Medycyna Weterynaryjna - Summary Med. Weter. 69 (3), 187-190, 2013

Med. Weter. 2013, 69 (3) 187

Praca oryginalna Original paper

BVD/MD (bovine viral diarrhoea/mucosal disease) to wirusowa, szeroko rozpowszechniona choroba byd³a. W USA i Nowej Zelandii odsetek seroreagentów wynosi³ 57% oraz 63% (11, 12). W Anglii notowano wystêpowanie przeciwcia³ przeciwko wirusowi BVD/ MD w 95%, natomiast w krajach skandynawskich w 1% (6). Na zara¿enie wirusem wra¿liwe s¹ równie¿ owce, kozy, œwinie oraz wolno ¿yj¹ce prze¿uwacze (2, 8, 15).

Wirus do organizmu wnika ró¿nymi drogami. Naj-czêœciej przenika przez b³ony œluzowe uk³adu pokar-mowego lub, zdecydowanie rzadziej, atakuje b³ony œluzowe uk³adu oddechowego. Udowodniono tak¿e zaka¿enie w trakcie immunoprofilaktyki byd³a (5). Zmiany chorobowe obserwowane s¹ najczêœciej u zwierz¹t w wieku od 3 do 18 miesiêcy. Nasilenie objawów i przebieg choroby zale¿¹ zarówno od kon-dycji uk³adu odpornoœciowego zaka¿onych zwierz¹t oraz zjadliwoœci wirusa, jak i od warunków zoohigie-nicznych, w jakich przebywaj¹ zwierzêta. Rozwojowi infekcji sprzyjaj¹: nadmierna wilgotnoœæ, zbyt niska temperatura, d³ugotrwa³y stres, uboga w sk³adniki mineralne dieta, nadmierne zapylenie i brak wenty-lacji pomieszczeñ. W czasie rozwoju choroby wirus

rozprzestrzenia siê w organizmie w stanie wolnym lub te¿ w stanie zwi¹zanym z limfocytami i monocytami. Objawy choroby mog¹ byæ bardzo zró¿nicowane. Do najczêœciej wystêpuj¹cych nale¿¹: podwy¿szona cie-p³ota wewnêtrzna cia³a, spadek apetytu, apatia, wod-nista biegunka z domieszk¹ krwi (czêsto cuchn¹ca), bladoœæ b³on œluzowych zwi¹zana z rozwijaj¹c¹ siê niedokrwistoœci¹, zaburzenia krzepniêcia, ogólne os³a-bienie zwierzêcia, wyp³ywy œluzowe i œluzowo-ropne z otworów nosowych i worków spojówkowych, ka-szel (1). U chorych zwierz¹t odnotowano tak¿e os³a-bienie struktury koœci (13).

Zaburzenia hemostazy w przebiegu zaka¿enia wirusem BVDV sk³oni³y do podjêcia badañ, których celem by³o ustalenie, czy w trakcie infekcji dochodzi do zmian w procesie hematopoezy.

Materia³ i metody

Badaniom poddano 10 krów rasy holsztyñsko-fryzyjskiej, w wieku oko³o 2 lat, u których wystêpowa³y kliniczne objawy choroby: krwista biegunka, odwodnienie, bladoœæ b³on œluzowych, przyspieszenie akcji serca i wzrost liczby oddechów, a obecnoœæ wirusa w tej grupie zwierz¹t potwier-dzono badaniem PCR. Grupê kontroln¹ stanowi³o 10

zwie-Ocena szpiku kostnego byd³a rasy

holsztyñsko--fryzyjskiej w przebiegu zaka¿enia wirusem BVDV

WOJCIECH RÊKAWEK, PRZEMYS£AW SOBIECH, JUSTYNA RADWIÑSKA

Katedra Chorób Wewnêtrznych z Klinik¹ Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UWM, ul. M. Oczapowskiego 14, 10-957 Olsztyn

Snarska A., Krystkiewicz W., ¯arczyñska K., Rêkawek W., Sobiech P., Radwiñska J. Evaluation of bone marrow in Holstein-Friesian cattle infected with the BVDV virus

