Adriana Janczura | Grażyna Gościniak
Rola enterotoksyn pałeczek Gram-ujemnych
w zakażeniach przewodu pokarmowego
The role of Gram-negative rods enterotoxins in alimentary tract infections
Katedra i Zakład Mikrobiologii Akademii Medycznej im. Piastów Śląskich we Wrocławiu} Adriana Janczura, Katedra i Zakład Mikrobiologii Akademii Medycznej we Wrocławiu, ul. Chałubińskiego 4, 50-368 Wrocław, Tel.: (71) 784 12 99, Fax: (71) 784 01 17, e-mail: adriana.janczura@mbio.am.wroc.pl
Wpłynęło: 05.09.2011 Zaakceptowano: 16.09.2011
Streszczenie: Wśród najczęstszych czynników etiologicznych
bakteryjnych zakażeń przewodu pokarmowego, zarówno w Pol-sce, jak i na świecie, znajdują się pałeczki Gram-ujemne, takie jak
Escherichia coli (patotypy ETEC, EPEC, EAEC, EHEC, EIEC), Salmonel-la spp, Shigella spp., Yersinia spp. Drobnoustroje te są zdolne do
wytwarzania enterotoksyn działających poprzez różnorodne me-chanizmy, odpowiedzialne za wywoływanie biegunek. Łatwość przekazywania genów wirulencji kodujących enterotoksyny pomiędzy pałeczkami Gram-ujemnymi powoduje, że bakteryjne zakażenia przewodu pokarmowego są ważnym problemem kli-nicznym, zarówno w krajach rozwijających się, jak i rozwiniętych.
Słowa kluczowe: enterotoksyny | pałeczki Gram-ujemne |
zakaże-nia przewodu pokarmowego
Abstract: The Gram-negative rods, such as Escherichia coli (ETEC,
EPEC, EAEC, EHEC, EIEC pathotypes), Salmonella spp., Shigella spp.,
Yersinia spp. belong to the most frequent etiological factors of
alimentary tract infections. These pathogens are able to produce enterotoxins of different activity, responsible for diarrheas. En-terotoxins – encoding virulence genes may be easily transferred between Gram-negative rods, thus bacterial alimentary tract in-fections are important clinical problems in developing and devel-oped countries.
Key words: alimentary tract infections | enterotoxins |
Gram-neg-ative rods
klinicznymi, jak brak łaknienia, nudności, wymioty, bie-gunka o różnym nasileniu, bóle brzucha czy podwyższona temperatura ciała [2]. Najbardziej uporczywym objawem z punktu widzenia pacjenta jest biegunka, czyli stan, w któ-rym pacjent oddaje stolce o nadmiernie luźnej konsystencji (płynne lub półpłynne) w zwiększonej ilości (200 g na dobę) i z większą częstotliwością (>3 razy na dobę). W zależności od czasu trwania biegunki wyróżnia się biegunkę ostrą (≤14 dni) i przewlekłą (>4 tygodni). Biegunka powstaje w wyni-ku upośledzenia wchłaniania lub zwiększenia wydzielania elektrolitów i wody, zarówno w jelicie cienkim, jak i jelicie grubym [3].
Czynniki wirulencji patogenów jelitowych
Drobnoustroje określane mianem patogenów jelitowych, posiadają szereg cech umożliwiających im zakażenia prze-wodu pokarmowego. Patogeny te zdolne są nie tylko do kolonizacji jelita i współzawodnictwa z innymi drobno-ustrojami o składniki odżywcze, ale także do oddziaływa-nia na docelowe komórki eukariotyczne, prowadzącego do wydzielania wody i elektrolitów. Oddziaływanie to zachodzi za pośrednictwem inwazji lub wytwarzania toksyn, między innymi enterotoksyn [4].Enterotoksyny są egzotoksynami, których działanie ogranicza się wyłącznie do przewodu pokarmowego i może doprowadzić do biegunki. Biorąc pod uwagę wpływ ente-rotoksyn na komórki eukariotyczne, możemy podzielić je na działające cytotonicznie, tzn. zaburzające metabolizm komórkowy, ale nie prowadzące do śmierci komórki, oraz cytotoksyczne – odpowiedzialne za śmierć komórki [5].
