Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 63 (6), 727-730, 2007

Medycyna Wet. 2007, 63 (6) 727

Praca oryginalna Original paper

Wirus EBHS (European Brown Hare Syndrome) nale¿y do rodziny Caliciviridae, do której zaliczamy tak¿e wirus RHD (Rabbit Haemorrhagic Disease) (6). Wirus ten jest czynnikiem etiologicznym syndromu europejskich zajêcy szaraków (3, 7), zaœ wirus RHD – pomoru królików (7, 17, 18). Naturalnym gospoda-rzem dla wirusa EBHS s¹ zaj¹ce z gatunku Lepus eu-ropeus (zaj¹c szarak) i Lepus timidus (zaj¹c bielak), zaœ dla wirusa RHD – króliki (6). Istotne jest i to, ¿e obok bliskiego pokrewieñstwa prezentowanych wiru-sów (6), równie¿ zaj¹ce i króliki wykazuj¹ wspólne pochodzenie i nale¿¹ do tej samej rodziny zaj¹cowa-tych (Leporidae) (15). Wirusy EBHS i RHD wykazu-j¹ identyczn¹ organizacjê genomu oraz wysok¹ homo-logiê w zakresie sekwencji aminokwasów bia³ka kap-sydu blisk¹ 80%, a ró¿ni¹ siê jedynie delecj¹ 4 i inser-cj¹ jednego aminokwasu (2, 13). Dodatkowo choroby wywo³ane przez wirusy EBHS i RHD daj¹ podobny – gwa³towny przebieg zarówno u zajêcy (3, 7), jak i kró-lików (7, 17, 18), a œmiertelnoœæ przy obu wirusach jest bardzo wysoka i wynosi od 70% do 100% (3, 7, 17, 18). Tak¿e objawy przy tych chorobach s¹ zbli¿o-ne i manifestuj¹ siê m.in. zaburzeniami ze strony oun u zajêcy i królików (3, 7) oraz ¿ó³taczk¹ u zajêcy (3), jak te¿ zmianami w uk³adzie oddechowym u królików (17). W obrazie sekcyjnym zajêcy (3, 7) zaka¿onych

wirusem EBHS i królików (5, 7, 17) – wirusem RHD, obserwowano podobne zmiany m.in. w¹trobie, œledzio-nie, oun, p³ucach i nerkach. Przeprowadzone badania odpornoœciowe u królików zaka¿onych eksperymen-talnie wirusem RHD wykaza³y, ¿e istotn¹ rolê w prze-biegu tego zaka¿enia pe³ni¹ mechanizmy odpornoœci swoistej i nieswoistej, tak komórkowej, jak i humo-ralnej (4, 12, 17-20). Bior¹c pod uwagê przytoczone fakty dotycz¹ce podobieñstwa wirusów EBHS i RHD oraz pokrewieñstwa zajêcy i królików, a tak¿e prze-bieg i obraz kliniczny choroby, za³o¿ono, ¿e w przy-padku dojœcia do zaka¿enia królików wirusem EBHS, uzyskane zmiany w uk³adzie odpornoœciowym bêd¹ swoiste dla tej infekcji, a które do tej pory nie by³y opisane.

Ze wzglêdu na brak w piœmiennictwie badañ im-munologicznych u zajêcy i zwierz¹t laboratoryjnych zaka¿onych wirusem EBHS, postanowiono w niniej-szej pracy przeœledziæ dynamikê wybranych wskaŸni-ków nieswoistej odpornoœci komórkowej (warunko-wanej zdolnoœci¹ bójcz¹ komórek PMN okreœlon¹ tes-tem spontanicznej redukcji b³êkitu nitrotetrazoliowe-go NBT) i humoralnej (iloœæ lizozymu – LZM) u kró-lików eksperymentalnie zaka¿onych wirusem EBHS. Kontrolê zaka¿enia wykonano metod¹ Real-Time PCR poprzez œledzenie replikacji wirusa EBHS w komór-kach krwi obwodowej królików oraz poprzez zare-jestrowanie objawów chorobowych.

Odpornoœæ nieswoista u królików

eksperymentalnie zaka¿onych wirusem EBHS*

)

PIOTR NOWACZYK, WIES£AW DEPTU£A

Katedra Mikrobiologii i Immunologii Wydzia³u Nauk Przyrodniczych US, ul. Felczaka 3c, 71-412 Szczecin

Nowaczyk P., Deptu³a W.

