Medycyna Wet. 2007, 63 (7) 839
Praca oryginalna Original paper
Salinomycyna i lazalocyd nale¿¹ do antybiotyków jo-noforowych (polieterowych), otrzymywanych na drodze fermentacji tlenowej ze szczepów Streptomyces sp.: sali-nomycyna S. albus, lazalocyd S. lasaliensis. S¹ zwi¹z-kami o z³o¿onej wielopiercieniowej budowie (ryc. 1). Prowadz¹ do niespecyficznego transportu jonów w obu kierunkach, nie uszkadzaj¹c b³on komórkowych. Trans-port ten jest bardzo wydajny, gdy¿ w przypadku salino-mycyny jej jedna cz¹steczka ma mo¿liwoæ przenieæ 104
jonów w ci¹gu sekundy. Przy zatruciu antybiotykami jo-noforowymi przesuniêciom podlegaj¹ przede wszystkim jony K+, Na+, H+ (12, 14), natomiast lazalocyd tak¿e ma
powinowactwo do jonów dwuwartociowych Ca2+, Mg2+
i amin biogennych (1). Pomimo rozpoznanego mecha-nizmu toksycznoci, wra¿liwoæ komórek w¹trobowych mierzona wskanikami cytotoksycznoci podstawowej nie zosta³a okrelona.
Jonofory wykorzystywane s¹ w profilaktyce drobiu jako kokcydiostatyki, a do niedawna jako stymulatory
wzrostu w formie dodatków paszowych; lazalocyd (Ava-tec) 75-125 ppm, a salinomycyna (Sacox, Coxistac) 40-60 ppm (18). Wzorem innych krajów UE, jonofory z pocz¹tkiem 2006 r. wycofywano z obrotu jako stymu-latory wzrostu. Zgodnie z zaleceniami, stosowanie
anty-Cytotoksycznoæ salinomycyny i lazolocydu wobec
hepatocytów modelowej linii komórkowej szczura*
)
LIDIA RADKO, WOJCIECH CYBULSKI, WOJCIECH RZESKI*,**
Zak³ad Toksykologii i Ochrony rodowiska Katedry Przedklinicznych Nauk Weterynaryjnych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. Akademicka 12, 21-033 Lublin
*Zak³ad Wirusologii i Immunologii Wydzia³u Biologii i Nauk o Ziemi UMCS, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin **Zak³ad Toksykologii Instytutu Medycyny Wsi, ul. Jaczewskiego 2, 20-950 Lublin
Radko L., Cybulski W., Rzeski W.
Cytotoxicity of salinomycin and lasalocid in a model hepatocyte cell line of a rat
Summary
The aims of the study were determining the median cytotoxicity indicate (IC50), nature of cell death (apoptosis/
necrosis), assessment and morphology of changes observed in FAO cell line culture of hepatocytes subjected to ionophore antibiotics, salinomycin and lasalocid, incubations.
INVTTOX recommended MTT, NRU and KB cytotoxicity tests were used to research mitochondrial, protein synthesis and cell proliferation. In addition cell staining in order to reveal membrane destruction that established cell death character May-Grunwald & Giemsa staining were also conducted. Cytotoxicity indices (IC50) estimated by the 24 hour MTT test were at a level 2.41 ± 0.29 mM and 7.93 ± 0.01 mM; however, after a 48 hour incubation the values lowered to 0.112739 ± 0.01 mM and 0.59 ± 0.01 mM for salinomycin and lasalocid, respectively. In contrast to the MTT data, that of NRU and KB tests were higher, indicating mitochondria as the main subcellular target for the antibiotic action. The determined IC50 values were positively related to DL50 (the data from references). Hepatocytes death were established to be of an apoptosis nature. Cell morphology was changed from IC50 depending on manner; the lower value of the indicate corresponded to more pronounced cytopathologic findings. Summarizing, monolayer cell cultures of rat hepatocytes proved to serve as a useful model for cytotoxicity studies enabling to indicate subcellular targets for ionophore antibiotics.