Znakomita większość enterotoksyn wytwarzana jest przez pałeczki Gram-ujemne, takie jak Escherichia coli (pa-totypy ETEC, EPEC, EAEC, EHEC, EIEC), Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp., które należą do najczęstszych czynników etiologicznych bakteryjnych zakażeń przewodu pokarmowego, zarówno w Polsce, jak i na świecie [1].
Wstęp
Zakażenia przewodu pokarmowego z towarzyszącą bie-gunką stanowią problem o charakterze globalnym. Co roku odnotowuje się ponad bilion przypadków tych zakażeń, prawie 2 miliony z nich kończą się śmiercią [1]. Zakażenia przewodu pokarmowego wywołane są przez kolonizującą przewód pokarmowy patologiczną lub fizjologiczną flo-rę jelitową oraz wirusy i objawiają się takimi symptomami
jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.
norodne. Mogą one aktywować przekaźnictwo sygnałowe enterocytów, tworzyć kanały przezbłonowe, hamować lub indukować wytwarzanie białek, czy oddziaływać na cytosz-kielet enterocytów [4, 6].
Charakterystyka enterotoksyn
wytwarzanych przez pałeczki
Gram-ujemne
Przykłady enterotoksyn działających poprzez opisane ni-żej mechanizmy wymienione są w Tabeli 1.
Toksyny aktywujące przekaźnictwo sygnałowe
w enterocytach
Najczęstszym mechanizmem działania enterotoksyn pro-dukowanych przez pałeczki Gram-ujemne jest aktywacja związków, które mają kluczowe znaczenie w regulacji go-spodarki wodno-elektrolitowej w komórkach enterocytów. Wpływa to na zaburzenie prawidłowych czynności komórek nabłonkowych wyścielających przewód pokarmowy i dopro-wadza do wywołania wodnistej biegunki bez elementów krwi.
(cAMP)
Aktywacja szlaku przekaźnikowego cAMP przez ente-rotoksyny jest pierwszym opisanym i najlepiej poznanym procesem aktywacji przekaźnictwa sygnałowego w komór-kach eukariotycznych, prowadzącym do indukcji wydziela-nia jelitowego. W regulację tego procesu zaangażowanych jest wiele fizjologicznych modulatorów, takich jak neuro-transmitery, hormony i substancje parakrynne. Drogę tę aktywują również patogeny jelitowe, które wytwarzają cie-płochwiejne enterotoksyny, tzw. toksyny A-B. Do znanych enterotoksyn działających na drodze aktywacji cAMP na-leżą: toksyna cholery, toksyna LT Escherichia coli, entero-toksyna wytwarzana przez szczepy Salmonella czy Shigella dysenteriae [7]. Po związaniu z naturalnym receptorem gan-gliozydowym komórki gospodarza, toksyna ulega internali-zacji. W retikulum endoplazmatycznym dochodzi do enzy-matycznego rozcięcia cząsteczki toksyny, po czym jej część aktywna przenoszona jest do kompleksu cyklaza adenylowa/ białko G, zlokalizowanego na błonie podstawnej komórek nabłonka jelitowego. Następnie aktywna toksyna katalizu-je NAD-zależną ADP-rybozylację białka G (białko wiążące ATP, zaangażowane w regulację cyklazy adenylowej),
sty-Mechanizm działania enterotoksyn Przykłady enterotoksyn Toksyny aktywujące przekaźnictwo
sygnałowe w enterocytach
Aktywujące cykliczny AMP: t 5PLTZOBDIPMFSZ $5 t $JFQPDIXJFKOBFOUFSPUPLTZOBEscherichia coli (LT), t &OUFSPUPLTZOBSalmonella typhimurium, t &OUFSPUPLTZOB"Pseudomonas aeruginosa, t &OUFSPUPLTZOBShigella dysenteriae Aktywujące cykliczny GMP: t $JFQPTUBBFOUFSPUPLTZOBEscherichia coli (ST), t &OUFSPUPLTZOZ45*J45**Yersinia enterocolitica, t &OUFSPUPLTZOBYersinia bercovieri, t &OUFSPUPLTZOBKlebsiella pneumoniae,
t $JFQPTUBBFOUFSPUPLTZOBVibrio cholerae non-O1, t $JFQPTUBBFOUFSPUPLTZOBFOUFSPBHSFHBDZKOZDI
Escherichia coli (EAST1)
Aktywujące jony wapniowe:
Ciepłostała bezpośrednia hemolizyna Vibrio
parahaemo-lyticus (TDH)
Aktywujące tlenek azotu:
t &OUFSPUPLTZOBShigella flexneri (ShET1) Toksyny tworzące kanały
przezbło-nowe
Cytolizyna Vibrio cholerae
Toksyny hamujące wytwarzanie białek Toksyna Shiga Shigella dysenteriae Toksyna Shiga-like EHEC (SLT1) i (SLT2) Toksyny indukujące wytwarzanie
białek
Toksyna EAggEC
Toksyny oddziaływujące na cytoszkie-let enterocytów
Cytotoksyczny czynnik martwiczy 1 Escherichia coli (CNF 1) Toksyna Zot Vibrio cholerae
Białko kodowane plazmidowo EAggEC (PET) Toksyna Bacteroides fragilis (BFT)
Ciepłostała bezpośrednia hemolizyna Vibrio
parahaemo-lyticus (TDH)
Tabela 1. Enterotoksyny wytwarzane przez pałeczki Gram-ujemne.