Non-specific immunity in rabbits experimentally infected with EBHS (European Brown Hare Syndrome) virus

Summary

In accordance with the lack of immunological studies concerning hares infected with EBHS virus, the aim of this study was to observe the dynamics of chosen indices of non-specific immunity altered with cidal capacity of PMN cells and the amount of lyzosyme in rabbits infected with EBHS virus. The studies were conducted to show replication of EBHS virus in the immune system in rabbits. The results of the studies in these animals have shown that EBHS virus replicates in rabbit’s cells, proving the brake through of the species barrier in rabbits, which during the course of this infection causes the activation of leucocytes resulting in an increased amount of LZM in serum.

Keywords: rabbit, EBHS virus

*) _{Badania finansowane ze œrodków na naukê w latach 2005-2006 jako}

Medycyna Wet. 2007, 63 (6) 728

Materia³ i metody

Badaniem objêto 22 zdrowe króliki – Oryctolagus cuni-culus, mieszañce pochodz¹ce z hodowli u¿ytkowej pod sta³ym nadzorem zootechniczno-weterynaryjnym o masie 1,7-2,5 kg, zaklasyfikowane wed³ug norm krajowych jako zwierzêta grupy konwencjonalnej (1). Zwierzêta te odzna-cza³y siê ogólnie dobrym stanem zdrowia i przebywa³y w wiwarium, gdzie warunki zoohigieniczne, ocenione na podstawie pomiaru temperatury, wilgotnoœci i oœwietlenia oraz powierzchni u¿ytkowej, odpowiada³y normom krajo-wym (1, 16). Króliki przetrzymywano w typowych meta-lowych klatkach dla królików o wymiarach 65 cm × 45 cm × 40 cm i ¿ywiono pe³nowartoœciow¹ pasz¹ LSK produko-wan¹ przez Wytwórniê Koncentratów i Mieszanek Paszo-wych „Agropol” w Motyczu przy nieograniczonym dostê-pie do wody.

Spoœród 22 zwierz¹t u¿ytych w doœwiadczeniu, 16 za-ka¿ono wirusem EBHS, a 6 królików stanowi³o grupê kon-troln¹. Do zaka¿enia u¿yto 20% homogenizatu w¹troby, o mianie HA 126, pochodz¹cego od naturalnie zaka¿onego pad³ego zaj¹ca. Homogenizat otrzymano od prof. Jana Buczka z Uniwersytetu w Bia³ymstoku. Zwierzêta zaka¿o-no domiêœniowo 1 ml homogenizatu. Króliki kontrolne w liczbie 6 sztuk otrzyma³y analogicznie 1 ml ja³owego p³ynu fizjologicznego. Krew do badañ pobierano z ¿y³y brze¿nej ucha królika w godzinach 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 52, 56 i 60 po zaka¿eniu wirusem EBHS lub podaniu ja³o-wego p³ynu fizjologicznego.

Test spontanicznej redukcji b³êkitu nitrotetrazoliowego (NBT) wykonany zosta³ w oparciu o zmodyfikowan¹ me-todê Parka (14), natomiast do oznaczania iloœci lizozymu (LZM) w surowicy tych zwierz¹t wykorzystano metodê dyfuzji p³ytkowej wed³ug Hankiewicza (8).

Zdolnoœæ wirusa EBHS do replikacji w ogólnej puli leu-kocytów i puli granulocytów obojêtnoch³onnych krwi ob-wodowej u królików zaka¿onych wirusem EBHS, wykaza-no metod¹ Real-Time PCR (Eurogentec, Belgia). Badania te przeprowadzono w dwóch etapach. W I etapie przepro-wadzono izolacjê ogólnej puli leukocytów (wg A&A Bio-technology, Polska) i puli granulocytów obojêtnoch³onnych wg metody Zemana (21) w modyfikacji Hukowskiej--Szematowicz (10) z pe³nej krwi królika, jak równie¿ ekstrakcjê wirusowego RNA (wg A&A Biotechnology, Polska) z tych komórek. W II etapie przeprowadzono reak-cjê odwrotnej transkrypcji (RT-PCR), a nastêpnie dokona-no pomiaru iloœci otrzymanego fragmentu cDNA bia³ka VP60 wirusa EBHS metod¹ Real-Time PCR (Eurogentec, Belgia).