Keywords: salinomycyn, lasalocid, hepatotoxity, cell lines
*) Badania czêciowo finansowane ze rodków Europejskiego Funduszu Spo-³ecznego oraz bud¿etu pañstwa w ramach Zintegrowanego Programu Operacyj-nego Rozwoju RegionalOperacyj-nego, dzia³ania 2.6. Regionalne Strategie Innowacyjne i Transfer Wiedzy, projekt: Prace naukowe doktorantów AR szans¹ dla
Medycyna Wet. 2007, 63 (7) 840
biotyków paszowych przechodzi pod kontrolê s³u¿by we-terynaryjnej. Jako pasze lecznicze ordynowane s¹ przy pojawieniu siê w stadzie kokcydiozy, a salinomycyna i lazalocyd s¹ lekami z wyboru sporód wielu innych przedstawicieli tej grupy antybiotyków (5, 6, 8). Nieod-powiednie podawanie antybiotyków jonoforowych (prze-dawkowanie, nierównomierne rozprowadzenie w paszy, ³¹czne stosowanie z innymi lekami lub dodatkami pa-szowymi) by³o przyczyn¹ wielu zatruæ. Wynika to z w¹s-kiego marginesu bezpieczeñstwa, ma³ej rozpiêtoci po-miêdzy dawk¹ lecznicz¹ a toksyczn¹. Przyjmuje siê, ¿e przekroczenie zalecanych dawek kokcydiostatyków o 20--50% mo¿e wywo³aæ objawy toksyczne. Poszczególne substancje charakteryzuje zró¿nicowana toksycznoæ dla poszczególnych gatunków zwierz¹t, salinomycyna nie jest wskazana dla indyków i kurcz¹t hodowanych na nioski, a lazalocyd dla kur niosek i kurek z genem kar³owatoci. Cytotoksycznoæ tych zwi¹zków ujawnia siê g³ównie w komórkach w¹trobowych i miêniowych (20). Po sto-sowaniu tych zwi¹zków obowi¹zuje 5-dniowy okres ka-rencji, jednak¿e ich pozosta³oci stwierdzano w badaniach monitoringowych tkanek i jaj kurzych (9, 11, 21).
Celem badañ by³o okrelenie aktywnoci hepatocyto-toksycznej salinomycyny i lazalocydu na podstawie wskaników po³owicznych efektów hamuj¹cych (IC50), oraz rozpoznanie zmian patomorfologicznych i charak-teru wywo³ywanej mierci szczurzych hepatocytów linii ci¹g³ej FAO eksponowanych na badane kokcydiostatyki w hodowli komórkowej.
Materia³ i metody
Badanie wykonano na linii ci¹g³ej hepatocytów szczurzych FAO, pochodz¹cej z banku komórek ECACC Salisbury, Wilt-shire, UK. Komórki hodowano w pod³o¿u Hamsa F-12K (MP Biomedical USA) z dodatkiem 10% p³odowej surowicy byd-lêcej, FBS, (Sigma). Nastêpnie poddawano je inkubacji w tem-peraturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Po uzyskaniu jednoli-tej warstwy (monolayer), co wymaga³o 24 godzin inkubacji, komórki odklejano od pod³o¿a za pomoc¹ 0,25% roztworu trypsyny (Sigma). Zawieszono je ponownie w wie¿ym pod-³o¿u hodowlanym z dodatkiem 10% FBS. Zawiesinê o gês-toci 2,5 × 106 komórek/ml pod³o¿a rozlano do plastikowych
p³ytek (NUNC, 96-well) po 100 µl/studzienkê i prowadzono inkubacjê przez 24 godziny (19). Tak przygotowane hepato-cyty stosowano w kolejnych etapach badañ.
Roztwory salinomycyny i lasalocydu (Sigma) przygotowa-no bezporednio przed wykonaniem dowiadczenia. W tym celu antybiotyki zosta³y rozpuszczone w DMSO (Sigma). Z roztworu podstawowego sporz¹dzono roztwory robocze o po¿¹danym stê¿eniu, wykorzystuj¹c pod³o¿e hodowlane jako rozpuszczalnik. Po usuniêciu pod³o¿a hodowlanego ze stu-dzienek, umieszczono w nich roztwory testowanych substan-cji o ró¿nych stê¿eniach (8 powtórzeñ na ka¿de stê¿enie). Koñcowe stê¿enie DMSO w mieszaninie inkubacyjnej wy-nosi³o 0,25%. Po 24 i 48 godzinach inkubacji, przeprowa-dzono poszczególne testy w celu oceny dzia³ania cytotoksycz-nego badanych zwi¹zków.