Summary

Bone marrow examinations were performed in a group of 10 Holstein-Friesian (HF) cows aged 2 years, which had been diagnosed with BVD/MD infection in a PCR screening test. Prior to bone marrow sampling, peripheral blood samples were collected for hematological analysis. Bone marrow was sampled from the third and fourth ribs in the sternal region, and it was placed in test tubes containing no anticoagulant. Smears were stained by the MGG method. The aim of this study was to demonstrate changes in the process of hematopoiesis in animals with clinical signs of BVD/MD. The results of the analysis revealed changes in erythrocyte, macrocyte-macrophage, lymphoid and granulocytic cell lines. There was a decrease in the number of red blood cells in the peripheral blood and polychromatic and ortochromatic erythroblasts in the bone marrow. A decrease in leukocyte counts below reference values resulted mainly from a decrease in the number of neutrophilic metamyelocytes, eosinophilic myelocytes and banded eosinophils. Moreover, a decrease in the number of megakaryocytes was observed in the megakariocytic system. BVDV infection causes changes in the activity of the hematopoietic system.

Med. Weter. 2013, 69 (3) 188

rz¹t w podobnym wieku, klinicznie zdrowych, u których metod¹ PCR wykluczono obecnoœæ wirusa BVD/MD. Krew do badañ hematologicznych pobierano z ¿y³y jarzmowej. Badania hematologiczne wykonano przy u¿yciu analizatora hematologicznego ADVIA 2120i. Szpik pobierano z jamy szpikowej 3-4 ¿ebra w okolicy mostkowej (14). Wszystkie procedury badawcze prowadzono za zgod¹ Lokalnej Ko-misji Etycznej (07/2010 z dnia 27.01.2010 r.).

Do pobierania szpiku wykorzystano ig³y d³ugoœci 90 mm, 13G. Przed pobraniem materia³u zwierzêta poddano pre-medykacji przy u¿yciu ksylazyny w dawce 0,02 mg/kg m.c. Miejsce pobrania próbek przygotowano zgodnie ze standardowymi procedurami chirurgicznymi. Szpik kostny pobierany by³ do strzykawek bez antykoagulantu. Ze wzglê-du na bardzo szybkie krzepniêcie badanego materia³u wy-konano rozmazy na przygotowanych wczeœniej szkie³kach. Do barwienia preparatów wykorzystano metodê May--Grünwalda-Giemsy, stosuj¹c krótszy czas barwienia ni¿ w barwieniu rozmazów krwi obwodowej (odczynnik May--Grünwalda do 80 sekund, odczynnik Giemsy 4-5 minut). Do zliczania komórek szpiku kostnego u¿yto sumatora hematologicznego SH-96/24D. Podczas oceny wyników badania hematologicznego oraz rozmazów szpiku pos³ugi-wano siê normami dla byd³a ustanowionymi przez Jain (7) oraz Winnick¹ (19).

Wyniki i omówienie

W badaniach hematologicznych obserwowano spa-dek liczby leukocytów i p³ytek krwi oraz niewiel-kiego stopnia anemiê normocytarn¹, normobarwliw¹. W stanach znacznego os³abienia zwierz¹t i ostrego przebiegu choroby wystêpowa³a pancytopenia, a wœród wskaŸników czerwonokrwinkowych dochodzi³o do wzrostu MCH i MCHC. Spadkowi uleg³a tak¿e liczba krwinek czerwonych poni¿ej minimalnych wartoœci referencyjnych w³aœciwych dla gatunku. Badania