W celu otrzymania komplementarnej nici cDNA, do re-akcji u¿yto: 1 µl startera WD (5’ G T T G T G G G G T G T A T G T G G T G G C 3’) o koncentracji 25 µM, zapro-jektowanego na podstawie konserwatywnej sekwencji wi-rusa EBHS w rejonie bia³ka VP60 przez firmê Oligo (Pol-ska), 1 µl mieszaniny nukleotydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) o koncentracji 25 µM ka¿dy (Promega, USA); 0,5 µl inhibitora RNA-zy o koncentracji 40 u/µl (Promega, USA); 0,25 µl primera Oligo (dT)₁₈ o koncentracji 100 µM; 13 µl wody DEPC (Eppendorf, Niemcy); 2 µl buforu 5 × stê¿onego (Invitrogen, USA); 0,25 µl DTT o koncentracji 100 µM; 5 µl RNA uprzednio inkubowanego przez 5

mi-nut w temperaturze 65°C oraz 1 µl M-MLV RT o koncen-tracji 200 u/µl (Invitrogen, USA). Reakcjê przeprowadzo-no w koñcowej objêtoœci mieszaniny wyprzeprowadzo-nosz¹cej 25 µl w termocyklerze firmy Biometra o nastêpuj¹cym profilu temperaturowym: 25°C przez 10 minut, 37°C przez 60 mi-nut, 95°C przez 5 mimi-nut, 4°C przez 1 minutê, 4°C ¥. Otrzy-many w wyniku reakcji odwrotnej transkrypcji cDNA frag-mentu bia³ka VP60 wirusa EBHS wykorzystano do iloœcio-wego pomiaru tego cDNA metod¹ Real – Time PCR.

Do reakcji Real-Time PCR wykorzystano startery PN (5’ G T T G C A A A G T C G A T C T A C G G G G T T G C 3’) i WD (5’ G T T G T G G G G T G T A T G T G G T G G C 3’), zaprojektowane na podstawie konserwatyw-nej sekwencji wirusa EBHS w rejonie bia³ka VP60 przez firmê Oligo (Polska), pozwalaj¹cych na amplifikacjê frag-mentu o d³ugoœci 121 pz. Do iloœciowego pomiaru kopii matrycy cDNA wykorzystano gotowy zestaw odczynników Smart kit for SYBR® _{Green I oraz 18S rRNA Control kit}

(FAM-TAMRA) (dla kontroli wewnêtrznej) firmy Eurogen-tec (Belgia), a reakcjê przeprowadzono wed³ug zaleceñ producenta (Eurogentec, Belgia). Wszystkie powy¿sze reakcje prowadzono w aparacie Smart Cycler II firmy Cepheid, wykorzystuj¹c profil temperaturowy zalecany przez producenta odczynników (Eurogentec, Belgia). W celu póŸniejszego odczytania iloœci kopii matrycy cDNA fragmentu bia³ka VP60 wirusa EBHS, przygotowano krzy-w¹ standardokrzy-w¹ wed³ug nastêpuj¹cych rozcieñczeñ genu referencyjnego 18S rRNA (Eurogentec, USA): 100 amoli; 10 amoli; 1 amol; 0,1 amola; 0,01 amola. Po przeprowa-dzonych reakcjach odczytano stê¿enie kopii matrycy cDNA (amol) fragmentu bia³ka VP60 wirusa EBHS, odczytano stê¿enie fragmentu genu referencyjnego 18S rRNA króli-ka, wyliczono wartoœæ stosunku stê¿enia kopii matrycy cDNA fragmentu bia³ka VP60 wirusa EBHS i fragmentu genu referencyjnego 18S rRNA królika, który wyra¿a³ rze-czywisty poziom ekspresji genu EBHS, a nastêpnie otrzy-man¹ wartoœæ przeliczono na iloœæ kopii wirusa EBHS (× 1023 _{kopii) w badanych próbach w odniesieniu do 1000}

komórek.

Uzyskane wyniki badañ odpornoœciowych poddano ana-lizie statystycznej testem t-Studenta przy p = 0,05.

