Medycyna Wet. 2006, 62 (2) 204
Praca oryginalna Original paper
Granulocyty obojêtnoch³onne jako komórki fagocytuj¹-ce odgrywaj¹ kluczow¹ rolê w nieswoistej odpowiedzi immunologicznej, stanowi¹c w miejscu zapalenia pierw-sz¹ liniê obrony przed bakteriami, grzybami, paso¿ytami i komórkami nowotworowymi (20). W wyniku aktywacji neutrofila przez czynniki chemotaktyczne, niektóre cyto-kiny oraz sk³adowe dope³niacza dochodzi do wyst¹pienia zjawiska tzw. wybuchu oddechowego (respiratory burst), zwi¹zanego z kilkudziesiêciokrotnym wzrostem zapotrze-bowania komórki na tlen. Proces ten zwi¹zany jest z m.in. przestawieniem metabolizmu komórkowego na utlenianie glukozy w cyklu pentozowym oraz aktywacjê b³onowego kompleksu enzymatycznego oksydazy NADPH (fosfo-ran dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego), który ka-talizuje redukcjê tlenu do anionorodnika ponadtlenkowe-go O2 (20). Rodnik ten jest substratem w wielu reak-cjach biochemicznych, prowadz¹cych do powstania innych reaktywnych pochodnych form tlenu (RFT), np.: nadtlen-ku wodoru H2O2, rodnika hydroksylowego OH, tlenu singletowego 1O
2 oraz kwasu podchlorawego HOCl (11, 12, 21). Zwi¹zki lub atomy posiadaj¹ce na swym orbitalu niesparowane elektrony, przechodz¹c samoistnie ze stanu elektronowego wzbudzenia do stanu podstawowego, emi-tuj¹ kwanty wiat³a o energii równej ró¿nicy miêdzy tymi stanami (16). Powsta³e w ten sposób zjawisko chemilumi-nescencji (CL) pozwala oceniæ metabolizm tlenowy gra-nulocytów obojêtnoch³onnych oraz porednio ich aktyw-noæ fagocytarn¹ (22). W celu zarejestrowania metaboliz-mu tlenowego neutrofilów konieczne jest jednak wzmoc-nienie emisji powsta³ego wiat³a przez dodanie zwi¹zków chemicznych o du¿ej wydajnoci kwantowej, tzw. sond che-miluminescencyjnych. Jednym z nich jest luminol (5-ami-no-2,3-dihydroftalazyno-1,4-dion), który powoduj¹c niemal
1000-krotny wzrost sygna³u, umo¿liwia badanie CL zarów-no metod¹ zewn¹trz-, jak i wewn¹trzkomórkow¹ (16, 22). Nieliczne prace u koni dotyczy³y wp³ywu lipopolisacha-rydów (2, 3, 7), histaminy (4) oraz stresu wysi³kowego (6, 13, 18, 23) na aktywnoæ procesów wolnorodnikowych tych komórek.
Celem przeprowadzonych badañ by³a ocena spontanicz-nej i stymulowaspontanicz-nej aktywnoci metaboliczspontanicz-nej neutrofilów krwi obwodowej mierzona testem chemiluminescencji u klinicznie zdrowych koni.
Materia³ i metody
Badania przeprowadzono na 33 klinicznie zdrowych, hodow-lanych koniach szlachetnej pó³krwi (24 klacze, 4 ogiery i 5 wa³achów) w wieku od 3 do 15 lat (rednia: 6,24 ± 2,86 lat). Krew do badañ pobierano z ¿y³y szyjnej zewnêtrznej (zawsze w godzinach rannych) przy u¿yciu zamkniêtego systemu Vacu-tiner: 9 ml do probówki zawieraj¹cej heparynê litow¹ oraz 4 ml do probówki z wersenianem dwupotasowym.
