Medycyna Wet. 2007, 63 (11) Suplement 1474
Praca oryginalna Original paper
Corynebacterium pseudotuberculosis jest Gram-do-datni¹, nieregularn¹ i mikroaerofiln¹ pa³eczk¹. Jest jed-nym z wa¿niejszych maczugowców chorobotwórczych dla zwierz¹t (15). Liczne dane pimiennictwa wskazu-j¹, ¿e zaka¿enia tym drobnoustrojem od wielu lat sta-nowi¹ powa¿ny problem w chowie i hodowli zwierz¹t w wielu krajach na wiecie i w Polsce (6, 9, 11, 12, 14). Corynebacterium pseudotuberculosis jest czynnikiem etiologicznym serowaciej¹cego zapalenia wêz³ów ch³onnych u kóz i owiec, jednej z wa¿niejszych chorób bakteryjnych ma³ych prze¿uwaczy. Choroba rzadko koñczy siê mierci¹, jest jednak przyczyn¹ powa¿nych strat ekonomicznych. Prowadzi m.in. do spadku kon-dycji zwierz¹t, obni¿enia przyrostów, spadku masy cia³a i wydajnoci mlecznej, a tak¿e produkcji we³ny u owiec (9, 12). Antybiotykoterapia zaka¿eñ jest ma³o skutecz-na z uwagi skutecz-na tworzenie siê otorbionych ropni, do któ-rych przenikanie antybiotyków jest utrudnione (13).
Celem badañ by³o okrelenie fenotypu i genotypu szczepów C. pseudotuberculosis wyizolowanych od kóz z objawami klinicznymi serowaciej¹cego zapalenia wêz³ów ch³onnych.
Materia³ i metody
Szczepy bakteryjne. Do badañ wykorzystano 61 szcze-pów C. pseudotuberculosis, wyizolowanych z ropni wêz³ów ch³onnych u kóz pochodz¹cych z 20 stad zlokalizowanych na obszarze ca³ego kraju, bêd¹cych pod ocen¹ u¿ytkowoci oraz szczep referencyjny C. pseudotuberculosis ATTC 43927 (LGC Promochem).
Badanie w³aciwoci fenotypowych izolatów C. pseudo-tuberculosis obejmowa³o okrelenie cech wzrostu, morfolo-gii komórek w preparatach barwionych metod¹ Grama, ozna-czenie w³aciwoci biochemicznych, w tym zdolnoci do produkcji fosfolipazy D (PLD). Cechy wzrostu C. pseudo-tuberculosis okrelano na pod³o¿u agarowym wzbogaconym (Biomed) z dodatkiem 5% krwi baraniej (AK), po 48-go-dzinnej inkubacji w 37°C, w warunkach mikroaerofilnych. Do charakterystyki biochemicznej wykorzystano test API
W³aciwoci fizjologiczne i zmiennoæ genomowa
szczepów Corynebacterium pseudotuberculosis
wyizolowanych od kóz w Polsce*
)
ILONA STEFAÑSKA, MAGDALENA RZEWUSKA, MARIUSZ NOWICKI*, JAROS£AW KABA*, MARIAN BINEK
Zak³ad Bakteriologii i Biologii Molekularnej Katedry Nauk Przedklinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa
*Zak³ad Chorób Zakanych i Epidemiologii Katedry Nauk Klinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Nowoursynowska 159c, 02-776 Warszawa
Stefañska I., Rzewuska M., Nowicki M., Kaba J., Binek M.
Physiological properties and genomic diversity of Corynebacterium pseudotuberculosis strain isolates from goats in Poland
Summary
The aim of the present study was the phenotypic and genotypic characterization of Corynebacterium pseudotuberculosis strains isolated from goats with symptoms of caseous lymphadenitis, derived from herds in Poland. Sixty one isolates were studied and their morphology of colonies and cells, biochemical properties, production of phospholipase D were determined. All strains were genotyped by ADSRRS-fingerprinting.
