Frakcja II Inhibitor wysokocz¹steczkowy
Medycyna Wet. 2008, 64 (4B) 557
nia karpia (ryc. 2). W osoczu krwi wystêpuje dodatko-wy inhibitor o wolnym tempie migracji (dodatko-wysokocz¹- (wysokocz¹-steczkowy inhibitor), za w plazmie nasienia unikal-ny inhibitor o szybkim tempie migracji (niskocz¹stecz-kowy inhibitor, frakcja III). Uzyskane informacje umo¿liwiaj¹ okrelenie zwi¹zków pomiêdzy inhibito-rami nasienia, krwi i luzu oraz wykorzystanie inhibi-torów proteinaz serynowych do oceny stopnia zanie-czyszczenia nasienia przez luz i krew.
Prace izolacyjne doprowadzi³y do pog³êbionej cha-rakterystyki inhibitorów frakcji II plazmy nasienia pstr¹ga têczowego i karpia. Masa cz¹steczkowa (55--56 kDa) tych inhibitorów, ich glikoproteinowa budo-wa oraz zabudo-wartoæ reszty cukrowej (11-12%) zawie-raj¹ siê w zakresie charakterystycznym dla serpin (se-rine proteinase inhibitor), co porednio wskazuje na ich przynale¿noæ do tej rodziny. Otrzymane sekwen-cje aminokwasowe, a tak¿e wykazanie zdolnoci do tworzenia trwa³ych kompleksów inhibitorów frakcji II z proteinazami serynowymi ostatecznie potwierdzi-³o ich przynale¿noæ do rodziny serpin typu á1-anty-trypsyny (14, 21). Ponadto uzyskano sekwencjê cDNA inhibitora frakcji II plazmy nasienia pstr¹ga têczowe-go. Analiza tej sekwencji wykaza³a obecnoæ domeny konserwatywnej dla serpin oraz wysok¹ homologiê do á1-antytrypsyny krwi karpia i ssaków (14).
Serpiny w przeciwieñstwie do innych rodzin prote-inaz serynowych charakteryzuj¹ siê nieodwracalnym mechanizmem reakcji, polegaj¹cym na tworzeniu trwa-³ych, niedysocjujacych kompleksów z proteinazami serynowymi (ryc. 3). Procesowi temu towarzyszy zmia-na konformacji serpiny, w wyniku czego traci ozmia-na zdol-noæ hamowania kolejnych proteinaz. Najwiêksz¹ gru-pê serpin stanowi¹ serpiny podobne do á1 -antytrypsy-ny (19). G³ówn¹ funkcj¹ serpin jest kontrola wewn¹trz-i zewn¹trzkomórkowych szlaków proteolwewn¹trz-itycznych, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patolo-gicznych. Serpiny reguluj¹ aktywnoæ proteinaz w wie-lu procesach fizjologicznych, m.in. w krzepniêciu krwi,
fibrynolizie, aktywacji dope³niacza, spermatogenezie, angiogenezie, przebudowie tkanek oraz apoptozie (15). Oprócz kontroli aktywnoci w³asnych enzymów pro-teolitycznych organizmu, s¹ pierwsz¹ lini¹ obrony przed atakiem organizmów patogennych, wchodz¹c w sk³ad nieswoistego mechanizmu obronnego typu hu-moralnego.
Analiza kinetyczna wykaza³a, ¿e serpiny plazmy na-sienia karpia i pstr¹ga têczowego s¹ efektywnymi in-hibitorami proteinaz podobnych do elastazy, trypsyny i chymotrypsyny. Elastaza okaza³a siê enzymem najsku-teczniej hamowanym przez á1-antytrypsynê plazmy na-sienia karpia (sta³a asocjacji, Kon = 8,3 × 107 M1 s1;
21). Uzyskane wyniki s¹ zgodne z w³aciwociami á1-antytrypsyny ssaków, dla których elastaza jest g³ów-nym enzymem docelowym. Uwa¿a siê, ¿e biologicz-na funkcja á1-antytrypsyny u cz³owieka zwi¹zana jest z kontrol¹ elastazy leukocytów. Ostatnie badania wy-kaza³y obecnoæ leukocytów w nasieniu pstr¹ga têczo-wego (6, 20). Mo¿na zatem wnioskowaæ, ¿e elastaza leukocytów jest docelow¹ proteinaz¹ hamowan¹ przez inhibitory frakcji II plazmy nasienia karpia. W prze-ciwieñstwie do karpia, inhibitor plazmy nasienia pstr¹ga têczowego charakteryzowa³ siê ni¿sz¹ aktywnoci¹ inhi-bitorow¹ w stosunku do elastazy (Kon = 1 × 105 M1 s1;
14). Dane te wiadcz¹ o ró¿nicach gatunkowych w specyficznoci serpin plazmy nasienia ryb.