Ocenê aktywnoci czynnociowej granulocytów obojêtno-ch³onnych przeprowadzono w 150 µl krwi heparynowej (w cza-sie maksymalnie 3-4 godz. od jej pobrania) metod¹ chemilumi-nescencji wzmacnianej luminolem rozpuszczonym w 0,4 % NaOH do stê¿enia 28 µmol/l. Badania wykonano przy u¿yciu aparatu Luminometr BioOrbit 1251 (Pharmacia LKB, Turku, Finland), umo¿liwiaj¹cym sekwencyjny pomiar 25 prób jedno-czenie. Oznaczenia prowadzono metod¹ kinetyczn¹ przez 40 minut w temperaturze 38,0 ± 0,1°C, dokonuj¹c pomiaru che-miluminescencji (CL) w odstêpach 5 minutowych. W celu uzys-kania wiêkszej dok³adnoci, wszystkie pomiary powtarzano trzy-krotnie podczas jednoczesnego badania i obliczano redni¹ aryt-metyczn¹.
Wyniki przedstawiono jako: wartoci integracji CL (A-Int.), czyli pole powierzchni pod krzyw¹ emisji w funkcji czasu
Wp³yw wybranych stymulatorów na
chemiluminescencjê neutrofilów krwi obwodowej koni
WIES£AW KRUMRYCH, EUGENIUSZ WINIEWSKI
Zak³ad Chorób Koni, Pañstwowy Instytut Weterynaryjny Pañstwowy Instytut Badawczy w Pu³awach, Oddzia³ w Bydgoszczy, Al. Powstañców Wlkp. 10, 85-090 Bydgoszcz
Krumrych W.
Influence of selected stimulators on chemiluminescence of peripheral blood neutrophils in horses
Summary
The purpose of the study was to assess the condition of peripheral blood neutrophiles in horses through using the luminal-enhanced chemiluminescence (CL) method. The study population consisted of 33 clinically healthy horses of both sexes (aged 315 years). The chemiluminescence of non-stimulated neutrophiles was measured as well as of those stimulated by a receptor stimulus - myosin (Z), opsonic zymosan (OZ) and formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) and an extrareceptor stimulus - phorbol myristate acete (PMA). The results of the study demonstrated that the chemiluminescence of neutrophiles stimulated by Z and OZ was considerably higher in comparison to the values of CL stimulated by fMLP and PMA. The use of stimulators can trigger a respiratory burst and may be helpful in assessing the phagocyte activity of equine neutrophiles.
Medycyna Wet. 2006, 62 (2) 205
mierzonej przez 40 minut (w mV/40 min.); war-toci maksymalne CL (H-Int.) krzywej chemilumi-nescencji (w mV) oraz czas osi¹gniêcia maksymal-nej wartoci chemiluminescencji t (H-Int.max.) w min.
W pobranych próbach krwi oceniano luminolo-zale¿n¹ chemiluminescencjê spontaniczn¹ (bez sty-mulacji) oraz stymulowan¹ zajêciem receptora dla fragmentu Fc przeciwcia³a i dope³niacza, recep-tora chemotaktycznego, a tak¿e drog¹ pozarecep-torow¹. Zastosowano nastêpuj¹ce stymulatory CL: zymosan (Z) 100 mg zymosanu zawieszano w 10 ml roztworu PBS i rozcieñczano 10-krotnie); opsonizowany zymosan (OZ) 100 mg zymosanu zawieszano w mieszaninie roztworu PBS (10 ml) i zbiorczego osocza koñskiego (10 ml); N-formy-lo-metionylo-leucylo-fenyloalaninê (fMLP) 5 mg fMLP rozpuszczano w 4,56 ml dimetylosulfo-tlen-ku (DMSO) i rozcieñczano w roztworze PBS do stê¿enia 2 × 106 mol/l oraz octan mirystynianu forbolu (PMA) 5 mg PMA rozpuszczano w 5 ml 95% etanolu, a nastêpnie rozcieñczano w roztwo-rze PBS do stê¿enia 0,32 µmol/l).
Oceniana próbka zawiera³a: 150 µl pe³nej krwi heparynowej, 100 µl roztworu luminolu (5-amino--2,3-dihydroftalazyno-1,4-dion) oraz 200 µl tworu PBS lub 100 µl roztworu PBS + 100 µl roz-tworu stymulatora. Badania rozpoczynano bez-porednio po dodaniu krwi do wczeniej przygoto-wanych odczynników.