Wyniki i omówienie

Wyniki badañ z zakresu odpornoœci nieswoistej, a tak¿e badañ wirusologicznych dotycz¹cych przed-stawienia iloœci zreplikowanych kopii wirusa EBHS w leukocytach i granulocytach obojêtnoch³onnych krwi obwodowej u królików eksperymentalnie zaka¿onych wirusem EBHS, przedstawiono w tab. 1 i 2.

Analizuj¹c uzyskane wyniki badañ immunologicz-nych u królików zaka¿oimmunologicz-nych eksperymentalnie wiru-sem EBHS (tab. 1), nale¿y stwierdziæ, ¿e w teœcie NBT spontanicznym nie odnotowano ró¿nic statystycznie istotnych, zaœ w wartoœciach iloœci LZM w surowicy krwi wykazano statystycznie istotny spadek w 36. i 60. godzinie po podaniu tego antygenu.

Oceniaj¹c wyniki badañ wirusologicznych przepro-wadzonych metod¹ Real-Time PCR (tab. 2) stwierdzo-no, ¿e wirus EBHS wykazuje zdolnoœæ replikacji swo-ich cz¹stek zakaŸnych zarówno w ogólnej puli

leuko-Medycyna Wet. 2007, 63 (6) 729

cytów, jak i puli granulocytów obo-jêtnoch³onnych u królików zainfe-kowanych tym za-razkiem. W przy-padku leukocytów krwi obwodowej, iloœæ zreplikowa-nych cz¹stek wiru-sa EBHS wzrasta-³a pocz¹wszy od

8. godziny doœwiadczenia i trwa³a do jego zakoñcze-nia (godzina 60.) z niewielkim spadkiem w 52. godzi-nie badania. Dodaæ nale¿y, ¿e z uwagi na du¿¹ iloœæ replikowanych cz¹stek wirusa w godzinach 56. i 60., odczyt iloœci ich kopii przy zastosowaniu komercyj-nej krzywej wzorcowej (Eurogentec, Belgia) by³ nie-mo¿liwy, jednak nale¿y przyj¹æ, ¿e iloœæ kopii wirusa w tych godzinach by³a wy¿sza ni¿ 444,5 × 1023 _kopii,

jak¹ obserwowano w 48. h badania. Oceniaj¹c iloœæ kopii wirusa EBHS w granulocytach obojêtnoch³on-nych krwi obwodowej królików,

na-le¿y stwierdziæ ¿e ich iloœæ wzrasta³a od 8. do 56. godziny doœwiadczenia ze spadkiem w godzinie 60.

Nale¿y równie¿ dodaæ, ¿e nie stwierdzono u królików zaka¿onych wirusem EBHS objawów typowych dla choroby krwotocznej zajêcy, cho-cia¿ miêdzy 4. a 60. godzin¹ doœwiad-czenia, zarejestrowano objawy ogól-ne w postaci ciê¿kiego i przyspieszo-nego oddechu, kichania, osowia³oœci oraz braku apetytu.

Oceniaj¹c uzyskane wyniki badañ nale¿y podaæ, ¿e w przypadku wirusa EBHS porównanie otrzymanych re-zultatów jest niemo¿liwe z uwagi na brak w piœmiennictwie jakichkolwiek badañ immunologicznych dotycz¹-cych EBHS. Znane s¹ jednak¿e wy-niki doœwiadczeñ u królików zaka-¿onych eksperymentalnie ró¿nymi szczepami wirusa RHD (tab. 3), do których nasze wyniki odnieœliœmy ze

wzglêdu na podobieñstwo tego wirusa do wirusa EBHS oraz pokrewieñstwo zajêcy i królików.

Porównuj¹c wyniki badañ w³asnych z zakresu war-toœci testu NBT spontanicznego do rezultatów uzyska-nych u królików zaka¿ouzyska-nych 12 ró¿nymi szczepami wirusa RHD (tab. 3) nale¿y stwierdziæ, ¿e brak zmian w tym wskaŸniku odpornoœciowym zarejestrowano tak¿e przy szczepie francuskim Fr-2 wirusa RHD. Natomiast w przypadku szczepu francuskiego Fr-1 oraz polskiego MA£ i SGM wirusa RHD wykazano