Dotychczas niewiele wiadomo na temat charakte-rystyki inhibitorów frakcji I i III. Inhibitory frakcji I nale¿¹ do wysokocz¹steczkowych inhibitorów prote-inaz serynowych o budowie glikoproteinowej, charak-teryzuj¹cych siê bardzo wysok¹ zawartoci¹ kompo-nenty wêglowodanowej (27-29%). Ponadto nie maj¹ one zdolnoci tworzenia trwa³ych kompleksów, co wyklucza ich przynale¿noæ do rodziny serpin (Wojt-czak i wsp., dane niepublikowane). Oprócz wysoko-cz¹steczkowych inhibitorów w plazmie nasienia ryb wystêpuj¹ inhibitory niskocz¹steczkowe (frakcja III). Przysz³e badania powinny doprowadziæ do
identyfi-Ryc. 3. Tworzenie kompleksów serpinaproteinaza serynowa. A) Schemat reakcji serpiny typu á1-inhibitor trypsyny z pro-teinaz¹ /http://www.nature.com/nature /journal/v407/n6806/fig_tab/407 923a0_F1.html/; B) Obraz elektroforetyczny (SDS--PAGE): 1 serpina z plazmy nasienia karpia, 2 elastaza, 3 kompleks serpina + elastaza, 4 standardy mas cz¹steczkowych
SERPINA PROTEINAZA KOMPLEKS SERPINA + PROTEINAZA (A) (B) 1 2 3 4 94,0 67,0 43,0 30,0 20,1 14,4 kDa
Medycyna Wet. 2008, 64 (4B) 558
kacji inhibitorów frakcji I i III. Takie badania s¹ obec-nie prowadzone w naszym laboratorium.
Inhibitory proteinaz serynowych stanowi¹ jedne z g³ównych bia³ek plazmy nasienia ryb. Ich funkcje nie zosta³y poznane. Uwa¿a siê, ¿e pe³ni¹ funkcje ochronne, zabezpieczaj¹c plemniki przed atakiem pro-teolitycznym i przedwczesn¹ aktywacj¹ (4, 8, 14). Ochrona plemników przed proteinazami jest szczegól-nie wa¿na w warunkach rozrodu sezonowego, gdzie plemniki produkowane s¹ przed okresem tar³a, a na-stêpnie przechowywane w nasieniowodach. Obecny w plazmie nasienia ryb system inhibitorów proteinaz serynowych najprawdopodobniej uczestniczy w zabez-pieczeniu prawid³owego funkcjonowania uk³adu roz-rodczego, w szczególnoci w zakresie ochrony jako-ci plemników do momentu tar³a. Potencjalne prote-inazy hamowane przez inhibitory plazmy nasienia ryb mog¹ pochodziæ z plazmy nasienia, uszkodzonych plemników (12) oraz, jak wspomniano wczeniej, z leukocytów, wystêpuj¹cych w nasieniu ryb (6). Przy-puszcza siê, ¿e inhibitory mog¹ uczestniczyæ w prze-budowie struktur tkanek uk³adu rozrodczego oraz w regulacji spermatogenezy (6, 21). Okrelenie w³a-ciwoci inhibitorów proteinaz plazmy nasienia jest nie-zbêdne w celu zrozumienia fizjologicznych podstaw funkcjonowania mêskiego uk³adu rozrodczego ryb oraz wykorzystania tej wiedzy do doskonalenia skutecz-noci biotechnik stosowanych w kontroli rozrodu ryb.
Pimiennictwo
1.Björck L., Åkesson P., Bohus M., Trojnar J., Abrahamson M., Olafsson I., Grubb A.: Bacterial growth blocked by a synthetic peptide based on the struc-ture of a human proteinase inhibitor. Nastruc-ture 1989, 337, 385-386.
2.Bode W., Huber R.: Structural basis of the endoproteinase-protein inhibitor interaction. Biochim. Biophys. Acta 2000, 1477, 241-252.
3.Ciereszko A., Liu L., Dabrowski K.: Effects of season and dietary ascorbic acid on some biochemical characteristics of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) semen. Fish Physiol. Biochem. 1996, 15, 1-10.
4.Ciereszko A., Kwasnik M., Dabrowski K., Piros B., Glogowski J.: Chromato-graphic separation of trypsin-inhibitory activity of rainbow trout blood and seminal plasma. Fish Shellfish Immunol. 2000, 10, 91-94.
5.Ciereszko A., Piros B., Dabrowski K., Kucharczyk D., £uczyñski M. J., Dobosz S., Glogowski J.: Serine proteinase inhibitors of seminal plasma of teleost fish: distribution of activity, electrophoretic profiles and relation to proteinase inhibitors of blood. J. Fish Biol. 1998, 53, 1292-1305. 6.Ciereszko A., W³asow T., Dobosz S., Goryczko K., Glogowski J.: Blood cells
in rainbow trout Oncorhynchus mykiss milt: relation to milt collection method and sampling period. Theriogenology 2004, 62, 1353-1364. 7.Dabrowski K., Ciereszko A.: Proteinase inhibitor(s) in seminal plasma of
teleost fish. J. Fish Biol. 1994, 45, 801-809.