The results of the study showed the significant variability in biochemical and genetic properties of C. pseudo-tuberculosis strains. Among all isolates, 11 distinct biochemical groups were determined. All strains produced phospholipase D, the main virulence factor of C. pseudotuberculosis, and all but one isolate had no ability to reduce nitrate to nitrite. We also found a variability in the activity of alkaline phosphatase, alfa-glucosidase, pyrazinamidase and fermentation of maltose and sucrose. Genotyping of strains showed 10 distinct genome patterns consisting of 11 to 20 bands between approximately 1400-100 bp. The obtained results indicate that ADSRRS-fingerprinting technique could be a useful tool for the screening of genome differentiation and establishing relationships between clinical isolates of C. pseudotuberculosis.
Keywords: Corynebacterium pseudotuberculosis, caseous lymphadenitis, ADSRRS-fingerprinting
*) Badanie wykonane w ramach projektu badawczego KBN nr: N308 037 31/
Medycyna Wet. 2007, 63 (11) Suplement 1475 Coryne, wykonany zgodnie z procedur¹ podan¹ przez
pro-ducenta (BioMérieux). Wytwarzanie PLD wykrywano w te-cie CAMP. W tete-cie wykorzystano szczep Staphylococcus aureus wytwarzaj¹cy beta toksynê oraz szczep Rhodococ-cus equi. Wyniki odczytywano po 24 i 48 godzinach inkuba-cji w 37°C.
Analiza genomowa. Genomowy DNA izolowano z ko-mórek C. pseudotuberculosis przy pomocy zestawu Geno-mic Mini AX BACTERIA (A&A Biotechnology). W celu rozbicia ciany komórkowej bakterii, komórki preinkubo-wano w roztworze lizozymu (10 mg/ml; Sigma) w 37°C przez 16 godzin. Dalsze etapy izolacji przebiega³y zgodnie z pro-cedur¹ podan¹ przez producenta. Do genotypowania szcze-pów wykorzystano technikê ADSRRS-fingerprinting (Am-plification of DNA Fragments Surrounding Rare Restric-tion Sites) wed³ug Krawczyk i wsp. (8). DNA genomowy poszczególnych szczepów trawiono 2 enzymami restrykcyj-nymi NotI (5 U) i BglII (5 U). Reakcja trawienia przebie-ga³a w 37°C przez 16 godzin, a nastêpnie uzyskany DNA oczyszczano z mieszaniny enzymów restrykcyjnych poprzez precypitacjê w obecnoci izopropanolu. Otrzymane produk-ty trawienia enzymaproduk-tycznego poddawano reakcji ligacji z odpowiednio zaprojektowanymi adaptorami, sk³adaj¹cy-mi siê z dwóch oligonukleotydów: adaptora krótkiego dla enzymu NotI:
5-GGCCGTCGACGTT-3
3-CAGCTGCAACCACCTACTTCC-5 i adaptora d³ugiego dla enzymu BglII:
5-GATCCGTCGACAACGGCGTTCCT TCGTCTAC-CATCC-3
3-GCAGCTGTTGCCGCAAGGAAGCAGATGG-TAGG-5
DNA po precypitacji rozpuszczano w 20 µl mieszaniny zawieraj¹cej: 2 µl buforu do ligacji, po 20 pM ka¿dego z adaptorów, 1 µl T4 DNA ligazy (MBI Fermentas) i wodê do objêtoci 20 µl. Mieszaninê reakcyjn¹ inkubowano w 16°C przez 16 godzin. Produkty reakcji precypitowano izopropanolem, DNA rozpuszczano w 20 µl buforu TE, a nastêpnie przeprowadzano reakcjê amplifikacji. Miesza-nina reakcyjna sk³ada³a siê z 2,5 µl buforu dla polimerazy DNA (10 ×), 5 µl dNTP Mix (2 mM; MBI Fermentas), 2 µl MgCl2 (50 mM), 50 pM ka¿dego ze starterów
(5-GGATG-GTAGACGAAGGAACGC-3 i 5-CCTTCATCCACCA-ACGTCGAC-3) (IBB PAN), 3 µl produktów reakcji liga-cji, 1 U Pwo DNA polimerazy (DNA Gdañsk II) oraz wody do objêtoci 25 µl. Reakcjê przeprowadzano w warunkach opisanych przez Krawczyk i wsp. (8). Rozdzia³ produktów PCR prowadzono metod¹ elektroforezy w 8% ¿elu poli-akryloamidowym (Serva), w buforze TAE przy napiêciu 110 V. Po elektroforezie ¿el wybarwiano w roztworze brom-ku etydyny (0,5 µg/ml, Sigma). Analizê porównawcz¹ otrzy-manych profili elektroforetycznych przeprowadzono przy po-mocy programu Quantity One (VersaDoc; Bio-Rad).