he-matologiczne wykaza³y obni¿enie liczby krwinek bia³ych i trombocytów. W badanym rozmazie szpiku obserwowano zmniejszenie liczby megakariocytów ze spadkiem liczby odszczepianych fragmentów cyto-plazmy przy niezmiennej liczbie megakarioblastów, co wskazuje na znaczne zaburzenia w uk³adzie p³ytko-twórczym (tab. 1). Spadek liczby leukocytów poni¿ej wartoœci referencyjnych powodowany by³ g³ównie obni¿eniem liczby metamielocytów obojêtnoch³on-nych (MYE), mielocytów kwasoch³onobojêtnoch³on-nych (EMYE) i granulocytów pa³eczkowatych kwasoch³onnych (EBAND) (tab. 2). W uk³adzie erytroblastycznym notowany by³ spadek liczby erytroblastów polichro-matycznych i ortochropolichro-matycznych (EPOL i EORT) z niewielkim wzrostem liczby retikulocytów (tab. 3). Tab. 1. Procentowy rozk³ad komórek szeregu p³ytkotwórczego w ocenie szpiku kostnego badanego byd³a, u którego metod¹ PCR potwierdzono wystêpowanie wirusa BVD/MD

Objaœnienia: MGBL – megakarioblast, MEG – megakariocyt

t ¹ z r e i w z a b z c i L MGBL MEG Razem 1 6 10 16 2 5 19 14 3 7 18 15 4 7 19 16 5 6 10 16 6 6 19 15 7 5 18 13 8 4 19 13 9 6 17 13 0 1 7 11 18 a i n d e r Œ 5,9 9 14,9

Tab. 2. Procentowy rozk³ad komórek szeregu granulocytarnego w ocenie szpiku kostnego badanego byd³a, u którego metod¹ PCR potwierdzono wystêpowanie wirusa BVD/MD

Objaœnienia: MBL – mieloblast; PML – promielocyt; MYE – mielocyt obojêtnoch³onny; MET – metamielocyt obojêtnoch³onny; BAND – pa³eczka obojêtnoch³onna; SEG – granulocyt obojêtnoch³onny; EMYE – mielocyt kwasoch³onny; EMET – metamielocyt kwasoch³onny; EBAND – pa³eczka kwasoch³onna; EOS – granulocyt kwasoch³onny; BMYE – mielocyt zasadoch³onny; BMET – metamielocyt zasadoch³onny; BBAND – pa³eczka zasadoch³onna; BAS – granulocyt zasadoch³onny

a b z c i L t ¹ z r e i w z MBL PML MYE MET BAND SEG EMYE EMET EBAND EOS BMYE BMET BBAND BAS Razem 1 0,2 0,3 1,0 2,5 3,1 9,8 0,9 1,0 1,1 5,1 0 0 0 0 25,0 2 0,1 0,4 0,9 2,1 2,2 8,7 0,8 1,1 1,3 5,6 0 0 0,1 0 23,3 3 0,3 0,5 0,8 2,0 2,3 8,7 0,9 1,1 1,3 4,8 0,1 0 0,2 0 23,0 4 0,1 0,6 1,0 1,8 2,4 8,9 1,1 1,3 1,3 4,2 0 0,2 0,1 0,2 23,2 5 0,2 0,5 0,9 1,9 2,6 8,7 1,3 1,5 1,4 5,6 0,1 0,1 0,1 0 24,9 6 0,3 0,6 1,1 2,1 1,8 7,8 0,5 0,6 0,8 5,8 0 0 0 0,3 21,7 7 0,1 0,7 1,1 2,5 2,6 6,8 0,8 0,6 0,7 3,9 0,1 0,2 0,1 0 20,2 8 0,1 0,6 1,2 2,0 2,9 7,2 0,3 0,4 0,7 4,1 0 0,1 0 0 19,6 9 0,1 0,2 1,3 2,3 1,2 4,1 0,4 0,8 0,8 4,2 0,1 0,1 0 0 15,6 0 1 0,1 0,3 0,9 1,9 1,8 4,5 0,5 0,6 0,7 4,5 0 0 0,3 0,1 16,2 a i n d e r Œ 0,16 0,47 1,02 2,11 2,29 7,52 0,75 0,9 1,01 4,78 0,04 0,07 0,09 0,06 21,27

Med. Weter. 2013, 69 (3) 189

W obrêbie uk³adu bia³okrwinkowego w badanych rozmazach szpiku kostnego obserwowano wzrost liczby prolimfocytów (PLYM), limfocytów (LYM) i mono-blastów (MNBL) (tab. 4, 5). Zmianie uleg³ tak¿e stosu-nek komórek prekursorowych uk³adu granulocytarne-go do tych¿e komórek uk³adu erytrocytarnegranulocytarne-go (M : E); obni¿y³ siê do 0,56, podczas gdy wartoœci u zwierz¹t zdrowych wynosz¹ 0,61-0,97 (18).