W krwi wersenianowej oznaczono, przy u¿yciu analizatora hematologicznego Sysmex F800 (TOA Medical Electronics Co., Ltd, Kobe, Japan), stê¿enie hemoglobiny (Hb), liczbê krwinek bia³ych (WBC) oraz procentowy udzia³ nautrofilów (PMN). Wartoci tych wskaników pos³u¿y³y do skorygowania zmie-rzonych wartoci CL i odniesienia ich do 1000 granulocytów obojêtnoch³onnych, co pozwoli³o na eliminacjê wp³ywu zró¿-nicowanej liczby neutrofilów w poszczególnych próbach, a tym samym na wiêksz¹ optymalizacjê wyników. Do optymalizacji zarejestrowanych wyników wykorzystano wzór:
CL zmierzona (mV × min.) × Hb (%) CL obliczona =
[WBC (× 103/µl) × PMN (%) × 150 (µl)] : 100 w którym Hb to zawartoæ hemoglobiny wyra¿ona w % (w sto-sunku do redniej wartoci obliczonej dla badanej grupy koni), WBC bezwzglêdna liczba krwinek bia³ych, PMN procento-wy udzia³ granulocytów obojêtnoch³onnych w obrazie bia³o-krwinkowym oraz 150 (µl) objêtoæ próby krwi.
Uzyskane wyniki przedstawiono w postaci redniej arytme-tycznej (x) i odchylenia standardowego (sd).
Wyniki i omówienie
Wyniki badañ aktywnoci metabolicznej granulocytów obojêtnoch³onnych krwi obwodowej koni zamieszczono w tabeli, natomiast przyk³adowy przebieg krzywych che-miluminescencji spontanicznej i stymulowanej neutrofilów krwi obwodowej konia (przed skorygowaniem wyników do 1000 komórek) przedstawiono na rycinie.
Spontaniczna chemiluminescencja neutrofilów (bez u¿y-cia stymulatora) charakteryzowa³a siê stosunkowo niewiel-k¹ emisj¹ wiat³a. Fakt ten, wskazuj¹cy na spoczynkow¹ aktywnoæ metaboliczn¹ komórek, dobrze koreluje ze sta-nem zdrowia badanych zwierz¹t i jest zgodny z obserwa-cjami innych autorów (14, 15). Przebieg krzywej CL by³ zbli¿ony do linii prostej, co uniemo¿liwia³o wyznaczenie czasu osi¹gniêcia wartoci maksymalnej.
Analiza wybuchu oddechowego badanych komórek aktywowanych ró¿nymi stymulatorami wykaza³a najwiêk-sz¹ efektywnoæ zymosanu, przy czym wczeniejsza opso-nizacja powodowa³a znaczne przyspieszenie ich aktywa-cji. Zastosowanie tego stymulatora indukowa³o rednio ponad 5-krotnie wiêksz¹ emisjê wiat³a w porównaniu z CL komórek spoczynkowych. Z kolei stymulacja meta-bolizmu tlenowego neutrofilów przy u¿yciu fMLP oraz PMA powodowa³a rednio oko³o dwukrotny wzrost che-miluminescencji w odniesieniu do CL komórek spoczyn-kowych. W przypadku obu stymulatorów szczytow¹ ak-tywnoæ granulocytów zarejestrowano po up³ywie oko³o 20 minut. Uzyskane wyniki s¹ zbli¿one do rezultatów uzys-kiwanych u ludzi, aczkolwiek najszybsz¹ indukcjê wybu-chu oddechowego obserwowano u nich po stymulacji
a k s w e n o z c a n z O inik ). t n I-A ( L C ). n i m 0 4 / V m ( CL((mHVI-)nt). t(H(I-mni.tnm).ax). ij c a l u m y t s z e B 499,56±294,28 0,32±0,21 y t y ¿ U r o t a l u m y t s Z 2711,16±1147,43 1,78±0,75 12,71±2,77 Z O 2627,51±1126,52 2,47±1,05 14,79±1,83 P L M f 775,59±448,83 0,46±0,29 21,09±7,22 A M P 964,19±657,86 0,57±0,42 23,82±6,53
Objanienie: x rednia arytmetyczna; sd odchylenie standar-dowe; CL (A-Int.) pole powierzchni pod krzyw¹ emisji w funk-cji czasu (40 min.); CL (H-Int.) maksymalna wartoæ krzywej chemiluminescencji; t (H-Int.max.) czas osi¹gniêcia wartoci maksymalnej; Z zymosan, OZ opsonizowany zymosan, fMLP N-formylo-metionylo-leucylo-fenyloalanina, PMA octan mi-rystynianu forbolu