Wyniki i omówienie
Badane szczepy C. pseudotuberculosis na pod³o¿u AK po 48-godzinnej inkubacji tworzy³y drobne kolo-nie (ok. 0,5-1,5 mm rednicy), okr¹g³e, wypuk³e, kolo- nie-przejrzyste, matowe, skórzaste, o nieregularnym brze-gu i bia³ym zabarwieniu. Du¿a zawartoæ zwi¹zków li-pidowych w cianie komórkowej bakterii powodowa³a
woskowy wygl¹d kolonii oraz ³atwe przesuwanie ich po powierzchni pod³o¿y sta³ych (15). Wokó³ kolonii widoczna by³a w¹ska strefa hemolizy typu beta, jako przejaw aktywnoci wytwarzanej przez C. pseudo-tuberculosis PLD (1). Po d³u¿szej inkubacji (powy¿ej 72 godzin) kolonie przyjmowa³y zabarwienie jasno-¿ó³te, kremowe i stawa³y siê suche, rozpadaj¹c siê pod dotkniêciem ezy. Po przesuniêciu kolonii widoczne by³y go³ym okiem, niewielkie wg³êbienia w pod³o¿u, bêd¹-ce skutkiem aktywnoci proteolitycznej drobnoustro-jów.
W preparatach mikroskopowych stwierdzano Gram--dodatnie, drobne pa³eczki, wykazuj¹ce czêsto znacz-ny polimorfizm (formy maczugowate lub ziarenkowa-te). Komórki w preparacie mikroskopowym tworzy³y zwykle skupiska, uk³adaj¹c siê w charakterystyczny spo-sób przypominaj¹cy pismo klinowe. Zaobserwowano tak¿e, ¿e w starszych hodowlach lub po wielokrotnym pasa¿owaniu komórki C. pseudotuberculosis ulega³y silnemu skróceniu, tworz¹c formy ziarniakowate.
Przeprowadzone badania biochemiczne wykaza³y du¿e zró¿nicowanie szczepów C. pseudotuberculosis wyizolowanych od kóz w Polsce i potwierdzi³y sygna-lizowan¹ przez innych badaczy zmiennoæ fenotypow¹ tych drobnoustrojów (7, 14). Wszystkie szczepy fer-mentowa³y glukozê i rybozê z wytworzeniem kwasu, natomiast zdolnoæ do wykorzystania maltozy stwier-dzono u 43 szczepów (70%). U dwóch izolatów (3%) wykryto tak¿e zdolnoæ do fermentowania sacharozy. Wyniki testów na fermentacjê pozosta³ych cukrów ksylozy, mannozy, laktozy i glikogenu, by³y ujemne. Wszystkie izolaty charakteryzowa³y siê aktywnoci¹ katalazy i ureazy oraz nie hydrolizowa³y eskuliny i ¿e-latyny. Badane szczepy wykazywa³y zmienn¹ aktyw-noæ trzech enzymów: fosfatazy alkalicznej, a-gluko-zydazy oraz pirazynoamidazy. Ostatni enzym wykryto tylko u jednego szczepu, co potwierdza bardzo rzadkie wytwarzanie tego enzymu przez C. pseudotuberculo-sis. Aktywnoæ enzymatyczn¹ fosfatazy alkalicznej wykryto u 33 izolatów (54%), reakcja ta by³a jednak w wiêkszoci przypadków s³aba. Natomiast a-gluko-zydazê wytwarza³y 44 szczepy (72%). U ¿adnego z izo-latów nie stwierdzono reakcji dodatniej