Mutacje dynamiczne w chorobach zwyrodnieniowych układu nerwowego

Postępy Psychiatrii i Neurologii, 1997, 6, 49--60

Mutacje dynamiczne w chorobach zwyrodnieniowych

układu

nerwowego

Dynamie mutations in degenerative diseases oj the nervous system DOROTA HOFFMAN-ZACHARSKA

Z Zakładu Genetyki IPiN w Warszawie

STRESZCZENIE. W pracy omówiono istotę

mu-tacji dynamicznych, przypuszczalny mechanizm ich powstawania oraz ich znaczenie w patogenezie nie-których procesów zwyrodnieniowych układu ner-wowego. Przedstawiono dokladniej amplifikację określonych sekwencji trójnukleotydowych w kilku chorobach (red.).

SUMMARY. The nature of dynamie mutations,

their presumable underlying mechanism, as we!! as their role in the pathogenesis of some degenerative diseases o f the nervous system are discussed in the paper. More attention is devoted to amplification of selected trinucleotide sequences in several dis-eases (ed.).

Słowa kluczowe: choroby zwyrodnieniowe o.u.n.

l

mutacje dynamiczne

Key words: degenerative diseases of the CNS

l

dynamie mutations

W ostatnich latach neurogenetyka moleku-larna rozwinęła się w jedną z bardziej aktyw-nych i obiecujących gałęzi neurobiologii. Jest to nowa dziedzina wykorzystująca techniki nowoczesnej genetyki molekularnej w bada-niach klasycznych schorzeń neurologicznych o charakterze dziedzicznym, określanych mia-nem "chorób neurogenetycznych" i definio-wanych jako kliniczne jednostki chorobowe, powodowane defektem jednego lub większej ilości genów, prowadzącym do zaburzenia różnicowania i funkqji neuroektodermy oraz jej pochodnych [Muller i wsp. 1994].

Choroby neurogenetyczne mogą być wy-nikiem zaburzenia prawidłowej ekspresji ge-nu w neuroektodermie (typ I: wiele kla-sycznych dziedzicznych chorób zwyrodnie-niowych, nerwowo-mięśniowych i zaburzeń · rozwojowych mózgu), lub ich neurologiczny charakter może być powodowany pośrednio przez defekt genu nie ulegającego ekspresji w tkance nerwowej (typ II: choroby meta-boliczne oraz dysplazje kostne z objawami neurologicznymi). Pod względem podłoża

genetycznego można podzielić je na cztery grupy [Muller i wsp. 1994]:

(l) grupa chorób powodowanych przez tzw. mutacje dynamiczne, czyli zwie-lokrotnienie sekwencji trójnukleoty-dowych w obrębie genów (np. choro-ba Huntingtona, bezład rdzeniowo--móżdżkowy, dystrofia miotoniczna, zespół kruchego chromosomu X), (2) choroby związane z wystąpieniem

de-lecji lub disomiemości jednorodzi-cielskiej (np. dystrofia Duchenne'a--Beckera, zespół Pradera i Willego--Algemana, zespół Millera-Dieker), (3) grupa chorób powodowanych głównie

wystąpieniem mutacji punktowych (leukodystrofie sprzężone z chromo-somem X, choroba Charcot-Marie--Tooth typ I i inne),

(4) choroby genetycznie heterogenne, jak choroba Alzheimera czy choroba Parkinsona.

W mmeJszej pracy omówione zostanie podłoże molekularne chorób należących do pierwszej z wymienionych grup, ze szczegól-nym zwróceniem uwagi na choroby zwyrod-nieniowe układu nerwowego.

ANTYCYPACJA W CHOROBACH UWARUNKOWANYCH GENETYCZNIE

Antycypację definiuje się jako występo­ wanie, w przypadku niektórych chorób dzie-dzicznych, zjawiska cięższego przebiegu cho-roby, której objawy występowały już w ko-lejnych, wcześniejszych pokoleniach. Pojęcie to wprowadzono na początku XX wieku w wyniku szczegółowych badań klinicznych rodzin dotkniętych dystrofią miotoniczną

(myotonic dystrophy, MD), podczas których

zaobserwowano wyraźną "ewolucję" tej cho-roby od formy łagodnej (zaćma) poprzez wystąpienie w następnych pokoleniach kla-sycznej formy MD (postępujące osłabienie i zanik mięśni), której często w tym samym lub następnym pokoleniu towarzyszyły bez-płodność, upośledzenie umysłowe i

przed-Rys. 1a CMD 5/2000 5/17

m

O

zdrowy mężczyzna

O

zdrowa kobieta • chory mężczyzna • chora kobieta

<>

pleć nieznana [ ) heterozyg o ta EJ0 nosiciele

wczesna śmiertelność, aż do wystąpienia naj-ostrzejszej, wrodzonej formy MD ( eongenital

MD, CMD) z głębokim upośledzeniem umy-słowym i zanikiem mięśni, która zawsze związana była z przekazywaniem choroby przez matkę (rys. la). Dalsze badania wyka-zały, że we wszystkich przypadkach wystą­ piło dziedziczenie cechy w sposób autosomal-ny dominujący.