krót-y rt e m a r a p e n a d a B h c a n iz d o g h c y n l ó g e z c z s o p w w ó rt e m a r a p i c œ o tr a W 0 4 8 12 24 36 48 52 56 60 Z ) 6 1 ( (K6) (1Z6) (K6) (1Z6) (K6) (1Z6) (K6) (1Z6) (K6) (1Z6) (K6) (1Z6) (K6) (1Z6) (K6) (1Z6) (K6) (1Z6) (K6) T B N t s e T ). b .l ( y n z c i n a t n o p s SDx± 31,,57 32,,80 21,,02 10,,00 21,,61 33,,55 10,,84 33,,55 11,,91 02,,00 21,,68 10,,75 41,,08 30,,00 23,,11 65,,70 33,,90 50,,00 21,,69 32,,51 )l / g m ( M Z L æ œ o lI _SDx_± 4₀,_,82 ₁5_,,₅1 ₀3_,,₄5 ₁5_,,₅1 ₁5_,,7₇ 4₀,_,7_{9 1}3_,,₂8 5_0,,7₆ 4₁,_,4_{3 1}7_,,₃1 3₁,_,28 7₁,_,1₃* ₁4,_,50 5₀,_,7₆ 4_1,,₃2 5₀,_,7₆ 5₁,_,7_{7 1}7_,,1₃ 3_1,,₄8 9₁,_,3₈* Tab. 1. WskaŸniki nieswoistej odpornoœci u królików eksperymentalnie zaka¿onych wirusem EBHS

Objaœnienia: Z – zwierzêta zaka¿one; K – zwierzêta kontrolne; ( ) – liczba zwierz¹t; * – ró¿nice istotne statystycznie przy p = 0,05

rt e m a r a p y n a d a B h c a n iz d o g h c y n l ó g e z c z s o p w i c œ o tr a W 0 ) 6 1 ( (146) (186) (1126) (2146) (3166) (4186) (5162) (5166) (6106) ( a s u ri w ii p o k a b z c i L × 01 23_kopi)i w ó t y c o k u e l 0 0 0 1 w SDx± 00,,00 00,,00 61,,00 100,,61 236,,24 11023,4,8 43494,,65 3576,4,8 –> >– ( a s u ri w ii p o k a b z c i L × 01 23_kopi)i h c y n n o ³ h c o n t ê j o b o w ó t y c o l u n a r g 0 0 0 1 w SDx± 00,,00 00,,00 20,,37 30,,32 91,,05 375,6,2 11497,,87 12832,,31 23523,,75 22035,,64 Tab. 2. Liczba kopii wirusa EBHS w ogólnej puli leukocytów i puli granulocytów obojêtnoch³onnych krwi obwodowej u królików zaka¿onych eksperymentalnie wirusem EBHS

Objaœnienia: ( ) – liczba zwierz¹t zaka¿onych; > – wartoœci powy¿ej 444,5

D H R a s u ri w p e z c z S TestNBTspontaniczny lIoœæLZM(mg/)l Piœmiennictwo 1 -r F – i k s u c n a r F ­12,24 brakzmian (17) 2 -r F – i k s u c n a r F brakzmian ­4,8,12,24,36,48,52,56 (17) £ A M – i k s l o P ­ 25 ­8,24,36,48,52,56 (17) M G S – i k s l o P ­8,24 ¯8,12,24,36,48,52,56,60 (17) 1 -r K – i k s l o P ¯ 63 _¯­₅8₂,_,4₅8₆ (4) M G K – i k s l o P ¯ 65 ¯8,12,24,36,48,52,56,60 (4) A L B – i k s l o P ­8,12,24,36,48,52 ¯4,12,48,52 (12,19) D P – i k s l o P niebadano ­12,2_¯4,₄4_,8₈,_,5₃2₆,60,72 (20) K S G – i k s l o P niebadano ­4,2_¯4,₈3_,6₁,₂4_,8₅,₆52,60 (20) ¯ – i k s l o P niebadano ­52,56,60 (20) D ¯ – i k s l o P niebadano brakzmian (20) 1 6 5 -V – i k s e z C niebadano ­4,24,36 (9)

Tab. 3. Sumaryczne zestawienie wyników wartoœci testu redukcji b³êkitu nitrote-trazoliowego (NBT) w teœcie spontanicznym i iloœci lizozymu (LZM) u królików eksperymentalnie zaka¿onych wirusem RHD

Objaœnienia: ­¯ – statystycznie istotny wzrost/spadek w poszczególnych godzinach doœwiadczenia

Medycyna Wet. 2007, 63 (6) 730

kotrwa³y wzrost wartoœci testu NBT, zaœ w przypadku szczepu BLA, który nie posiada zdolnoœci hemagluty-nacji erytrocytów (11), wzrost ten utrzymywa³ siê d³u-¿ej. Ponadto w przypadku królików zaka¿onych szcze-pami polskimi Kr-1 i KGM wirusa RHD zanotowano krótkotrwa³y spadek wartoœci testu NBT.