w próbach na obecnoæ arylamidazy pirolidonylowej, b-galaktozyda-zy, b-glukuronidazy oraz N-acetylo-b-glukozaminida-zy. W przypadku jednego izolatu stwierdzono jego zdol-noæ redukcji azotanów do azotynów. W 1989 r. Biber-stein i wsp. na podstawie tej w³aciwoci wyró¿nili w obrêbie gatunku C. pseudotuberculosis dwa biotypy. Uznano, ¿e szczepy, które s¹ izolowane od ma³ych prze-¿uwaczy, nie redukuj¹ azotanów, nale¿¹ do biotypu ovis, natomiast szczepy izolowane od koni i byd³a cechuje reakcja dodatnia i nale¿¹ one do biotypu equi (2). Ba-danie szczepów nale¿¹cych do ró¿nych biotypów, z wy-korzystaniem technik biologii molekularnej, jak REA, RFLP i PFGE, potwierdzi³o istnienie pomiêdzy nimi ró¿nic nie tylko fenotypowych, ale tak¿e genotypowych (4, 14, 16). Dotychczas nie wyjaniono, czy mo¿e
do-Medycyna Wet. 2007, 63 (11) Suplement 1476
chodziæ do transmisji C. pseu-dotuberculosis biotypu equi do kóz i owiec oraz do koni biotypu ovis (3).
Na podstawie badañ w³as-nych wyodrêbniono wród poddanych analizie 61 szcze-pów 11 grup ró¿ni¹cych siê biochemicznie (tab. 1). Szeæ grup obejmuje wiêcej ni¿ je-den szczep (od 2 do 15), pod-czas gdy piêæ pozosta³ych grup reprezentowanych jest
przez pojedyncze izolaty C. pseudotuberculosis. Za jeden z g³ównych czynników determinuj¹cych zjadliwoæ szczepów C. pseudotuberculosis i odgrywa-j¹cych bardzo wa¿n¹ rolê w mechanizmie chorobotwór-czoci tych pa³eczek, uwa¿a siê enzym o aktywnoci hemolitycznej fosfolipazê D (1, 15). W tecie CAMP z u¿yciem beta-toksycznego szczepu S. aureus wszyst-kie badane szczepy C. pseudotuberculosis powodowa-³y zahamowanie aktywnoci hemolitycznej gronkow-ca. Pod wp³ywem PLD sfingomielina, obecna w b³onie komórkowej erytrocytów ssaków, hydrolizowana zo-staje do fosforanu ceramidu, który nie jest wykorzysty-wany jako substrat dla gronkowcowej fosfolipazy C (PLC) (1, 15). Natomiast w tecie CAMP, w którym u¿yto szczepu R. equi uzyskano efekt nasilenia hemoli-zy przez wshemoli-zystkie izolaty C. pseudotuberculosis, PLD oraz wytwarzana przez R. equi PLC dzia³aj¹ sekwen-cyjnie. Pochodz¹cy z rozpadu sfingomieliny fosforan ceramidu jest substratem dla wytwarzanej przez szcze-py R. equi PLC. W efekcie dochodzi do ca³kowitej de-gradacji sfingomieliny oraz uszkodzenia b³ony komór-kowej erytrocytów i ich lizy (1). Wyniki testu CAMP, a tak¿e obecnoæ w¹skiej strefy hemolizy pojawiaj¹cej siê wokó³ kolonii ka¿dego z izolatów wskazuj¹, ¿e wszystkie wytwarzaj¹ PLD.