Szczególny przypadek antycypacji za-obserwowano w dziedziczeniu zespołu kru-chego chromosomu X (jragile X syndrom, zespół fra-X), najczęstszej formy dziedzicz-nego upośledzenia umysłowego, przeka-zywanej jako cecha dominująca o niepełnej penetracji, sprzężona z chromosomem X.

Charakterystyczne dla zespołu fra-X jest, że 20% mężczyzn będących nosicielami muta-cji nie wykazuje objawów upośledzenia, podczas gdy 30% kobiet nosicielek opóź­ nionychjest w rozwoju umysłowym. Ponad-to córki bezobjawowych nosicieli nigdy nie wykazują objawów choroby, które pojawia-ją się dopiero w następnym pokoleniu, tzn. u ich wnuków. Podobnie, jak w przypadku

40% 16% 50% 28%

Rysunek la. Antycypacja w dziedziczeniu dystrofii miotonicznej (MD -typowa forma dystrofii, CMD - wrodzona forma dystrofii), dla poszczególnych osób zaznaczono ilość powtórzeń erG w obrębie genu

DM-19 [wg Caskey i wsp. 1992]

Rysunek Ib. Paradoks Sherman, empirycznie wyznaczone ryzyko wystąpienia objawów zespołu fra-X w zależności od położenia w rodowodzie [wg Fu i wsp. 1991]

Mutacje dynamiczne w chorobach zwyrodnieniowych układu nerwowego 51 MD, występuje tu zaostrzenie objawów

choroby w kolejnych generacjach z tym, że ryzyko zachorowania zależy od pozycji danej osoby w drzewie rodowym (rys. lb). Jest to tzw. paradoks Sherman, który mówi, że prawdopodobieństwo wystąpienia cho-roby wśród rodzeństwa bezobjawowych nosicieli jest znacznie mniejsze (9%) niż wśród jego wnuków i prawnuków (40-50%) [Sherman i wsp. 1985].

W obu wymienionych przypadkach wytłu­ maczenie obserwowanych ~awisk było nie-zmiernie trudne w świetle założeń klasycz-nej genetyki mendlowskiej, definiującej geny jako stabilne elementy tylko rzadko zmie-niane przez mutacje (częstość mutacji spon-tanicznych szacuje się na l x 10-9 _{na zasadę}

na pokolenie). Spowodowało to duży scep-tycyzm w stosunku do obserwowanego ~a­ wiska (pomimo, że antycypację opisano w kolejnych chorobach - np. w chorobie Huntingtona) i wreszcie uznanie go za wynik subiektywnego doboru danych klinicznych i statystycznych. Takie stwierdzenia można spotkać jeszcze w podręcznikach genetyki z lat osiemdziesiątych [Teisberg 1995]. Bada-nia molekularne prowadzone w tych latach wykazały jednak, że materiał genetyczny nie jest aż tak stabilny, jak zakładano uprzednio, i doprowadziły do uznania antycypacji za ~awisko autentyczne, a nie fikcję.

MUTACJE DYNAMICZNE -

MOLEKU-LARNE PODŁOŻE ANTYCYPACJI

Genetyka klasyczna definiowała mutacje jako dziedzicznie utrwalone zmiany w sek-wencji DNA prowadzące do zaburzenia prawidłowego funkcjonowania genów. Mu-tacje w takim ujęciu miały stabilny charak-ter, zarówno pod względem niezmienności przy przekazywaniu z pokolenia na pokole-nie, jak również wpływu na prawdopodo-bieństwo zajścia kolejnych zmian w obrębie zmutowanej sekwencji DNA. Do weryfika-cji tej definiweryfika-cji zmusiło odkrycie w geno-mach eukariotycznych obecności sekwencji mutujących z dużą częstością, niejednokrot-nie przy każdorazowym przekazywaniu ich potomstwu. Sekwencje takie określono mia-nem niestabilnych sekwencji DNA.

Niestabilne sekwencje DNA należą do grupy sekwencji repetytywnych (powtarza-jących się) stanowiących znaczącą frakcję

(u zwierząt do 50%) DNA genomowego. Jednym z rodzajów takich sekwencji są tzw. sekwencje mikrosatelitarne składające się z wielu następujących po sobie powtórzeń sekwencji 2-5 nukleotydowych [Charles-worth i wsp. 1994]. Sekwencje te charak-teryzują się dużym polimorfizmem, co ozna-cza, że występują w genomie w wielu for-mach różniących się między sobą ilością --ł CAO H CAO H CAO H CAO