Porównuj¹c uzyskane wyniki z zakresu iloœci LZM u królików badanych do analogicznych rezultatów otrzymanych przy zaka¿eniu królików 12 ró¿nymi szczepami wirusa RHD (tab. 3), nale¿y stwierdziæ ¿e zarejestrowany spadek wartoœci tego parametru, uzys-kany u królików zaka¿onych wirusem EBHS, jest zbli-¿ony do wyniku zanotowanego przy szczepach SGM, KGM, BLA, Kr-1, PD i GSK (przy tych trzech ostat-nich szczepach notowano tak¿e wzrost) wirusa RHD, choæ to obni¿enie u nich, przypada³o na nieco inne godziny po zaka¿eniu i ich spadek utrzymywa³ siê d³u-¿ej (tab. 3). Inne szczepy (Fr-2, MA£, ¯, V-561) wi-rusa RHD powodowa³y wzrost wartoœci iloœci LZM, który by³ mniej lub bardziej wyd³u¿ony w czasie (tab. 3). Ponadto odnotowano tak¿e, ¿e szczep Fr-1 i ¯D wirusa RHD nie powodowa³ zmian w iloœci su-rowiczego LZM u królików, co wyraŸnie odró¿nia je od wirusa EBHS, przy którym w badaniach w³asnych takie zmiany zarejestrowano (tab. 3).

Podsumowanie

Na podstawie uzyskanych wyników badañ nale¿y stwierdziæ, ¿e:

– wirus EBHS replikuje siê w komórkach królików, co jest istotnym faktem biologicznym i dowodem prze-³amania przez ten wirus bariery gatunkowej. Czynnik ten powoduje równie¿ u królików nietypowe objawy chorobowe,

– zaka¿enie królików wirusem EBHS manifestuje siê zmianami immunologicznymi czêœciowo zbli¿o-nymi w zakresie testu NBT, do wartoœci uzyskanych przy szczepie Fr-2 wirusa RHD oraz w zakresie iloœci surowiczego LZM przy szczepach polskich (SGM, KGM i BLA) tego wirusa,

– wiêkszoœæ szczepów wirusa RHD (tab. 3) powo-dowa³a d³u¿ej trwaj¹ce zmiany w badanych parame-trach u królików ni¿ powodowa³ to wirus EBHS u tych zwierz¹t. Œwiadczy³oby to, ¿e wirus EBHS, mimo ¿e nale¿y podobnie jak wirus RHD do tego samego ro-dzaju Lagovirus i tej samej rodziny Caliciviridae, da-j¹cy reakcje krzy¿owe z wirusem RHD, powoduje znacznie s³abiej zaznaczone i krócej trwaj¹ce zmiany w badanych wskaŸnikach odpornoœci wrodzonej u kró-lików.

Piœmiennictwo

1.Anon.: Materia³y konferencyjno-szkoleniowe Sekcji ds. Zwierz¹t Laboratoryj-nych. ZG SITR 1987, 2, 26-77.

2.Bascunana C. R., Nowotny N., Belak S.: Detection and Differentiation of Rabbit Hemorrhagic Disease and European Brown Hare Syndrome Viruses by Amplifi-cation of VP60 Genomic Sequences from Fresk and Fixe Tissue Specimens. J. Clin. Microbiol. 1997, 35, 2492-2495.

3.Deptu³a W., Buczek J.: Syndrom br¹zowych zajêcy europejskich – nowa jednost-ka chorobowa. Medycyna Wet. 1993, 49, 208-210.

4.Deptu³a W., Kêsy A., Tokarz-Deptu³a B., Stosik M., Travnièek M.: Dynamics of selected parameters in rabbits infected with rabbit haemorrhagic disease virus. Folia Veterinaria 1999, 43, 186-190.