W wyniku genotypowania 62 szczepów C. pseudo-tuberculosis (61 izolatów oraz szczep referencyjny) metod¹ ADSRRS-fingerprinting otrzymano z³o¿one wzory amplifikacyjne, na które sk³ada³o siê od 11 do 20 pr¹¿ków DNA o zró¿nicowanej wielkoci, od oko³o 1400 do 100 pz (ryc. 1). Dziewiêæ fragmentów jedna-kowej wielkoci stwierdzono u wszystkich szczepów. Analiza uzyskanych wyników umo¿liwi³a wyró¿nienie wród badanych szczepów C. pseudotuberculosis 10 odmiennych profili genotypowych, oznaczonych od I do X. Najwiêksz¹ liczbê szczepów zaliczono do ge-notypu I (38 izolatów). U 5 szczepów stwierdzono wzo-ry unikatowe (genotypy VI-X). Pozosta³e genotypy obejmowa³y odpowiednio 8 (II), 5 (III), 4 (IV) i 2 (V) izolaty.
Szczepy izolowane od kóz z tego samego stada nie zawsze cechowa³y siê identycznym profilem ADSRRS. Natomiast w przypadku niektórych szczepów izolowa-nych od zwierz¹t pochodz¹cych z ró¿izolowa-nych stad, z ró¿-nych regionów kraju, wykazano przynale¿noæ do tego
samego genotypu. Interesuj¹ce wyniki uzyskano dla dwóch badanych szczepów, które zosta³y wyizolowane od tego samego zwierzêcia jeden z ropnia wêz³a ch³on-nego przyuszniczego, a drugi z ropnia wêz³a ch³onne-go przed³opatkowech³onne-go. Szczepy te cechuj¹ ró¿ne w³a-ciwoci fenotypowe i genotypowe. Pierwszy izolat wy-twarza³ fosfatazê alkaliczn¹ i nie fermentowa³ maltozy, drugi natomiast wykazywa³ zdolnoæ do fermentacji maltozy, ale nie wytwarza³ fosfatazy alkalicznej. Na tej podstawie badane izolaty zosta³y zakwalifikowane od-powiednio do grupy biochemicznej E i A. Dla obu szcze-pów uzyskano tak¿e odrêbne wzory amplifikacyjne, charakterystyczne odpowiednio dla VIII i II profilu ge-nomowego.
Dotychczas nie opisano przypadku izolacji od ma-³ych prze¿uwaczy szczepu C. pseudotuberculosis, któ-ry wykazywa³by zdolnoæ do redukcji azotanów. Costa i wsp. (5) wyizolowali szczep C. pseudotuberculosis od konia, który nie wytwarza³ reduktazy azotanowej. Jednak¿e rybotypowanie tego izolatu wykaza³o podo-bieñstwo do innych szczepów biotypu equi, redukuj¹-cych azotany. Mimo fenotypowych w³aciwoci cha-rakterystycznych dla szczepów biotypu ovis, genoty-powo ten szczep ró¿ni³ siê od pozosta³ych. Wyizolo-wany w prezentoWyizolo-wanych badaniach szczep wytwarza-j¹cy reduktazê azotanow¹ zosta³ zaliczony do profilu
i c o w i c a ³ W Grupabiochemiczna(ilczbaszczepów) ) 5 1 ( A B(13) C(11) D(11) E(4) F(2) G(1) H(1) I(1) J(1) K(1) w ó n a t o z a a j c k u d e R + a z a d i m a o n y z a ri P + a n z c il a k l a a z a t a f s o F + + + + + + + a z a d y z o k u l g -a fl A + + + + + + + * a z o tl a M + + + + + + + * a z o r a h c a S + +
Tab. 1. Grupy biochemiczne wyznaczone dla 61 izolatów C. pseudotuberculosis
Objanienie: * fermentacja
Fot. 1. Profile ADSRRS uzyskane dla 12 izolatów (cie¿ki 1-12). cie¿ka M wzorzec masowy DNA MassRuler DNA Ladder, Mix (MBI Fermentas)
Medycyna Wet. 2007, 63 (11) Suplement 1477 genomowego ADSRRS I, który stwierdzono u
przewa-¿aj¹cej liczby badanych izolatów nie redukuj¹cych azo-tanów. Wydaje siê zatem, ¿e zdolnoæ szczepów do re-dukcji azotanów nie zawsze pozwala na jednoznaczne okrelenie ich przynale¿noci do biotypu.