H

CAO H CAG H CAG f--DNA

--ł OTC

H

GTC

H

OTC H GTC

H

OTC H OTC

H

GTC ~

~~::;:;::;::;:;:;:;:;:;:;:;~;:L.--:l _Nićsyntetyzowana

--ł GTC H.__----'H'---'H._ _ _,H._ _ _,H._ _ _,HL _ ___jl-- Matryca

=:z

l

---ł~;; ~Ub~~~m:::::::::jJ@::::::::::::~t.:=:::U:::::::::::::::;:;:.;?.:i;::::!

nowe ;;;rzenia

-lorcH

H

H

H

H

H

~

Rysunek 2. Schemat przedstawiający prawdopodobny mechanizm ślizgania się polimerazy (polymerase slippage) mogący prowadzić do zmiany ilości powtórzeń w obrębie sekwencji mikrosatelitarnych

powtórzeń sekwencji podstawowej. Przyczy-ną tak znacznego polimorfizmu jest zapew-ne łatwość z jaką zachodzi w ich obrębie mutacja, polegająca na zmianie - amplifi-kacji (zwiększeniu) lub kontrakcji (zmniej-szeniu) ilości jednostek podstawowych. Me-chanizm powstawania tego typu mutacji nie jest obecnie wyjaśniony. Wydaje się jed-nak, że w przypadku sekwencji mikrosate-litamych są one wynikiem tzw. ślizgania się polimerazy (polymerase sli'ppage) - rys. 2 [Dover 1995], a prawdopodobieństwo ich zajścia zależy od długości niestabilnej se-kwencji. Mutacje te określa się mianem mu-tacji dynamicznych.

Obecność niestabilnych sekwencji DNA, będących przyczyną mutacji dynamicznych nie tylko w obszarach niekodujących ge-nomu, ale i w obrębie sekwencji kodują­ cych, jest przyczyną występowania szeregu chorób genetycznie uwarunkowanych. We wszystkich opisanych do tej pory przy-padkach chorób należących do tej grupy dochodzi do amplifikacji trójnukleotydo-wych sekwencji powtórzonych (trinucleotyde

repeats, TNRs), których liczba u osób

zdro-wych utrzymuje się w określonych grani-cach, a u osób chorych znacznie je przekra-cza. Stopień niestabilności sekwencji TNR zależy od ich długości (liczby już wystę­ pujących powtórzeń), co tłumaczy zmien-ność fenotypową wywoływanych przez nie chorób, jak również zaostrzenie objawów w kolejnych pokoleniach, czyli obserwowa-ne zjawisko antycypacji.

MUTACJE DYNAMICZNE JAKO PRZYCZYNA

NIEKTÓRYCH CHORÓB

GENETYCZNYCH CZŁOWIEKA

Jak już wspomniano powyżej, występo­ wanie trójnukleotydowych sekwencji po-wtórzonych w rejonach kodujących nie-których genów jest przyczyną występowania chorób uwarunkowanych genetycznie.

Do tej pory opisano dziewięć takich jed-nostek chorobowych:

(l) zespół kruchego chromosomu X zwią­

zany z obecnością kruchego miejsca FRAXA (FRAXA mental retardation), (2) lekkie upośledzenie umysłowe związa­

ne z obecnością kruchego miejsca

FRAXE (FRAXE mental retardation),

(3) dystrofia miotaniczna (miotonic

dys-trophy - MD),

(4) rdzeniowo-opuszkowy zanik mięśni typu Kennedy'ego (spinobulbar

mus-cular atrophy - SBMA),

(5) choroba Hunringtona (Huntington

disease - HD),

(6) ataksja rdzeniowo-móżdżkowa typu l

(spinocerebellar ataxia type l - SCAl),

(7) padaczka miokloniczna z ruchami

pląsawiczymi (

dentatorubral-pallido-luysian atrophy - DRPLA) będąca

alleliczną formą zespołu Haw River

(Haw River syndrome - HRS),

(8) choroba Machado-Joseph (Machado

Joseph di'sease- MJD) alleliczna z

ata-ksją możdżkowo-rdzeniową typu 3

(spinocerebellar ataxia typ 3 - SCA3),

(9) ataksja Friedreicha (Friedreich's

ata-xia -FRDA).

Zestawienie danych dotyczących chorób związanych z amplifikacją powtórzonych sekwencji trójnukleotydowych, nazywanych niekiedy chorobami TNR (TNR disorders), przedstawiono w tabl. l.

Wśród opisanych chorób związanych

z amplifikacją sekwencji TNR na podstawie położenia w obrębie genu mutujących se-kwencji oraz zakresu chorobotwórczego

po-wtórzeń można wyróżnić dwie grupy (rys. 3).