Wykorzystano test MTT wg INVITTOX-u, protokó³ 17 (4). Po up³ywie 24 i 48 godzin inkubacji do hodowli komórko-wych dodano 10 µl roztworu MTT na studzienkê, a po na-stêpnych 3 godzinach dodano 100 µl 10% SDS w 0,01 N HCl/ studzienkê. Po 24 godzinach inkubacji dokonano odczytu
absorbancji przy d³ugoci fali l = 570 nm w automatycznym czytniku mikrop³ytek E-max (Molecular Devices Corp., Menlo Park, Ca, USA).
Test NRU (Neutral Red Upake) wykonano w oparciu o metodê INVITTOX, protokó³ 54 (3). Po up³ywie 24 i 48 godzin inkubacji w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 usuniêto roztwory, a do studzienek dodano po 100 µl roztwo-ru czerwieni obojêtnej. Po 3 godzinach inkubacji usuwano roztwór barwnika znad komórek i dodawano po 100 µl mie-szaniny elucyjnej. Po 30 min. inkubacji w temperaturze po-kojowej p³ytkê wytrz¹sano przez 5 minut i odczytywano absorbancjê przy d³ugoci fali l = 550 nm.
Test KB wykonano wg metody INVITTOX, protokó³ 3b (2). Po przeprowadzeniu wymienionych etapów inkubacyj-nych i usuniêciu mieszaniny elucyjnej, dodano po 100 µl roz-tworu Kenacid Blue. Po 10 minutach usuniêto nadmiar nie-zwi¹zanego barwnika KB, komórki dwukrotnie przep³ukano i przez 10 minut wytrz¹sano. Nastêpnie dodano 100 µl mie-szaniny desorbuj¹cej. Odczytu dokonano przy d³ugoci fali l = 600 nm.
Po przeprowadzonych inkubacjach wykonano równie¿ test umo¿liwiaj¹cy rozró¿nienie komórek nekrotycznych od apop-tycznych. Pod mikroskopem fluorescencyjnym przy d³ugoci fali 420 nm (filtr dla UV) komórki nekrotyczne wykazywa³y wobec jodku propidyny (Sigma) bladoró¿ow¹ fluorescencjê, natomiast barwa jasnoniebieska po dodaniu barwnika fluo-rochromowego (Hoechst 33342HO342) charakteryzowa³a komórki apoptyczne.
Badania mikroskopowe prowadzono po uprzednim barwie-niu preparatów z hodowli hepatocytów metod¹ May-Grünwal-da i Giemsy. Zmiany patomorfologiczne w komórkach wy-wo³ane dzia³aniem badanych jonoforów obserwowano pod mikroskopem wietlnym Olympus BX51 z zastosowaniem programu komputerowego analySISR.
Analizê statystyczn¹ przeprowadzono w oparciu o dwu-czynnikow¹ analizê wariancji ANOVA i test Tukeya.