go cAMP. Wzrost stężenia tej cząsteczki aktywuje cAMP-za-leżną kinazę białkową A, co prowadzi do ponadnormalnej fosforylacji kanałów chlorkowych zlokalizowanych na bło-nie szczytowej komórek kosmków. Wynikiem nadmiernej fosforylacji jest stymulacja wydzielania chlorków (Cl-)
z ko-mórkowych krypt wydzielniczych i zahamowanie absorpcji Na+ z komórek szczytowych kosmków. Wzrost zawartości
jonów w świetle jelita przyciąga biernie wodę, prowadząc do osmotycznej biegunki [8, 9].
Toksyny aktywujące cykliczny guanozynomonofosforan (cGMP)
Do enterotoksyn aktywujących przekaźnictwo sygnałowe za pomocą cGMP należy przede wszystkim rodzina małych ciepłostałych enterotoksyn (ST), wytwarzanych przez ente-rotoksynogenne szczepy Escherichia coli, pałeczki Klebsiel-la czy Yersinia enterocolitica, ale również toksyna EAST1 – początkowo odkryta u enteroagregacyjnych szczepów E. coli [4]. Mechanizm działania opiera się na związaniu tok-syny z zewnątrzkomórkową domeną receptora, jakim jest cyklaza guanylowa C (GC-C) zlokalizowana na szczytowej części nabłonka jelitowego. Reakcja ta stymuluje wewnątrz-komórkową aktywność enzymatyczną toksyny, następuje pobudzenie cyklazy guanylowej C, prowadząc do wzrostu poziomu cyklicznego guanozynomonofosforanu (cGMP), co następnie aktywuje kaskadę kinaz białkowych zależnych od cyklicznego GMP. W wyniku wzrostu cGMP dochodzi do fosforylacji i aktywacji kanałów chlorkowych CFTR (ang. cystic fibrosis transmembrane regulator). Końcowy efekt działania szlaku zapoczątkowanego przez enterotok-syny (zaburzenie działania pomp jonowych, sekrecja jonów chlorkowych lub zahamowanie absorpcji NaCl) prowadzi do sekrecji wody do światła jelita. Efektem tego procesu jest wystąpienie wodnistej biegunki bez krwi [4, 8, 10].