Pierwsza z nich obejmuje cztery jednostki

chorobowe: upośledzenia umysłowe związa­

ne z kruchymi miejscami FRAXA i FRA-XE, MD i FRDA, gdzie mutacje dotyczą obszarów genów nie ulegających translacji, związane są z bardzo silną amplifikacją se-kwencji podstawowych - powyżej 200

pow-tórzeń i prowadzą do obniżenia, czy wręcz

Tablica l. Zestawienie chorób powodowanych ampliftk:acją sekwencji trójnukleotydowych (dziedziczenie: A -autosomalne, X -sprzężone z chromosomem X, D -dominujące, R-recesywne; antycypacja: mat., ojc. -występująca odpowiedź w dziedziczeniu mutacji od matki lub ojca; lok. powtórzeń: UTR -rejon genu nie ulegający translacji, ORF -otwarta ramka odczytu) Częstość Dziedzi- Antycy- Lokaliza- Pow-Ilość Lokali-Efekt l Choroba występ o-czenie pacja cja genu Gen Produkt genu tórzenia powtórzeń zacja po-mutacji w ani a wtórzeń Zespół kruchego mężczyźni:

XJD

+ (mat.) Xq27.3 FMR-1 bialko wiążące CGG norm. 5-58 5'UTR inhibicja chromosomu X 1/1250 RNA premut. 60-230 transkrypcji 11.0biety: 1/2000 mut. 230-2000 Upośledzenie umysłowe ?

XJD

(?) ? Xq28 FMR-2 ? CCG norm. 6-25 5'UTR ? (inhibicja związane z FRAXE premut.? transkrypcji) mut. >200 Dystrofia miotaniczna 1/8000

AjD

+ (mat.) 19q13.3 MT-PK miotonina-CTG norm. 5-35 3'UTR inhibicja (MD) kinaza bialkowa premut. 50-100 transkrypcji mut. 50-2000 Ataksja Friedreicha 1/50000 A/R ? 9ql8-21.1 X-25 frataksyna -GAA norm. 7-22 intron. inhibicja (FRDA) funkcja niezn. premut.? transkrypcji mu t. 20->l 000 Rdzeniowo-opuszkowy ? X/R + Xqll-q12 AR receptor CAG norm. 11-36 ORF zmiana zanik mięśni (SBMA) androgenów premut.? aktywności -cz. transkryp. mut. 40-62 bialka Choroba Buntingtona 1/10000

AJD

+ (ojc.) 4p16.3 IT15 huntingtina CAG norm. 10-36 ORF ? (zmiana (HD) -funkcja niezn. premut. 34-36 aktywności mut. 37-120 bialka) Bezład rdzeniowo-?

AjD

+ (ojc.) 6p22-p23 SCAl ataksyna-l CAG norm. 14-36 ORF ? (zmiana -móżdżkowy typu l -funkcja niezn. premut. niezn. aktywności (SCAl) mut. 43-81 białka) Ataksja Machado-?

AjD

+ (ojc.) 14q32 MIDI CAG norm. 13-37 ORF ? (zmiana -Joseph {MID/SCA3) premut. niezn. aktywności mut. 67-80 bialka) Padaczka miokloniczna ?

AjD

+ (ojc.) 12p12 B37 atrofina-1 CAG norm. 7-23 ORF ? (zmiana z ruchami pląsawiczymi -funkcja niezn. premut. niezn. aktywności (DRPLA{HRS) mut. 49-75 białka)

---~

s

~ n.· _ą.

~

~·

~ g. c

g_

g_

". ~ ci ~ n;· ;:,:

s·

~ g. ;:: ~ ~ ~

~

~ c

~

Ul w

Ryc. 3a Ryc. 3b DNA PROMOTOR hnRNA E mRNA BIAŁKO 5' UTR FRAXA CGG REJON KODUJĄCY E E E E TERMINATOR TRANSKRYPCJA SPLICING 5'UTR

l

ORF

1

3'UTR TRANSLACJA

EGZON _{INTRON E GZO N}

;

_{f~

EGZON 3' UTR

&~~-~2\~BIBI

. .

IMMI~i~ill~ii~lilliii!~!BIBIBII~~~~~~~~~~~---~~~~~~~~~~~~~~~~~~IE

ulH~ CCG

11117olll!~~:~

₀

111!

₀

11tllll••••llliiiiiiiiBBIII!BBii!!IBL8iliiiii••J~::=:::::==::::::••••~~a:::::::::;~;===::

FRAXE MD OO~~BB.BB~ii~BIBIBIMI~U~88~188~18~8ii~BIBIRI~8·~;~~~~~~~~~~~ . . 1111 . . RIMIBIIIR~~~~~~~ CAG 50-2000 SBMA 11-33

-

tst

HD CAG '8" 1~-~

z:

mm MJD/SCA3 CAG liiiBIS

li

liii88!111111111EIIilllllll . . . . llllllllii!I!18Sn 88118118888881B!U·BI-MI*!IV,~~iSIBIS 7-8 SCA1 CAG 14-36 RH H

l_1

DRPLA/HRS IIIIII H l FRDA liiilliiliii GAA

Jt

200-900 CAG 7-23 } piiifflłl8118!tl~l~lł···lllilil~ill~li.illilllil '19-~

Rysunek 3a. Schemat przedstawiający etapy ekspresji genu eukariotycznego. Sekwencja DNA zawierająca zarówno egzony (E), jak i introny (I) przepisywana jest naRNAw postaci pierwotnego transkryptu (hnRNA), z którego w procesie splicing wycinane są sekwencje niekodujące-introny. mRNA stanowi matrycę do syntezy białka, sekwencje UTR na 5' i 3' końcu cząsteczki przed kodonem AUG i za kodonem "stop" nie ulegają translacji Rysunek 3b. Schemat przedstawiający rozmieszczenie sekwencji trójnukleotydowych w genach dla różnych chorób genetycznych powodowanych mutacjami dynamicznymi. W każdym przypadku podano rodzaj sekwencji, zakres powtórzeń u osób zdrowych