Wyniki i omówienie
Zastosowane testy MTT, NRU i KB pozwoli³y na okrelenie cytotoksycznoci podstawowej obu badanych zwi¹zków w warunkach in vitro poprzez obliczenie wspó³czynników IC50 (ryc. 2 i 3). Ró¿ne wartoci IC50 w trzech zastosowanych testach wskazuj¹ na ró¿nego stopnia nasilenie dysfunkcji badanych procesów i/lub uszkodzeñ struktur subkomórkowych. Odnosi siê to do zaburzeñ metabolizmu mitochondrialnego (test MTT), syntezy bia³ka komórkowego i proliferacji (test KB) oraz uszkodzeñ b³on komórkowych hepatocytów (test NRU). Ekspozycja hodowli komórkowych na badane kokcy-diostatyki pozwoli³a na stwierdzenie pog³êbiaj¹cych siê efektów cytotoksycznych wraz z czasem jej wyd³u¿ania. W przypadku testu MTT po 48 godz. inkubacji wyniki IC50 by³y ni¿sze o 92,5% i 95,2% odpowiednio dla laza-locydu i salinomycyny w porównaniu do ich wartoci po 24 godz., co jest potwierdzone statystycznie istotnoci¹ ró¿nic miêdzy grupami. Podobnie przy porównaniu wy-ników uzyskanych w testach NRU i KB wykazano sta-tystycznie istotne ró¿nice miêdzy 24- i 48 godz. czasami inkubacji, jakkolwiek czas inkubacji wp³ywa³ w mniej-szym stopniu ni¿ w tecie MTT; wartoci te by³y ni¿sze o 35,6% i 51,3% w stosunku do 24 godz. inkubacji (ryc. 2, 3). Dane te wskazuj¹ na wra¿liwoæ wybranych
ele-Medycyna Wet. 2007, 63 (7) 841
mentów komórkowych najbardziej zaznaczonej dla mi-tochondriów miejsc docelowego dzia³ania badanych jo-noforów.
Równoczesne okrelenie IC50 dla thiuramu, fungicydu u¿ytego w celu porównawczym, pozwoli³o na pozytyw-n¹ kontrolê metodyki z uwagi na jego badanie w poprzed-niej pracy (13). Ponadto stwierdzono, i¿ si³a cytotokso-dynamiczna thiuramu mierzona wskanikiem IC50 w cza-sie 24- i 48-godzinnej inkubacji wynosi³a odpowiednio 2,4 ± 0,17-2,80 ± 0,12 µM i 1,7 ± 0,25-1,95 ± 0,23 µM (zakres wyników z testów MTT, NRU i KB ryc. 2, 3). Odpowiada³o to wskanikom cytotoksycznoci podsta-wowej salinomycyny w testach NRU i KB: 2,8 ± 0,88 µM i 2,95 ± 0,47 µM oraz 1,36 ± 0,53 µM i 1,67 ± 0,28 µM, a dane dla lazalocydu wynosi³y 8,35 ± 0,93 µM i 8,55 ± 0,45 µM oraz 4,9 ± 0,06 µM i 5,5 ± 0,33 µM, odpowiednio dla 24- i 48-godzinnych czasów inkubacji. Natomiast wyniki IC50 z testu MTT po 24 godz. inkuba-cji wynosi³y 2,4 ± 0,71 µM i 7,92 ± 0,17, obni¿aj¹c siê znacznie po 48 godz. inkubacji; do 0,11 ± 0,01 µM dla salinomycyny i 0,6 ± 0,03 µM lazalocydu (ryc. 2, 3).
Z wymienionych danych wynika, i¿ lazalocyd charak-teryzowa³ siê ni¿sz¹ cytotoksycznoci¹ (wy¿sze war-toci IC50 we wszystkich testach) w porównaniu z salino-mycyn¹ zarówno w 24-, jak i 48-godzinnej hodowli. Oznaczone wskaniki cytotoksycznoci podstawowej
koresponduj¹ z danymi pimiennictwa toksycznoci ostrej, LD50 dla szczura wynosi odpowiednio dla lazalo-cydu 122 mg/kg m.c., salinomycyny 50 mg/kg m.c. (15, 16). Natomiast w porównaniu z uzyskanymi wynikami badañ cytotoksycznoci monenzyny i narazyny w po-przednich badaniach (19), wystêpuj¹ ró¿nice wartoci IC50. Wielkoci te s¹ znacznie ni¿sze w porównaniu z salinomycyn¹ i lazalocydem. Dotyczy to w szczegól-noci wartoci IC50 testu MTT, w którym monenzynê cha-rakteryzowa³a cytotoksycznoæ przekraczaj¹ca o dwa rzêdy wielkoci odpowiadaj¹ce wyniki dla lazalocydu. Wskazuje to na du¿e ró¿nice miêdzy poszczególnymi lekami z grupy jonoforów w zakresie ukierunkowanej cytotoksycznoci wobec frakcji subcellularnych komó-rek docelowych. Wyniki te informuj¹ o dominuj¹cym efekcie toksodynamicznym wobec mitochondriów. Zwiêksza³ siê on w miarê wyd³u¿ania czasu nara¿enia na badane zwi¹zki (1, 11).