Toksyny aktywujące jony wapniowe
Wewnątrzkomórkowe jony wapnia są głównym regulato-rem transportu elektrolitów, zarówno w jelicie cienkim, jak i jelicie grubym. Toksyna wytwarzana przez pałeczki Vibrio parahaemolyticus posiada zdolność do wiązania się z recep-torem gangliozydowym GT1b na powierzchni enterocytów i aktywacji fosfolipazy C za pośrednictwem białka G. Enzym ten katalizuje reakcję hydrolizy dwufosoforanu fosfatydylo-inozytolu, prowadzącej do powstania trójfosforanu inozyto-lu (IP3) i diacylogliceroinozyto-lu (DAG). Obecność IP3 prowadzi do wzrostu stężenia wapnia w komórce na skutek uwolnie-nia wewnątrzkomórkowych rezerw tego jonu (tzw. „rezerw niemitochondrialnych”) oraz poprzez stymulację wnikania do cytoplazmy wapnia zewnątrzkomórkowego. Drugi pro-dukt hydrolizy dwufosforanu fosfatydyloinozytolu –
diacy-pidów białkową kinazę wapniową C (ang. protein kinase C – PKC). Podniesiony poziom wapnia w komórce prowadzi do zahamowania absorpcji jonów Na+ i Cl-, stymuluje
sekre-cję anionów i moduluje zarówno szczytowe, jak i podstawne przewodnictwo potasu w błonie. W wyniku tego następuje nagromadzenie płynu w świetle jelita i wystąpienie biegun-ki [7, 11].
Toksyny aktywujące tlenek azotu (NO)
Rola tlenku azotu w płynie jelitowym oraz równowa-dze elektrolitowej zmienia się w zależności od warunków, przy których zachodzi aktywacja wydzielania tego związku. W warunkach fizjologicznych tlenek azotu pobudza wchła-nianie, angażując w to jelitowy system nerwowy, działając hamująco na powstawanie prostaglandyn oraz otwiera-jąc kanały potasowe. Działanie enterotoksyn ShET1 oraz ShET2 wytwarzanych przez szczepy Shigella flexneri prowa-dzi do nadmiernej produkcji syntazy tlenku azotu i aktywa-cji jego wydzielania, co zaburza transport elektrolitów oraz wody i działa jako stymulator sekrecji, a w efekcie wywołuje biegunkę [4, 12].
Toksyny tworzące kanały przezbłonowe
Ten mechanizm działania występuje dość rzadko wśród enterotoksyn wytwarzanych przez pałeczki Gram-ujemne. Do toksyn działających w ten sposób zaliczyć można cyto-lizynę, tzw. ciepłochwiejną hemolizynę (HlyA), wytwarzaną przez szczepy Vibrio cholerae, biotyp El Tor. Cytolizyna ta wiąże się specyficznie zarówno z cholesterolem, jak i sfin-golipidami obecnymi na rąbku szczoteczkowym enterocy-tów gospodarza, co ułatwia jej oligomeryzację, a przez to tworzenie kanałów przezbłonowych, przez które wyciekają: woda, jony, nukleotydy, aminokwasy [13].
Toksyny hamujące wytwarzanie białek
Wśród toksyn działających poprzez hamowanie syn-tezy białek możemy wyróżnić dwie bardzo niebezpieczne toksyny: toksynę Shiga wytwarzaną przez szczepy Shigella dysenteriae oraz werotoksynę wytwarzaną przez enterokr-wotoczne szczepy E. coli. Obie toksyny mają budowę po-dobną np. do toksyny cholery, lecz działają w inny sposób. Podjednostka A tych toksyn wiąże się z powierzchnią gli-kolipidowego receptora na powierzchni enterocytów go-spodarza, a następnie inaktywuje podjednostkę 60S w ry-bosomach, co hamuje syntezę białek komórkowych [14]. Receptor glikolipidowy (Gb3) ulega największej ekspresji na ludzkim śródbłonku naczyń krwionośnych nerek oraz jelit. Głównym celem obu toksyn są komórki śródbłonko-we okrężnicy, gdzie ich aktywność prowadzi do
krwotocz-rych obecność enterotoksyn prowadzić może do zespołu hemolityczno-mocznicowego [15].
Toksyny indukujące wytwarzanie białek
Regulacja syntezy białek, szczególnie mediatorów proza-palnych, odpowiedzialnych za procesy zapalne oraz wydziel-nicze jelit, jest jednym z mechanizmów doprowadzających do wywołania biegunki. Zaobserwowano, że w przypadkach biegunek związanych z enteroagregacyjnymi szczepami E. coli wzrasta poziom laktoferryny i interleukiny 8 (IL-8). Szczepy te wytwarzają związek, który powoduje dodatnią regulację syntezy tych białek [16].