Odstêpstwa od wartoœci referencyjnych w wynikach badañ hematologicznych zwierz¹t chorych na BVD/ MD sk³aniaj¹ do szukania przyczyny zaburzeñ w pro-cesie hematopoezy zachodz¹cej w szpiku kostnym. W badaniach Waltza i wsp. (16, 17) przedstawiono, ¿e obni¿enie liczby trombocytów

po-wodowane mo¿e byæ ulokowaniem siê wirusa na powierzchni p³ytki, po-woduj¹c ich rozpad manifestuj¹cy siê nieprawid³owoœciami w procesach krzepniêcia i fibrynolizy (9, 10). Po-dobne wyniki uzyskali Dabak i wsp. (4) u ciel¹t zara¿onych wirusem BVDV. Spadek liczby trombocytów powodowany mo¿e byæ nadmiern¹ degradacj¹ starszych p³ytek krwi, a tak¿e interakcj¹ miêdzy wirusem a p³ytk¹ krwi, czego efektem jest spadek liczby trombocytów we krwi obwodowej i znaczne odstêpstwa w wynikach badañ koagulologicznych (3, 9, 15, 17). Dane piœmiennictwa (10, 11) dowodz¹, ¿e w przypadku zaburzeñ hemostazy ustroju nale¿y braæ pod uwagê wp³yw interleukiny 12 (IL-12) i interferonu typu I na uk³ad krzepniêcia i fibrynolizê.

U zwierz¹t z ciê¿kim przebiegiem BVD/MD i przy d³ugotrwa³ym przebiegu choroby mo¿e dochodziæ do hipoplazji szpiku kostnego, a w skrajnych przypad-kach do aplazji szpiku. W badaniach hematologicz-nych w przebiegu anemii aplastycznej bêd¹cej nastêp-stwem aplazji szpiku wystêpuje pancytopenia. W roz-mazach szpikowych obserwowano spadek liczby ko-mórek zarówno w linii czerwonokrwinkowej, jak i bia³okrwinkowej. W szpiku aplastycznym nadal obecne by³y adipocyty, w³ókna retikulinowe, komórki endotelialne i niewielka liczba makrofagów. Badania Scruggsa i wsp. (13) dowiod³y, ¿e w przebiegu BVD/ MD dochodzi do powstawania anemii na skutek spad-Tab. 3. Procentowy rozk³ad komórek szeregu erytrocytarnego

w ocenie szpiku kostnego badanego byd³a, u którego metod¹ PCR potwierdzono wystêpowanie wirusa BVD/MD

Objaœnienia: PROERBL – proerytroblast; BASO ERBL – erytro-blast zasadoch³onny; POLY ERBL – erytroerytro-blast wielobarwliwy; ORTO ERBL – erytroblast kwasoch³onny

a b z c i L t ¹ z r e i w z PROERBL BEARSBOL PEROBLYL OERRTBOL Razem 1 1,2 15,3 18,0 8,6 33,1 2 1,0 15,2 19,1 9,1 34,4 3 1,1 15,8 17,8 10,81 35,5 4 1,3 17,9 16,8 9,8 35,8 5 1,4 18,2 20,2 8,7 38,5 6 1,5 19,6 21,0 9,2 41,3 7 1,5 19,5 22,8 7,8 41,6 8 1,3 10,3 19,9 8,2 39,7 9 1,2 10,1 21,1 9,1 41,5 0 1 1,1 12,1 18,8 7,9 39,9 a i n d e r Œ 1,26 8,4 19,55 8,92 38,13