Oba antybiotyki nale¿¹ do grupy tzw. ruchomych jo-noforów, które, tworz¹c lipofilne kompleksy z jonami, przemieszczaj¹ siê wraz z nimi przez b³ony komórkowe. Doprowadza to do zaburzeñ w funkcjonowaniu b³on komórkowych, poci¹gaj¹c za sob¹ kaskadê przemian pro-wadz¹cych do zaburzeñ równowagi jonowej pomiêdzy wnêtrzem komórki i p³ynem miêdzykomórkowym. Utrud-niony transport kationów dwuwartociowych jest przy-czyn¹ zaburzeñ z dzia³aniu pompy sodowo-potasowej, obni¿enia produkcji ATP i zaburzeñ równowagi sodo-wo-wapniowej, który doprowadza do wzrostu stê¿enia jonów wapniowych wewn¹trz komórki (16). Zwiêkszo-ny nap³yw jonów wapnia zmusza mitochondria do ich magazynowania w celu utrzymania homeostazy. W mo-mencie prze³adowania mitochondriów wapniem nastê-puje zahamowanie fosforylacji oksydacyjnej, co prowa-dzi do mierci komórki (20). Mechanizm prowa-dzia³ania anty-biotyków jonoforowych doprowadza w konsekwencji do szybkiego zubo¿enia wewn¹trzkomórkowych zasobów energetycznych (ATP), za uszkodzenie struktur mito-chondrialnych prowadzi do mierci energetycznej ko-mórki.
Z drugiej strony, w rozwa¿aniach nad mechanizmem toksycznoci nale¿y braæ pod uwagê proces metabolizmu obu zwi¹zków katalizowanych przez enzymy mikroso-malne. Prowadziæ on mo¿e do powstania toksycznych metabolitów, w tym reaktywnych elektronofilnych i wolnorodnikowych pochodnych badanych antybioty-ków. Nale¿y przypuszczaæ, ¿e zmiany aktywnoci dehyd-rogenazy bursztynianowej, uwalnianej z uszkodzonych mitochondriów, mierzonej za pomoc¹ testu MTT mog¹ byæ równie¿ efektem tego drugiego mechanizmu indu-kowanego przez reaktywne metabolity (10).
Wykazano, ¿e mieræ komórek poddanych dzia³aniu salinomycyny i lazalocydu by³a natury apoptycznej. Wskazuje na to ryc. 4., na której jasnoniebieska fluo-rescencja hepatocytów poddanych dzia³aniu jonoforów w ilociach oznaczonych wartociami IC50 wiadczy o ich na apoptozie. O apoptozie lub nekrozie komórki decyduje poziom jej zasobów energetycznych, co zwi¹-zane jest z aktywnoci¹ metaboliczn¹ mitochondriów. W wyniku uszkodzenia b³on komórkowych przez anty-biotyki jonoforowe dochodzi do obni¿enia b³onowego
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
MTT IC50 NRU IC50 KB IC50
Metody W artoœci IC50 Inkubacja 24 h Inkubacja 48 h 0 2 4 6 8 10 W artoœci IC50
MTT IC50 NRU IC50 KB IC50
Metody
Inkubacja 24 h Inkubacja 48 h
Ryc. 2. rednie wartoci IC50 (µM) salinomycyny oznaczane
za pomoc¹ testów MTT, NRU KB w czasie 24- i 48-godzinnej inkubacji hepatocytów
Objanienie: ** ró¿nica statystycznie istotna (p < 0,01)
Ryc. 3. rednie wartoci IC50 (µM) lazalocydu wyznaczone za
pomoc¹ testów MTT, NRU KB w czasie 24- i 48-godzinnej inkubacji hepatocytów
Medycyna Wet. 2007, 63 (7) 842