Mutacje dynamiczne w chorobach zwyrodnieniowych układu nerwowego 55 FRAXA i FRAXE mamy do czynienia

z amplifikacją odpowiednio sekwencji CGG i CCG, której towarzyszy wystąpienie łamli­ wych miejsc w chromosomie X. Zwielokrot-nienie sekwencji zachodzi na 5' końcu genu. Interesujące jest, że za wystąpienie w geno-mie człowieka trzech innych miejsc łamli­ wych również odpowiedzialne są zwielokrot-nione podobne sekwencje trójnukleotydowe - FRAXF (GCC), FRA16A (CCG) oraz FRAllB (CCG) [Parrish i wsp. 1994, Jones i wsp. 1995]. We wszystkich przypadkach se-kwencje te sąsiadują z tzw. wyspami CpG

(CpG islands). Sekwencje CpG u pacjentów.

z zespołem fra-X, u których w badaniu cyto-genetycznym wykrywa się obecność miejs-ca FRAXA zawsze ulegają hipermetylacji. W przypadku MD amplifikowana jest se-kwencja CTG w rejonie 3' UTR [Brook i wsp. 1992], a w FRDA sekwencja GAA w obsza-rzelintronu genu [Campuzano i wsp. 1996].

Druga grupa- to szereg chorób, w

przy-padku których mutacje obejmują obszary genów odczytywane w procesie translacji (otwarta ramka odczytu z ang. open reading

frame- ORF), dotyczą one tylko sekwencji

CAG (kodonu kodującego glutaminę) i pro-wadzą do wydłużenia ciągu glutamin w pro-dukcie białkowym, zmieniając w ten sposób jego podstawową funkcję. Niestabilność se-kwencji nie jest tu tak silna, a liczba pow-tórzeń trójnukleotydu CAG nigdy nie prze-kracza 150. Do grupy tych chorób należą: HD [Huntington Disease Collaborative Group 1993], SBMA [La Spada i wsp. 1991], SCAl [Orr i wsp. 1994], MJD [Kawa-guchi i wsp. 1994] i DRPLA [Koide i wsp. 1994] będące chorobami zwyrodnieniowymi układu nerwowego o charakterze postępu­ jącym, związanymi z selektywną utratą neu-ronów. Choroby te dziedziczone są w spo-sób dominujący (wyjątek stanowi SBMA), charakteryzują się późnym występowaniem objawów (po 30 roku życia) i antycypacją, związaną z ojcowskim przekazywaniem zmutowanego genu, prowadzącą do wystę­ powania form młodzieńczych (objawy przed 20 rokiem życia).

Rdzeniowo-opuszkowy zanik mięśni typu Kennedy'ego

Rdzeniowo-opuszkowy zanik mięśni - to choroba należąca do grupy chorób nerwo-wo-mięśniowych charakteryzująca się zani-kiem neuronów ruchowych. Jest to choroba wieku średniego o charakterze postępują­ cym, której główne objawy obejmują osła­ bienie i zanik mięśni. Choroba dziedziczona jest jako cecha recesywna sprzężona z płcią. Występuje tylko u mężczyzn, u których oprócz głównych objawów stwierdza się ob-niżoną płodność i ginekomastię. Przyczyną tej choroby jest mutacja w l egzonie genu AR-kodującego receptor androgenu. Mu-tacja polega na amplifikacji sekwencji CAG, co prowadzi do wydłużenia ciągu glutamin na N-końcu białka. Receptor an-drogenu pełni funkcję czynnika transkryp-cyjnego aktywowanego obecnością andro-genów. Mutacja, która zaburza funkcję ak-tywującą białka, nie zachodzi jednak ani w domenie wiążącej hormon, ani w domenie oddziałującej z DNA. W chwili obecnej nie wiadomo, jaki jest związek pomiędzy am-plifikacją sekwencji CAG a degeneracją neuronów ruchowych. Nie jest to najpraw-dopodobniej prosta utrata funkcji białka, gdyż u pacjentów z delecją genu AR nie ob-serwuje się objawów charakterystycznych dla SBMA, jedynie zespół jąder feminizują­ cych [Bingham i wsp. 1995].

Choroba (pląsawica) Rontingtona

Choroba Buntingtona (HD) jest chorobą zwyrodnieniową mózgu charakteryzującą się zanikiem neuronów prążkowi a i kory płatów czołowych. Podstawowymi jej objawami są mimowolne ruchy pląsawicze (początkowo ograniczonych grup mięśni z późniejszym stałym niepokojem ruchowym z zaburzenia-mi chodu) i postępujące otępienie.