Tab. 4. Procentowy rozk³ad komórek szeregu monocytarno--makrofagowego w ocenie szpiku kostnego badanego byd³a, u którego metod¹ PCR potwierdzono wystêpowanie wirusa BVD/MD a b z c i L t ¹ z r e i w z MNBL PROMN MON Razem 1 0,3 0,1 2,2 2,6 2 0,1 0 2,3 2,4 3 0,4 0 2,5 2,9 4 0,4 0,2 1,9 2,5 5 0,1 0,1 1,8 2,0 6 0,2 0,1 2,1 2,4 7 0,3 0,1 2,3 2,7 8 0,5 0,1 2,4 3,0 9 0,6 0,3 2,2 3,1 0 1 0,3 0,1 2,8 3,2 a i n d e r Œ 0,32 0,11 2,25 2,68

Objaœnienia: MNBL – monoblast; PROMN – promonocyt; MON – monocyt

Objaœnienia: LBL – limfoblast; PLYM – prolimfocyt; LYM – limfocyt; PLBL – plaz-moblasty; PLAZ – plazmocyt; LC – komórki limfocytarne

a b z c i L t ¹ z r e i w z LBL PLYM LYM PLBL PLAZ LC Razem 1 1,2 4,0 17,3 0,2 0,3 0,3 23,3 2 2,6 4,5 11,5 0,1 7,1 0,1 25,9 3 2,8 3,8 12,8 0,4 3,7 0,1 23,6 4 1,5 3,1 16,8 0,3 0,6 0,2 22,5 5 1,6 3,9 12,8 0 0,2 0,1 18,6 6 1,1 2,5 14,9 0,1 0,9 0,1 19,6 7 2,8 3,2 15,2 0,1 1,1 0,1 22,5 8 1,2 3,8 16,1 0 3,4 0,2 24,7 9 1,3 4,2 19,3 0,1 1,8 0,1 26,8 0 1 1,8 4,8 13,4 0,1 2,5 0,1 22,7 a i n d e r Œ 1,79 3,78 15,01 0,14 2,16 0,14 23,02

Tab. 5. Procentowy rozk³ad komórek szeregu limfoidalnego w ocenie szpiku kost-nego badakost-nego byd³a, u którego metod¹ PCR potwierdzono wystêpowanie wirusa BVD/MD

Med. Weter. 2013, 69 (3) 190

ku liczby erytroblastów na wszystkich etapach rozwo-jowych, jak równie¿ nastêpuje spadek liczby metamie-locytów obojêtnoch³onnych i miemetamie-locytów kwasoch³on-nych. Podobne wyniki badañ otrzymano w badaniach w³asnych. W przebiegu doœwiadczenia u badanych zwierz¹t nie zaobserwowano os³abienia struktury koœ-ci, o czym donosili Scruggs i wsp. (13). Keller i wsp. (8) dowiedli, ¿e w szpiku kostnym byd³a, u którego badania PCR potwierdzi³y wystêpowanie wirusa wy-wo³uj¹cego BVD/MD, obserwowana by³a neutrope-nia. Spadkowi uleg³a liczba metamielocytów i mielo-cytów, co w znacznym stopniu wp³ynê³o na spadek ogólnej liczby krwinek bia³ych w badanych rozmazach szpiku kostnego. Podobne rezultaty otrzymano w ni-niejszych badaniach w³asnych. Otrzymane wyniki badañ wyraŸnie wskazuj¹, ¿e zaburzenia hemostazy, do których dochodzi w przebiegu zaka¿enia wirusem BVDV, s¹ œciœle zwi¹zane ze zmianami aktywnoœci uk³adu p³ytkotwórczego.

Piœmiennictwo

1.Baker J. C.: The clinical manifestation of BVD infection. Vet. Clinics North Am. Food Anim. Pract. 1995, 11, 425-445.

2.Campen H., Frolich K., Hoffman M.: Pestvirus Infections, [w:] Williams E. S., Barker I. K.: Infectious Diseases of Wild Mammals. Willey-Blackwell, Washington State University 2001, 232-244.