potencja³u mitochondrialnego. Prowa-dzi to do spadku poziomu ATP, który odgrywa istotn¹ rolê w procesie mier-ci komórki. Z drugiej strony, o charak-terze mierci, apoptycznej lub nekro-tycznej, komórki decyduje rodzaj i daw-ka czynnidaw-ka indukuj¹cego cytotoksycz-noæ, czas jego ekspozycji na komórki oraz rodzaj komórek poddanych dzia-³aniu tego czynnika (10, 17). W kon-sekwencji apoptozê i/lub nekrotycznej mo¿e indukowaæ ten sam czynnik. Qian (17) zaobserwowa³ nekrotyczn¹ mieræ komórek w¹trobowych pod wp³ywem dzia³ania Br-A23187. Odmienne spo-strze¿enia poczynili inni autorzy, roz-poznaj¹c apoptyczny mechanizm mier-ci hepatocytów wywo³anej przez monenzynê (18). Wykonane badanie mikroskopowe komórek w¹troby inku-bowanych z dodatkiem badanych jono-forów w stê¿eniu obni¿aj¹cym o 50% oznaczane wskaniki cytotoksycznoci w porównaniu z kontrol¹, pozwoli³o za-obserwowaæ zmniejszenie wymiarów hepatocytów, ale zachowywa³y one swoj¹ typow¹ budowê. Stwierdzono tak¿e obecnoæ komórek o zmienionym, wyd³u¿onym kszta³cie. Ponadto
obser-wowano zbite ich masy, wykazuj¹ce cechy obrzmienia i zatart¹ budowê komórkow¹ (ryc. 5).
Podsumowuj¹c wyniki przeprowadzonych badañ an-tybiotyków jonoforowych w hodowlach jednowarstwo-wych hepatocytów szczurzych nale¿y stwierdziæ, i¿ oka-za³y siê one przydatnym modelem do badañ cytotoksycz-noci podstawowej salinomycyny i lazalocydu oraz mon-enzyny i narazyny w poprzednich badaniach (19). Wy-kazano odmienne dzia³anie uszkadzaj¹ce badanych jo-noforów, które zaburza³y w ró¿nym stopniu funkcjono-wanie struktur subkomórkowych hepatocytów linii FAO szczura. Ocenê umo¿liwi³o zastosowane techniki in vitro z ustalonymi stê¿eniami substancji na poziomie wy-wo³ywanych po³owicznych efektów cytotoksycznych, IC50. Cytotoksykologiczna ocena czterech przebadanych jonoforów pozwoli³a na wskazanie lazalocydu jako naj-bezpieczniejszego z uwagi na jego najwy¿sze wartoci IC50, aczkolwiek wykazywa³ on dzia³anie apoptyczne i doprowadza³ do zmian morfotycznych badanych hepa-tocytów w hodowlach komórkowych.
Uzyskane wyniki stanowi¹ podstawê dalszych badañ zmierzaj¹cych rozpoznania dzia³ania rodków ochron-nych/detoksykacyjnych w przypadku leczniczego stoso-wania antybiotyków jonoforowych. Wymaga to wpro-wadzenia badañ in vitro z zastosowaniem komórek zwierz¹t docelowych, a tak¿e weryfikacji tych wyników dowiadczeniami in vivo w warunkach prowadzonej te-rapii.
Pimiennictwo
1.Aouad N., Miquel-Mercier G., Bienveniie E.: Lasalocid (X537A) as a selective carrier for Cd(II) in supported liquid membranes. J. Membr. Sci. 1998, 139, 167-174.
2.Anon.: INVITTOX The ERGATT/FRAME Data Bank of In Vitro Techniques in Toxicology The FRAME cytotoxicity test (Kenacid Blue) 1992, Nr 3b. 3.Anon.: INVITTOX The ERGATT/FRAME Data Bank of In Vitro Techniques
in Toxicology The Neutral Red cytotoxicity assay 1992, Nr 54.
4.Anon.: INVITTOX The ERGATT/FRAME Data Bank of In Vitro Techniques in Toxicology MTT assay 1990, Nr 17.