Tab. 1. rednie wartoci (x ± sd) wskaników chemilumine-scencji spontanicznej i stymulowanej u 33 klinicznie zdrowych koni 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 5 10 15 20 25 30 35 40 t (min.) mV BS Z OZ fMLP PMA
Ryc. 1. Przebieg krzywych chemiluminescencji spontanicznej (BS) i sty-mulowanej (Z, OZ, fMLP, PMA) neutrofilów krwi obwodowej konia (przed skorygowaniem wyników do 1000 komórek)
Objanienie: BS bez stymulacji, Z zymosan, OZ opsonizowany zymosan, fMLP N-formylo-metionylo-leucylo-fenyloalanina, PMA octan mirystynia-nu forbolu
Medycyna Wet. 2006, 62 (2) 206
fMLP (9, 15). Zarejestrowana w badaniach w³asnych mak-symalna CL po u¿yciu fMLP wyst¹pi³a z wiêkszym opó-nieniem. Wydaje siê, ¿e mo¿e byæ to spowodowane rela-tywnie nisk¹ ekspresj¹ receptorów dla tego stymulatora, co t³umaczy³oby niewielk¹ wartoæ uzyskanej CL i stosun-kowo d³ugi czas do wyst¹pienia maksymalnej emisji wiat-³a. Potwierdzaj¹ to badania innych autorów, których zda-niem fMLP jest relatywnie s³abym czynnikiem aktywizu-j¹cym koñskie neutrofile do uwalniania reaktywnych form tlenu (5).
Dzia³anie zymosanu (uzyskiwanego ze ciany komórko-wej dro¿d¿y) polega na stymulowaniu komórek (po uprzed-niej opsonizacji endo- lub egzogennej) do fagocytozy oraz wybuchu oddechowego poprzez wi¹zanie siê z recepto-rami powierzchniowymi dla fragmentów Fc przeciwcia³a lub sk³adników dope³niacza. Innym stymulatorem recepto-rowozale¿nym jest fMLP syntetyczna komponenta cia-ny komórkowej bakterii Gram-ujemcia-nych. Dzia³anie tego peptydu polega na wzbudzeniu metabolizmu tlenowego neutrofilów poprzez jego reakcjê ze swoistymi, charakte-rystycznymi dla niego receptorami obecnymi na powierzch-ni badanych komórek. Z kolei u¿ycie PMA pozwala akty-wowaæ wybuch oddechowy poprzez fosforylacjê sk³a-dowych cytoplazmatycznych oksydazy NADPH z pomi-niêciem transdukcji sygna³u na poziomie receptoroksy-daza NADPH.
W dostêpnym pimiennictwie niewiele jest prac uwzglêd-niaj¹cych generacjê produkcji RFT u koni. Porównanie uzyskanych wyników z rezultatami badañ innych autorów jest bardzo trudne z uwagi na wykorzystywanie w bada-niach ró¿nego sprzêtu oraz przedstawianie wyników w in-nych jednostkach (RLU, cpm, mV/s). Niektórzy z nich u¿y-wali tylko jednego stymulatora lub oceniali wartoæ CL komórek spoczynkowych (1, 6, 13, 18, 23). Tymczasem na uzyskiwane wyniki wp³ywa wiele czynników pozaustrojo-wych, wród których wymienia siê m.in. czas i warunki przetrzymywania krwi przed badaniem, stê¿enie luminolu oraz dodawanych stymulatorów, a tak¿e czas pomiaru i tem-peraturê, w której przeprowadzano oznaczenia (1). W nie-których badaniach oceniano metabolizm tlenowy izolowa-nych neutrofilów (1, 10, 23). Zdaniem m.in. Dahlgrena i Karlssona (8), wirowanie krwi stwarza du¿e prawdopo-dobieñstwo dodatkowej aktywacji komórek. Stwierdzono, ¿e tego typu manipulacje mog¹ spowodowaæ nawet 10-krot-ny wzrost metabolizmu tlenowego neutrofilów (17). Wy-daje siê zatem, ¿e ocena zjawiska CL krwi pe³nej pozwala na uzyskiwanie bardziej obiektywnych wyników. Przyjmuje siê, ¿e ca³kowita chemiluminescencja krwi obwodowej jest to¿sama z wytwarzaniem RFT przez neutrofile, poniewa¿ stanowi¹ one dominuj¹c¹ populacjê komórek fagocytuj¹-cych krwi obwodowej (11, 14).