Toksyny oddziaływujące na cytoszkielet
enterocytów
Cytotoksyczny czynnik nekrotyzujący 1 E. coli (CNF- 1) inaktywuje białka z rodziny Rho, które odpowiedzialne są za regulację wielu funkcji komórkowych związanych ze szkie-letem komórkowym oraz zwiększa przepuszczalność barie-ry jelitowej, co prowadzi w efekcie do biegunki [17]. Z kolei toksyna Zot Vibrio cholerae powoduje wzrost przepuszczal-ności jelitowej poprzez interakcję z receptorem w komór-kach gospodarza. Aktywacja wewnątrzkomórkowej drogi przekazywania sygnału prowadzi do rozszczelnienia barie-ry jelitowej i biegunki [18]. Natomiast toksyna PET (ang. plasmid encoded protein), wytwarzana przez enteroagrega-cyjne szczepy E. coli (EAggEC), indukuje proces kurczenia się szkieletu komórkowego i utraty napięcia włókien akty-nowych [19]. Enterotoksyna wytwarzana przez Bacteroides fragilis, czyli beztlenową pałeczkę Gram-ujemną, zmienia szczelność bariery jelitowej i przepuszczalność jelit poprzez specyficzne rozcinanie zewnątrzkomórkowej domeny ka-dheryny E, białka odpowiedzialnego za przyleganie do siebie komórek nabłonkowych [20]. Toksyna TDH (ang. thermo-stable direct haemolysin) Vibrio parahaemolyticus wywołuje zmiany w cytoszkielecie enterocytów poprzez reorganiza-cję w sieci mikrotubul komórkowych, odpowiedzialnych za transport wewnątrzkomórkowy oraz biorących udział w czasie podziału komórki. Wszelkie zmiany w cytoszkiele-cie enterocytów powodują zaburzenia w przepuszczalności jelit i doprowadzają do wywołania biegunki [21].
Skąd patogeny jelitowe nabywają geny
kodujące enterotoksyny?
Geny zjadliwości bakterii patogennych, które kodują toksyny działające w oparciu o powyższe mechanizmy, są nabywane za pośrednictwem ruchomych elementów
gene-datkowo takie geny mogą być częścią pewnych regionów na chromosomie bakteryjnym określanych jako „wyspy pato-genności” (ang. pathogenicity islands). Regiony te zawierają sekwencje DNA umożliwiające przyłączenie bakteriofagów, co dowodzi, że geny znajdujące się na wyspach patogenno-ści były zdolne do rozszerzania się wśród populacji bakte-ryjnej poprzez horyzontalny transfer genów, czyli proces, który bierze udział w ewolucji drobnoustrojów.
Podsumowanie
Powierzchnia nabłonka jelitowego stanowi największą w ciele ludzkim granicę oddzielającą wnętrze organizmu od środowiska zewnętrznego, a zarazem największą przestrzeń, przez którą dochodzi do absorpcji i wydzielania różnego typu cząsteczek. W regulacji przepuszczalności nabłonka główną rolę odgrywają ścisłe połączenia międzykomór-kowe, w których dochodzi do przemieszczania się płynów i roztworów. Dawniej sądzono, że połączenia międzyko-mórkowe są jedynie spoiwem służącym do zewnątrzko-mórkowego wydzielania i tworzą barierę pozbawioną moż-liwości regulacji. Obecnie istnieją niepodważalne dowody ukazujące dynamiczny charakter tej struktury, która bardzo szybko dostosowuje się do zmian w środowisku, zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych.
O rozwoju zakażenia przewodu pokarmowego decydu-ją przede wszystkim czynniki związane z drobnoustrojem, takie jak patogenność, inwazyjność czy dawka zakażająca. Aby patogen jelitowy mógł wywołać biegunkę, powinien charakteryzować się silnymi właściwościami adhezyjnymi i zdolnościami kolonizacyjnymi, a ponadto być zdolny do współzawodnictwa z innymi drobnoustrojami o składniki odżywcze. Poza wyżej wymienionymi podstawowymi ce-chami umożliwiającymi przeżycie i rozwój w specyficznym środowisku jelita, patogeny wywołujące zakażenia przewo-du pokarmowego charakteryzują się zdolnością do interak-cji z docelowymi komórkami eukariotycznymi. Komunika-cja pomiędzy patogenami jelitowymi a jelitem gospodarza może być aktywowana poprzez inwazję drobnoustroju albo wytwarzanie enterotoksyn, których działanie uruchamia wewnątrzkomórkowe szlaki eukariotyczne i prowadzi w efekcie do wydzielania jelitowego. Pałeczki Gram-ujemne wytwarzają szereg enterotoksyn o różnorodnych mechani-zmach działania i zdolnych do wywołania biegunki, najczę-ściej wodnistej, czasem z domieszką śluzu i krwi. Łatwość przekazywania genów wirulencji kodujących enterotoksyny pomiędzy tymi drobnoustrojami powoduje, że bakteryjne zakażenia przewodu pokarmowego są nadal ważnym pro-blemem klinicznym na całym świecie.