5.Anon.: Rozporz¹dzenie Komisji (WE) Nr 2037/2005 z dnia 14 grudnia 2005 r. 6.Anon.: Rozporz¹dzenie Komisji (WE) Nr 2037/2005 z dnia 13 lutego 2006 r. 7.Anon.: Ustawa z dnia 22 lipca 2006 r. o paszach. Dz. U. 2006, Nr 144, poz. 1045. 8.Anon.: Zalecenie Urzêdu Nadzoru EFTA Nr 59/05/COL z dnia 5 kwietnia 2005 r. w sprawie skoordynowanego programu inspekcji w zakresie ¿ywienia zwierz¹t na 2005 r.
9.Harris J., Russell Ch., Wilkins J.: The characterization of polyether ionophore veterinary drugs by HPLC-electrospray MS. Analyst. 1998, 123, 2625-2628. 10.Kowaltowski A., Vercesi A.: Mitochondrial damage induced by conditions of
oxidative stress. Free Radic. Biol. Med. 1999, 26, 463-471.
11.Matabudul D., Conway B., Lumley I., Sumar S.: The simultaneous determina-tion of the ionophore antibiotics in animal tissues and eggs by tandem electro-spray LC-MS-MS. Food Chemistry 2001, 75, 345-354.
12.Mitani M., Yamanishi T., Miyazaki Y.: Salinomycin effects on mitochondria ion translocation and respiration. Antimicrob. Agents Chemother. 1976, 9, 655-660. 13.Muzyczuk-Piekarska A., Kowalska-Py³ka H., Cybulski W., Rzeski W.: Ocena cytotoksycznego dzia³ania fungicydów o budowie banztioanilidów. Medycyna Wet. 2004, 60, 1124-1128.
14.Nicpoñ J., Czerw P.: Patogeneza, diagnostyka i terapia zatruæ salinomycyn¹ u koni. Medycyna Wet. 1995, 51, 659-662.
15.Novilla M.: The veterinary importance of the toxic syndrome induced by iono-phores. Vet. Hum. Toxicol. 1992, 34, 66-70.
16.Oehme F., Pickrell J.: Ananalysis of the chronic oral toxicity of polyether iono-phore antibiotics in animals. Vet. Hum. Toxicol. 1999, 41, 251-257.
17.Oh K., Qian T., Brenner D.: Salicylate enhances necrosis and apoptosis media-ted by the mitochondrial permeability transition. Toxicol. Sci. 2003, 73, 44-52. 18.Park W., Seol J., Kim E., Kang W., Im Y., Jung Ch., Lee Y.: Monensin-mediated growth inhibition in human lymphoma cells through cell cycle arrest and apo-ptosis. Br. J. Haematol. 2002, 119, 400-409.
19.Radko L., Cybulski W., Wessely-Szponder J., Rzeski W.: Badania cytotoksycz-noci monenzyny i narazyny w hodowli linii ci¹g³ej hepatocytów szczura. Me-dycyna Wet. 2006, 62, 834-836.
20.¯mudzki J.: Zatrucia kokcydiostatykami. Mat. sesji nauk.: Kokcydiostatyki zakres i bezpieczeñstwo stosowania. Pu³awy 1997, s. 17-19.
21.¯mudzki J., Kozak A., Winiewska-Dmytrow H.: Pozosta³oci lasalocydu w tkan-kach drobiu. ¯ycie Wet. 1994, 69, 242-244.
Adres autora: lek. wet. Lidia Radko, ul. Akademicka 12, 21-950 Lublin; e-mail: lidia@radko.pl
Ryc. 4. Obraz fluorescencji hepatocytów (pow. × 200) poddanych dzia³aniu sali-nomycyny i lazalocydu w ilociach okrelonych jako rednie IC50 z trzech testów
(MTT, NRU, KB) (barwienie za pomoc¹ jodku propiolinowego i Hoechst 33342) Objanienia: A kontrola; B dzia³anie salinomycyny; C dzia³anie lazalocydu
Ryc. 5. Obraz hepatocytów (pow. 400 ×) poddanych dzia³aniu salinomycyny i la-zalocydu w ilociach okrelonych jako rednie IC50 z trzech testów (MTT, NRU,
KB) (barwienie metod¹ May-Grünwalda-Giemsy) Objanienia: jak na ryc. 4.