Pomiar CL neutrofilów stanowi stosunkowo szybk¹ i powtarzaln¹ metodê oceny ich aktywnoci metabolicz-nej. W porównaniu z powszechnie stosowanym testem re-dukcji NBT (b³êkit nitrotetrazoliowy) do formazanu, test CL jest bardziej obiektywny i dostarcza wiêcej informacji. Wykorzystanie odpowiedniego zestawu stymulatorów w omawianej metodzie umo¿liwia badanie patomechaniz-mów wrodzonych lub nabytych defektów receptorów po-wierzchniowych oraz enzymów wewn¹trzkomórkowych, jak np. niedobory dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G-6-P), mieloperoksydazy (MPO), defekty oksydazy NADPH (20), a tak¿e ocenê wp³ywu leków i preparatów
wspomagaj¹cych aktywnoæ metaboliczn¹ granulocytów obojêtnoch³onnych (11, 19).
Wyniki przedstawione w niniejszej pracy wykaza³y przy-datnoæ metody chemiluminescencji do oceny sprawnoci czynnociowej neutrofilów krwi obwodowej ró¿nymi dro-gami ich aktywacji u klinicznie zdrowych koni. Wydaje siê, ¿e mog¹ one stanowiæ punkt wyjcia do dalszych ba-dañ w zakresie ewentualnego wp³ywu wielu czynników endo- i egzogennych (np. ci¹¿a, laktacja, wysi³ek fizyczny, stosowane leki i preparaty) oraz ró¿nych stanów patolo-gicznych na metabolizm tlenowy tych komórek u konia.
Pimiennictwo
1.Benbarek H., Deby-Dupont G., Deby C., Cauron I., Mathy-Hartert M., Lamy M.: Experimental model for the study by chemiluminescence of the activation of isolated equine leucocytes. Res. Vet. Sci. 1996, 61, 59-64.
2.Benbarek H., Deby-Dupont G., Caudron I., Deby C., Lamy M., Serteyn D.: Failure of lipopolysaccharides to directly trigger the chemiluminescence response of isolated equine polymorphonuclear leukocytes. Vet. Res. Commun. 1997, 21, 477-482.
3.Benbarek H., Deby-Dupont G., Caudron I., Grulke S., Deby C., Lamy M., Serteyn D.: Interactions between lipopolysaccharides and blood factors on the stimulation of equine polymorphonuclear neutrophils. Vet. Immunol. Immuno-pathol. 1998, 31, 313-322.
4.Benbarek H., Mouithys-Mickalad A., Deby-Dupont G., Deby C., Grulke S., Nemmar A., Lamy M., Serteyn D.: High concentrations of histamine stimulate equine polymorphonuclear neutrophils to produce reactive oxygen species. Inflamm. Res. 1999, 48, 594-601.
5.Brazil T. J., Rossi A. G., Haslett C., McGorum B., Dixon P. M., Chilvers E. R.: Priming induces functional of N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine recep-tors in equine neutrophils. J. Leukoc. Biol. 1998, 63, 380-388.
6.Buschmann H., Baumann M.: Alterations of cellular immune response during intensive training of event horses. J. Vet. Med. B 1991, 38, 90-94.
7.Dagleish M. R., Brazil T. J., Saudamore C. L.: Potentiation of the extracellular release of equine neutrophil elastase and alpha-1-proteinase inhibitor by a com-bination of two bacterial cell wall components: fMLP and LPS. Equine vet. J. 2003, 35, 35-39.