Objawy chorobowe w 90% przypadków występują między 35 i 40 rokiem życia, w 10% w tzw. postaci młodzieńczej HD, przed 20 rokiem życia. Przeciętnie chorzy umierają po 15-20 latach od pojawienia się objawów choroby. Postaci młodzieńczej,

związanej zazwyczaj z dziedziczeniem ojcow-skim, towarzyszą ostrzejsze objawy i szybszy przebieg choroby.

HD przekazywana jest jako cecha autoso-maina dominująca o pełnej penetracji. Przy-czyną tej choroby jest mutacja położonego na chromosomie4 genu IT15 kodującego huntingtynę -białko o nieznanej funkcji, nie wykazujące istotnej homologii do żadnego innego znanego obecnie białka. Huntingtyna jest białkiem cytoplazmatycznym, którego ekspresja, zarówno u osób zdrowych, jak

i chorych, zachodzi w większości tkanek -nie jest ograniczona do układu nerwowego. Mutacja chorobotwórcza w tym przypad-ku związana jest również z niestabilnością sekwencji CAG znajdującej się na 5' końcu genu IT15. Ilość powtórzeń tej sekwencji w populacji osób zdrowych jest wysoko-zmienna - od 7 do 36, z tym, że w większo­ ści przypadków (> 99%) nie przekracza 30. U osób dotkniętych HD spotyka się ilość powtórzeń CAG w zakresie od 37 do ponad 120 (najczęściej 42---44). Amplifikację tej se-kwencji powyżej 37 powtórzeń stwierdza się niemal u wszystkich (99%) pacjentów, u których rozpoznano HD. Uznaje się więc, że jest to specyficzny marker pozwalający na weryfikację rozpoznania klinicznego, a u osób pochodzących z rodzin ryzyka HD nie wykazujących objawów- na stwierdze-nie lub wykluczestwierdze-nie nosicielstwa mutacji związanej z tą chorobą.

Szereg badań wykazuje istnienie korelacji pomiędzy wiekiem zachorowania a wiel-kością rejonu powtórzeń CAG w obrębie genu IT15, tzn. im większa liczba pow-tórzeń tym wcześniej występują objawy cho-roby. Najwyraźniej zależność ta widoczna jest w przypadkach młodzieńczych, gdzie objawy występują przed 20 rokiem życia, a liczba powtórzeń przekracza 50. Liczba powtórzeń nie poiwala jednak przewidywać w konkretnym przypadku ani wieku zacho-rowania ani klinicznego przebiegu choroby. Mechanizm patogenezy choroby Hunrin-gtona nie został jeszcze poznany. Porlobnie jak w przypadku SBMA, selektywna utrata

neuronów nie jest wynikiem utraty aktyw-ności jednego allelu IT15, lecz zmiany funk-cji kodowanego przez niego białka, za czym przemawia fakt, że pacjenci z zespołem Wolf-Hirshorna, będący hemizygotami dla obszaru obejmującego gen IT15, na skutek częściowej delecji krótkiego ramienia chro-mosomu 4, nie wykazują objawów charak-terystycznych dla HD.

Dziedziczne ataksje rdzeniowo-móżdżkowe

Dziedziczne ataksje rdzeniowo-móżdżko­

we (spinocerebellar ataxias- SCAs) stanowią

heterogenną grupę postępujących chorób zwyrodnieniowych związanych z degeneracją neuronów w móżdżku, rdzeniu kręgowym i pniu mózgu. Pod względem genetycznym choroby te można podzielić na autosomalne recesywne, autosoma1ne dominujące i przy-padki izolowane. Dla ataksji o dziedziczeniu recesywnym opisano dwa loci, na chro-mosomie 8q (ataksja związana z niedobo-rem wit. E) i 9q (ataksja Friedreicha). Do chwili obecnej, zmapowano również siedem loci związanych z ataksjami o dziedziczeniu dominującym: SCAl na chromosomie 6p, SCA2 na chromosomie 12q, choroba Ma-chado-Joseph/SCA3 - 14q, SCA4 - 16q, SCA7- 3p, SCA5 w centromerowym rejo-nie chromosomu 11 i DRPLA na chromo-somie 12p - tabl. 2. W przypadku czterech z tych chorób uszkodzenia poszczegó1nych genów związane są z mutacjami dyna-micznymi. W FRDA amplifikacji ulega trój-nukleotyd GAA położony w obrębie intronu prowadząc do obniżenia poziomu mRNA, w SCAl, MJD oraz DRPLA amplifikacji ulega sekwencja CAG w otwartej ramce odczytu, prowadząc, podobnie jak w przy-padku SBMA i HD, do powstania białka o zwiększonym ciągu glutamin.