3.Corapi W. V., French T. W., Dubovi E. J.: Severe thrombocytopenia in young calves experimentally infected with noncytopathic bovine viral diarrhea virus. J. Virol. 1989, 63, 3934-3943.

4.Dabak M., Karapinar T., Gulacti I., Bulut H., Kizil O., Aydin S.: Hemor-rhagic syndrom-like disease in calves with bivine viral diarrhea and mucosal disease complex. J. Vet. Intern. Med. 2007, 21, 514-518.

5.Falcone E. I.: Experimental infection of calves with Bovine viral diarrhoea virus type-2 (BVDV-2) isolated from a contaminated vaccine. Vet. Res. Comm. 2003, 27, 577-588.

6.Greiser-Wilke I., Grummer B., Moenng V.: Bovine viral diarrhoea eradica-tion and control programmes in Europe. Biologocals 2003, 31, 113-118. 7.Jain N. C.: Essential of Veterinary Hematology. Lea&Febiger, Philadelphia,

PA 1993.

8.Keller S. L., Jefferson B. J., Jacobs R. M., Wood D.: Effect of noncytopathic type 2 Bovine viral diarrhea virus on the proliferation of bone marrow proge-nitor cells. Can. J. Vet. Res. 2006, 70, 20-27.

9.Makoschey B., Lieber-Tenorio E. M., Goovaerts Y. M., Biermann D., Pohlenz J. F.: Leukopenia and thrombocytopenia in pigs after infections with bovine viral diarrhoea virus-2 (BVDV-2). Dt. Tierärztli. Wschr. 2002, 109, 225-230.

10.Musial J., Gluszko P., Undas A., Mahdi F., Kang S., Szczeklik A., Schmaier A. H.: Gamma interferon administration to patients with atopic dermatitis inhibits fibrinolysis and elevated C1 inhibitor. Thromb. Res. 1998, 89, 253--261.

11.Ozmen L., Pericin M., Hakimi J., Chizzonite R. A., Wysocka M., Trinchieri G., Gately M., Garotta G.: Interleukin-12, interferon-gamma, and tumor necrosis factor alpha are the key cytokines of the generalized Schwartzman reaction. J. Exp. Med. 1994, 180, 907-915.

12.Paisley L. G., Wells S., Schmitt B. J.: Prevalence of bovine viral diarrhoea antibodies in 256 US cow-calf operations: a survey. Thieriogenology 1996, 46, 1313-1326.

13.Scruggs D. W., Fleming S. A., Maslin W. R., Grace A. W.: Osteopetrosis, anemia, thrombocytopenia, and marrow necrosis in beef calves naturally infected with bovine virus diarrhea virus. J. Vet. Diagn. Invest. 1995, 7, 555--559.

14.Snarska A., Kuleta Z.: Pobieranie szpiku kostnego u byd³a. Magazyn Wet. Choroby byd³a – Monografia 2010, 1023-1025.

15.Vilcek S., Nettleton P. F.: Pestiviruses in wild animals. Vet. Microbiol. 2006, 116, 1-12.

16.Waltz P. H., Bell T. G., Steficek B. A., Kaiser L., Meas R. K., Baker J. C.: Experimental model of type II bovine viral diarrhea virus included thrombo-cytopenia in neonatal calves. J. Vet. Diagn. Invest. 1999, 11, 505-514. 17.Waltz P. H., Steficek B. A., Baker J. C., Kaiser L., Bell T. G.: Effect of

experimentally induced type II bovine viral diarrhea virus infection on platelet function in calves. Am. J. Vet. Res. 1999, 60, 1396-1401. 18.Wilde J. K. H.: The cellular elements of the bovine marrow. Res. Vet. Sci.

1964, 5, 227-231.

19.Winnicka A.: Wartoœci referencyjne podstawowych badañ laboratoryjnych w weterynarii. Wyd. SGGW, Warszawa 2008.

Adres autora: dr Anna Snarska, ul. Oczapowskiego 14, 10-957 Olsztyn; e-mail: anna.snarska@onet.eu