5.Deptu³a W., Lener M., Tokarz-Deptu³a B., Stosik M.: Uk³ad odpornoœciowy i choroby zakaŸne królików. Wyd. Uniwersytetu Szczeciñskiego, Szczecin 2003. 6.Fauquet C. M., Mayo M. A., Manilof J., Desselberger U., Ball L. A.: Virus

Taxo-nomy. Wyd. Academic Press, San Diego 2005.

7.Fitzner A.: Kaliciwirusy – patogeny zwierz¹t i ludzi. Medycyna Wet. 2002, 58, 89-95.

8.Hankiewicz J., Œwierczek E.: Wyniki w³asnych badañ lizozymu w surowicy krwi i moczu. Pol. Arch. Med. Wewn. 1975, 51, 591-597.

9.Hukowska B., Nowaczyk P., Tokarz-Deptu³a B., Deptu³a W.: WskaŸniki nieswo-istej odpornoœci humoralnej u królików eksperymentalnie zaka¿onych wirusem VHD (viral haemorrhagic disease) – szczep czeski V-561. Mat. VI Konf. Nauk. Biologia molekularna w diagnostyce chorób zakaŸnych i biotechnologii. Warsza-wa 2003, s. 90-94.

10.Hukowska-Szematowicz B.: Charakterystyka immunologiczno-genetyczna wybra-nych szczepów wirusa RHD (rabbit haemorrhagic disease). Praca dokt. US Szcze-cin 2006.

11.Kêsy A., Fitzner A., Niedbalski B., Paprocka G., Walkowiak B.: A new variant of the viral haemorrhagic disease of rabbits virus. Rev. sci. tech. Off. Int. Epiz. 1996, 15, 1029-1035.

12.Nahurska A., Tokarz-Deptu³a B., Hukowska B., Deptu³a W.: Selected indices of specific humoral immunity in rabbits experimentally infected with non--haemaglutinogenic strain of VHD (viral haemorrhagic disease) virus. Pol. J. Vet. Sci. (Suppl. 3) 2003, 6, 25-27.

13.Nowotny N., Bascunana C. R., Pordany-Ballagi A., Gavier-Widen D., Uhlen M., Belak S.: Phylogenetic analysis of rabbit haemorrhagic disease and European brown hare syndrome viruses by comparison of sequences from the capsid protein gene. Arch. Virol. 1997, 142, 657-673.

14.Park B. H., Fihring S. M., Smithowiak E. M.: Infection and nitroblue tetrazolium reduction by neutrophils A diagnostic A i D. Lancet 1968, 2, 532-538. 15.Pucek Z.: Klucz do oznaczania ssaków polskich. Wyd. PWN, Warszawa 1984. 16.Rozporz¹dzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 10 marca 2006 r.

w sprawie szczegó³owych warunków utrzymywania zwierz¹t laboratoryjnych w jednostkach doœwiadczalnych, jednostkach hodowlanych i u dostawców. Dz. U. 2006, nr 50, poz. 368.

17.Tokarz-Deptu³a B.: Kszta³towanie siê wybranych wskaŸników odpornoœci nie-swoistej u królików po zaka¿eniu wirusem VHD (viral haemorrhagic disease). Praca dokt., PIW Pu³awy 1998.

18.Tokarz-Deptu³a B., Deptu³a W., Kêsy A.: Pomór królików ze szczególnym uwzglêd-nieniem zjawisk odpornoœciowych. Medycyna Wet. 2002, 58, 497-500. 19.Tokarz-Deptu³a B., Hukowska B., Deptu³a W.: Dynamic alteriations in selected

indices of non-specific cell-mediated immunity in rabbits experimentally infec-ted with VHD (viral haemorrhagic disease) virus. Pol. J. Vet. Sci. (Suppl. 3) 2003, 6, 70-73.

20.Tokarz-Deptu³a B., NiedŸwiedzka P., Deptu³a W.: Surowiczy lizozym (LZM) u królików eksperymentalnie zaka¿onych czterema polskimi szczepami RHDV (rabbit haemorrhagic disease virus). Mat. VIII Konf. Biologia molekularna w diagnostyce chorób zakaŸnych i biotechnologii. Warszawa 2005, s. 132-136. 21.Zeman K.: Metody izolacji i oceny funkcji granulocytów obojêtnoch³onnych.

Immunol. Pol. 1995, 15, 157-170.

Adres autora: mgr Piotr Nowaczyk, ul. Felczaka 3c, 71-412 Szczecin; e-mail: kurp13@sus.univ.szczecin.pl