8.Ellis A. E.: Immunity to bacteria in fish. Fish Shellfish Immunol. 1999, 9, 291-308.
9.Hibbetts K., Hines B., Williams D.: An overview proteinase inhibitors. J. Vet. Intern. Med. 1999, 13, 302-308.
10.Hjelmeland K.: Proteinase inhibitors in the muscle and serum of cod (Gadus morhua). Isolation and characterization. Comp. Biochem. Phys. 1983, 80, 954-999.
11.Irving J. A., Pike R. N., Lesk A. M., Whisstock J. C.: Phylogeny of the serpin superfamily: implications of patterns of amino acid conservation for structu-re and function. Genome Res. 2000, 10, 1845-1864.
12.Kowalski R., Wojtczak M., Glogowski J., Ciereszko A.: Gelatinolytic and anti--trypsin activities in seminal plasma of common carp: relationship to blood, skin mucus and spermatozoa. Aquat. Living Resour. 2003, 16, 438-444. 13.Loir M., Labbe C., Maisse G., Pinson A., Boulard G., Mourot B.,
Cham-beyron F.: Proteins of seminal fluid and spermatozoa of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Partial characterization and variations. Fish Physiol. Biochem. 1990, 8, 485-495.
14.Mak M., Mak P., Olczak M., Szalewicz A., Glogowski J., Dubin A., Watorek W., Ciereszko A.: Isolation, characterization, and cDNA sequencing of alpha-1-antiproteinase-like protein from rainbow trout seminal plasma. Biochim. Biophys. Acta 2004, 1671, 93-105.
15.Potempa J., Korzus E., Travis J.: The serpin superfamily of proteinase inhibitors: structure, function and regulation. J. Biol. Chem. 1994, 269, 15957--15960.
16.Roberts R. M., Mathialagan N., Duffy J. Y., Smith G. W.: Regulation and regulatory role of proteinase inhibitors. Crit. Rev. Eucar. Gene 1995, 5, 385--436.
17.Skinner M. K., Dean L., Karmally K., Fritz I. B.: Rete testis fluid (RTF) proteins: purification and characterization of RTF albumin. Biol. Reprod. 1987, 37, 135-146.
18.Strze¿ek J., Torska J.: Akrosyna plemników i jej inhibitory w³aciwoci biochemiczne oraz funkcja w procesach rozrodu zwierz¹t. Post. Biol. Kom. 1985, 12, 263-288.
19.Van Gent D., Sharp P., Morgan K., Kalsheker N.: Serpins: structure, func-tion and molecular evolufunc-tion. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2003, 35, 1536--1547.
20.W³asow T., Glogowski J., Ciereszko A.: Presence of blood cells in rainbow trout milt. Pol. Arch. Fish. 1999, 7, 359-364.
21.Wojtczak M., Ca³ka J., Glogowski J., Ciereszko A.: Isolation and characte-rization of á1-proteinase inhibitor from cammon carp (Cyprinus carpio) seminal plasma. Comp. Biochem. Physiol. 2007, 148, 264-276.
22.Wojtczak M., Dietrich G. J., Irnazarow I., Jurecka P., S³owiñska M., Cie-reszko A.: Polymorphism of transferrin of carp seminal plasma: Relationship to blood transferrin and sperm motility characteristics. Comp. Biochem. Physiol. 2007 (w druku).
23.Wojtczak M., Glogowski J., Koldras M., Kucharczyk D., Ciereszko A.: Characterization of protease inhibitors of seminal plasma of cyprinids. Aquat. Living Resour. 2003, 16, 461-465.
24.Wojtczak M., Kumiñski H., Dobosz S., Miko³ajczyk T., Dietrich G. J, Kowalski R., Kot³owska M., Enright W. J., Ciereszko A.: Milt characteristics in European whitefish (Coregonus lavaretus) in relation to season and hormonal stimulation with a gonadotrophin-releasing hormone analogue, azagly-nafarelin. Archiv Hydrobiol. 2007, 60, 171-185.
25.Ylönen A., Rinne A., Herttuainen J., Bøgwald J., Järvinen M., Kalkkinen N.: Atlantic salmon (Salmo salar L.) skin contains a novel kininogen and another cysteine proteinase inhibitor. Eur. J. Biochem. 1999, 266, 1066-1072. Adres autora: dr Mariola Wojtczak, ul. Tuwima 10, 10-747 Olsztyn; e-mail: mario@pan.olsztyn.pl