U chorych z SCA2 i SCA 7 (AD CAli) również stwierdzono występowanie białek o dużych rejonach paliglutaminowych [Trottier i wsp. 1995], co, biorąc pod uwagę fakt występowania antycypacji w ich dzie-dziczeniu, może wskazywać na analogiczne podłoże molekularne mutacji.

Mutacje dynamiczne w chorobach zwyrodnieniowych układu nerwowego 57 Tablica 2. Zestawienie danych dotyczących ataksji o charakterze dziedzicznym [wg Harding 1995,

Schols i wsp. 1995, Junck i Fink 1996]

Lokalizacja genu Mutacja Częstość występowania l. Ataksje o dziedziczeniu recesywnym

AVED 8ql3 nieznana nieznana

FRDA 9ql8-q21.1 powt. GAA cz. 1/50000 (nos. 1/120) 2. Ataksje o dziedziczeniu dominującym

AutosomaJne dominujące ataksje móżdżkowe typu I - ADCA I

SCAl 6p22-23 powt. CAG 17%

SCA2 12p23-24 nieznana (CAG?) nieznana SCA3/MID

14q32 powt. CAG 18%

SCA4 16q24 nieznana nieznana

AutosomaJne dominujące ataksje móżdżkowe typu II - ADCA II

SCA7 3p14-21.1 nieznana (CAG?) nieznana AutosomaJne dominujące ataksje móżdżkowe typu III - ADCA III

SCAS llcent. nieznana nieznana

DRPLAjHRS -padaczka miokloniczna z ruchami pląsawiczymi

12p12 powt. CAG 3%

AutosomaJne dominujące ataksje periodyczne 12p i 19p

DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA MUTACJI DYNAMICZNYCH

nieznane

Diagnostyka molekularna chorób wywo-ływanych przez mutacje dynamiczne opiera

się w chwili obecnej na bezpośredniej ana-lizie regionów ulegających mutacji. Sposób diagnostyki dla wszystkich chorób należą­ cych do tej grupy jest podobny i jego pod-stawą jest określenie wielkości fragmentu

4a 4b (CGG)n EcoRI EcoRI sonda

l

l

l

~~ pełna

mutacja - promutacja .... _ - _ -_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ -_, allel dziki- 5,2 kb

Rysunek 4. Diagnostyka molekularna w zespole fra-X oparta na analizie restrykcyjnej DNA połączonej z hybrydyzacją. DNA cięty jest enzymem restrykcyjnym EcoRI, a następnie fragmenty DNA rozdzielane są w żelu agarazowym i po przeniesieniu na f:Jltr hybrydyzowane z sondą. Niestabilne sekwencje (CGG). położone są wewnątrz fragmentu EcoRI rozpoznawanego przez sondę (4a). Wielkości hybrydyzujących fragmentów

NPR.

(CAG 37 -120)

PR.

(CAG 8- 34)

Rysunek 5. Diagnostyka molekularna w chorobie Huntingtona. Na zdjęciu przedstawiona jest

analiza produktów amplifikacji PCR rejonu obejmującego powtórzenia (CAG). genu IT15.

Produkty reakcji rozdzielone zostały w 6% żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących.

Wielkośc;i poszczególnych fragmentów, na podstawie których wyliczono liczbę powtórzeń CAG,

.ustalono poprzez bezpośrednie ich porównanie ze standardem wielkości - w tym przypadku

reakcja sekwencjonowania faga Ml3/mp18. Amplifikację DNA prowadzono przy zastosowaniu

Mutacje dynamiczne w chorobach zwyrodnieniowych układu nerwowego 59

DNA obejmującego region niestabilny oraz ustalenie czy ilość powtórzeń sekwencji TNR znajduje się w zakresie patogennym dla danej choroby. W badaniach stosuje się dwie pod-stawowe metody: analizę restrykcyjną połą­ czoną z hybrydyzacją oraz reakcję amplifika-cji DNA metodą PCR (rys. 4, 5). Pierwsza z tych metod wykorzystywana jest w testach diagnostycznych chorób związanych z silną amplifikacją sekwencji TNR (MD, zespół

fra-X), druga stosowana jest w diagnostyce wszystkich chorób, gdzie dochodzi do ogra-niczonej amplifikacji sekwencji CAG.

Bezpośrednia analiza molekularna nie-stabilnych rejonów DNA o znaczeniu cho-robotwórczym pozwala na jednoznaczną klasyfikację jednostek chorobowych (co jest szczególnie istotne w przypadku HD i atak-sji móżdżkowych o dziedziczeniu dominują­ cym), a w praktyce może być wykorzysty-wana jako rutynowe badanie weryfikujące diagnozę kliniczną. Analiza DNA pozwala również na ustalenie nosicielstwa choroby u osób nie wykazujących objawów, a po-chodzących z rodzin ryzyka genetycznego oraz w diagnostyce prenatalnej.