8.Dahlgren C., Karlsson A.: Respiratory burst in human neutrophils. J. Immunol. Met. 1999, 232, 3-14.
9.Jakubczak B., Popko K., Górska E., Modzelewska M.: Kinetyka i efektywnoæ wybuchu tlenowego w granulocytach krwi obwodowej w zale¿noci od stoso-wanego stymulatora. Nowiny Lek. 2001, 70, supl. III, 84-85.
10.Janiszewska-Drobiñska B., Kowalski J., Kaczmarek P., B³aszczyk J., Baj Z., Cieæwierz J.: Wytwarzanie reaktywnych form tlenu przez neutrofile krwi obwo-dowej chorych na grulicê p³uc. Pol. Merk. Lek. 2001, 11, 305-309. 11.Jurczak W. J., Skotnicki A. B., Zgliczyñski M. J., Kwasnowska E.:
Chemilumi-nescencja granulocytów. Przegl. Lek. 1993, 50, 53-58.
12.Konopka T., Ziêtek M.: Wspó³czesne pogl¹dy na rolê zaburzeñ czynnociowych granulocytów obojêtnoch³onnych w etiopategenezie zapaleñ przyzêbia. Dent. Med. Prob. 2002, 39, 117-126.
13.Korhonen P. A. S., Lilius E. M., Hyyppa S., Räsänen L. A., Pösö A. R.: Produc-tion of reactive oxygen species In neutrophils after repeated bouts of exercise in Standardbred trotters. J. Vet. Med. A 2000, 47, 565-573.
14.Lewandowicz-Uszyñska A.: Wp³yw wybranych stymulatorów na chemilumine-scencjê neutrofilów w pe³nej krwi u dzieci chorych na astmê oskrzelow¹. Pol. Merk. Lek. 2003, 14, 393-396.
15.Lewkowicz N., Kurnatowska A., Lewkowicz P., Banasik M., Tchórzewski H.: Rola neutrofili krwi obwodowej w patogenezie aft nawrotowych. Dent. Med. Probl. 2002, 39, 69-77.
16.Miêdzobrodzki J., Zemanek G., Baran J.: Chemiluminescencja opis zjawiska, mo¿liwoci jego detekcji i wykorzystania. Mikrobiologia Med. 1999, 18, 41-46. 17.Pertyñska M., Tchórzowski H., Cypryk K., Lewkowicz P., Wilczyñski J.: Produk-cja reaktywnych form tlenu (RFT) przez neutrofile krwi obwodowej we wczes-nej ci¹¿y powik³awczes-nej cukrzyc¹ typu 1. Ginek. Pol. 2001, 72, 797-803. 18.Raidal S. L., Love D. N., Bailey G. D., Rose R. J.: Effect of single bouts of
moderate and high intensity exercise and training on equine peripheral blood neutrophil function. Res. Vet. Sci. 2000, 68, 141-146.
19.Rybczyñska J., W¹sik M.: Chemiluminescencja emisja wiat³a w fagocytach. Zasada badania i przydatnoæ kliniczna. Pediatria Polska 2001, 76, 283-287. 20.Tchórzowski H.: Rola granulocytów w immunologii. Immunol. Pol. 1990, 15,
147-156.
21.Waddington R. J., Moseley R., Embery G.: Reactive oxygen species: a potential role in the pathogenesis of periodontal diseases. Oral Dise. 2000, 6, 138-151. 22.Wiktorowicz K., Cofta J., Mackiewicz S. H.: Zastosowanie chemiluminescencji
do oceny aktywnoci komórek fagocytuj¹cych. Post. Nauk Med. 1993, 6, 184-197. 23.Wong C. W., Smith S. E., Thong Y. H., Opdebeeck J. P., Thornton J. R.: Effects of exercise stress on various immune functions in horses. Am. J. vet. Res. 1992, 53, 1414-1417.
Adres autora: dr Wies³aw Krumrych, ul. Juhasów 4/14, 85-794 Byd-goszcz; e-mail: wierych@go2.pl