1. Cheng AC, McDonald JR, Thielman NM. Infectious diarrhea in developed and developing countries. J Clin Gastroenterol 2005;39(9):757–773. 2. Yamada T. Podręcznik Gastroenterologii. 1st edn. Wydawnictwo Czelej,
Lu-blin, 2006.
3. Szczeklik A. Choroby wewnętrzne. 1st edn. Medycyna Praktyczna, Kraków,
2005.
4. Fasano A. Toxins and the gut: role in human disease. Gut 2002;50(Suppl. 3): iii9–iii14.
5. Alouf JE, Popoff MR. The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins. 3rd edn. Elsevier, Academic Press, Amsterdam, 2006.
6. Berkes J, Viswanathan VK, Savkovic SD, Hecht G. Intestinal epithelial re-sponses to enteric pathogens: effects on the tight junction barrier, ion transport, and inflammation. Gut 2003;52(3):439–451.
7. Fasano A. Cellular microbiology: can we learn cell physiology from micro-organisms? Am J Physiol Cell Physiol 1999;276(4):C765–C776.
8. Nataro JP, Kaper JB. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev 1998;11(1):142–201.
9. Spangler BD. Structure and function of cholera toxin and the related
Esche-richia coli heat-labile enterotoxin. Microbiol Rev 1992;56(4):622–647.
10. Nair GB, Takeda Y. The heat-stable enterotoxins. Microb Pathog 1998;24(2):123–131.
11. Donowitz M. Ca2+ in the control of active intestinal Na and Cl transport:
involvement in neurohumoral action. Am J Physiol 1983;245(2):165–177. 12. Izzo AA, Mascolo N, Capasso F. Nitric oxide as a modulator of intestinal
water and electrolyte transport. Dig Dis Sci 1998;43(8):1605–1620.
14. Popoff MR. Interaction between bacterial toxin and intestinal cells. Toxi-con 1998;36(4):665–685.
15. Obrig TG, Louise CB, Lingwood CA, Boyd B, Barley-Maloney L, Daniel TO. Endothelial heterogeneity in Shiga toxin receptors and responses. J Biol Chem 1993;268(21):15484–15488.
16. Steiner TS, Lima AA, Nataro JP, Guerrant RL. Enteroaggregative
Escheri-chia coli produce intestinal inflammation and growth impairment and
cause interleukin-8 release from intestinal epithelial cells. J Infect Dis 1998;177(1):88–96.
17. Schmidt G, Sehr P, Wilm M, Selzer J, Mann M, Aktories K. Gln63 of Rho is deamidated by Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor 1. Nature 1997;387(6634):725–729.
18. Fasano A, Fiorentini C, Donelli G et al. Zonula occludens toxin (ZOT) mo-dulates tight junctions through protein kinase C-dependent actin reorga-nization, in vitro. J Clin Invest 1995;96(2):710–720.
19. Navarro-Garcia F, Sears C, Eslava C, Cravioto A, Nataro JP. Cytoskeletal ef-fects induced by PET, the serine protease enterotoxin of enteroaggregati-ve Escherichia coli. Infect Immun 1999;67(5):2184–2192.
20. Wu S, Lim KC, Huang J, Saidi RF, Sears CL. Bacteroides fragilis enterotoxin cleaves the zonula adherens protein, E-cadherin. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95(25):14979–14984.
21. Fabbri A, Falzano L, Frank C et al. Vibrio parahaemolyticus thermostable direct hemolysin modulates cytoskeletal organization and calcium home-ostasis in intestinal cultured cells. Infect Immun 1999;67(3):1139–1148.