Badania tego typu powodująjednak szereg problemów etycznych, szczególnie w przy-padku chorób zwyrodnieniowych układu nerwowego o późnym wieku zachorowania. Doprowadziło to już do opracowania między­ narodowych zasad poradnictwa genetycznego dla rodzin dotkniętych HD [IHA, WFN 1994], które również powinny być stosowane w przypadku pozostałych chorób o podob-nym przebiegu kliniczpodob-nym i takim samym podłożu genetycznym.

PIŚ:MIENNICTWO

l. Bingbam P.M., Scott M.O., Wang S.M., McPhaul M.J., Wilson E.M., Garbem J.Y., Merry D.E., Fischbeck K.H.: Stability of expanded trinucleotide repeat in the andro-gen receptor andro-gene in transandro-genie mice. Nature Genetics 1995, 9, 191-196

2. Brook J.D., McCurrach M., Harley H.G.: Molecutar basis of myotonic dystrophy:

ex-pansion of a trinucleotide (CTG) repeart at the 3' end of a transcript encoding a pro-tein kinase famiły member. Celi 1992, 68, 799-808

3. Campuzano V., Montermini L., Molto M.D., Pianese L., Cossee M., Cavalcanti F., Koenig M., Pandolfo: Friedreich's ataxia: autosomai recessive disease caused by an intro-nic GAA tripiet repeat expansion. Science

1996, 271, 1423-1427

4. Caskey C.T., Pizzuti A., Fu Y-H., Fenwiek R.G., Nelson D.L.: Tripiet repeat muta-tions in human disease. Science 1992, 256, 784-789

5. Charlesworth B., Sniegowski P., Stepban W.: The evolutionary dynamics of repetitive

DNA in eukaryotes. Nature 1994, 371,

215-220

6. Dover G. : Slippery DNA runs on and on and on .... Nature Genetics 1995, 10, 254-256

7. Fu Y-H., Kuhl D.P., Pizzuti A., Pieretti M., Sutcliffe J.S., Richards S., Verkerk A.J.M., Warren S.T., Oostra B.A., Caskey C.T.: V ariation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution

of the Sherman paradox. Celi 1991, 67,

1047-1058

8. Huntington Disease Collaborative Research Group: A novel gene containing a trinucleo-tide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosome. Cell

1993, 72, 971-983

9. International Huntington Association (IHA) and World Federation of Neurology (WFN): Guidelines for the molecular genetics predic-tive test in Huntington's disease. Neurology

1994, 44, 1533-1536

10. Kawaguchi Y., Okamoto T., Tamiwaki M.: CAG expansion in anovel gen e for Macbado--J osep h disease at chromosame 14q 32.1. N atu-re Genetics 1994, 8, 221-228

11. Koide R., Ik:euchi T., Onodera 0., Tana-ka H., Igarashi S., Miike T., Naito H., Iku-ta F., Tsuji S.: UnsIku-table expansion of CAG repeat in hereditary dentatorubral-pallido-luysian atrophy (DRPLA) Nature Genetics

1994, 6, 9-13

12. La Spada A.R., Wilson E.M., Lubahn D.B.,

Harding A.E., Fischbeck K.H.: Androgen receptor gene mutations in X-linked spinał

and bulbar muscular atrophy. Nature 1992, 352, 77-79

60

13. Muller U., Graeber M.B., Haberhausen G., Kohler A.: Molecular basis and diagnosis of neurogenetic disorders. J. Neurol. Sciences 1994, 124, 119-140

14. Orr H. T., Chung M., Banfi S., (1993) Expan-sion of unstable trinucleotide CAG repeat in spinocerebellar ataxia type I. Nature Gene-tics, 1993, 4, 221-226

15. Parrish J., Oostra B.A., Verkerk J.M.H., Richards C.S., Reynolds J., Spikes A.S., Shaffer L.G., Nelson D.L.: Isolation of GCC repeat showing expansion in FRAXF, a fra-gile site distal to FRAXA and FRAXE. Na-ture Genetics 1994, 8, 229-235

16. Sherman S.L., Jacobs P.A., Morton N.E., Froster-Iskenius U., Howard-Peebles P.N., Nielsen K.B., Watson M.: Furtber

segrega-tion analysis of the fragile X syndrome with speclal reference to transmiting males. Hum. Genet. 1985, 69, 3289-3299

17. Teisberg P .: The genetic background o f an-ticipation. J.Royal Society of Medicine 1995, 88, 185-187

18. Trottier Y., Lutz Y., Stevanin G., Imbert G., Devys D., Cancel G., Agid Y., Brice A., Mandel J-L.: Polyglutamine expansion as a pathological epitope in Huntingtin's dise-ase and four dominant cereheHar ataxias. Nature 1995, 378, 403-406

19. Warner J.P., Barran L.H., Brock J.H.: A new polymerase chain reaction (PCR) assay for the trinucleotide repeat that is unstable and expan-ded on Huntington's disease chromosomes. MolecuTiar and Cellular Probes 1993,7,235-239 Adres: Dr Dorota Hoffman-Zacharska, Zakład Genetyki IPiN,