Szczep referencyjny C. pseudotuberculosis wykazy-wa³ w³aciwoci fenotypowe charakterystyczne dla gru-py biochemicznej A oraz profil genotypu I, identycz-nego z tym, który stwierdzono u wiêkszoci krajowych izolatów.
Dotychczas do badañ genotypowych C. pseudotuber-culosis wykorzystywane by³y takie techniki, jak: REA, RFLP, PFGE oraz RAPD. W wyniku analizy restryk-cyjnej szczepów C. pseudotuberculosis nie wykazano polimorfizmu DNA u izolatów nale¿¹cych do tego sa-mego biotypu (14). Dopiero technika RFLP pozwoli³a na wykrycie niewielkich ró¿nic wród szczepów zali-czanych do jednego biotypu (16). Znacznie bardziej przydatne w dochodzeniu epidemiologicznym, do ty-powania i oceny pokrewieñstwa klinicznych izolatów C. pseudotuberculosis, okaza³y siê metody PFGE oraz RAPD. Wykorzystuj¹c pierwsz¹ z nich, wród 47 szcze-pów izolowanych od ma³ych prze¿uwaczy, stwierdzo-no 5 ró¿nych wzorów restrykcyjnych (4). PFGE jest uznawana obecnie za najbardziej miarodajn¹ technikê genotypowania drobnoustrojów. Jednak¿e jest bardzo kosztowna, wymaga specjalistycznej aparatury oraz du¿ego dowiadczenia badawczego. Porównywalnie czu³a, a jednoczenie szybsza i mniej kosztowna jest metoda RAPD. Genotypowanie t¹ technik¹ 48 szcze-pów C. pseudotuberculosis izolowanych od koni, po-zwoli³o na wyró¿nienie 8 odmiennych profili amplifi-kacyjnych (6). Du¿¹ wad¹ metody RAPD jest niska odtwarzalnoæ wyników, zw³aszcza w skali miêdzyla-boratoryjnej.
ADSRRS-fingerprinting jest now¹ metod¹ genoty-powania, wykorzystywan¹ w epidemiologii (8, 10), któ-ra nie by³a dotychczas stosowana do oceny zmiennoci genetycznej wród szczepów C. pseudotuberculosis. Wyniki badañ potwierdzaj¹ jej du¿y potencja³ dyskry-minacyjny oraz przydatnoæ do ró¿nicowania genomo-wego izolatów klinicznych C. pseudotuberculosis po-chodz¹cych od kóz.
Porównanie cech fenotypowych i genotypowych 61 szczepów C. pseudotuberculosis, wyizolowanych od kóz, nie wykaza³o ¿adnych istotnych korelacji pomiê-dzy genotypem izolatów a ich profilem biochemicznym. W tej samej grupie genotypowej stwierdzono szczepy C. pseudotuberculosis, nale¿¹ce do ró¿nych genotypów. Badanie cech biochemicznych pozwoli³o na zaszere-gowanie wszystkich izolatów do 11 grup o odmiennych profilach aktywnoci enzymatycznej. Natomiast bada-nia na poziomie molekularnym, z wykorzystaniem tech-niki ADSRRS-fingerprinting, doprowadzi³y do wyod-rêbnienia 10 profili genomowych.
Cechy fenotypowe bakterii, w tym wytwarzanie okrelonych enzymów oraz ich aktywnoæ, s¹ znacznie mniej stabilne ni¿ cechy genotypowe i mog¹ ulegaæ
znacznym zmianom pod wp³ywem warunków rodo-wiska. W rodowisku laboratoryjnym, poza organizmem gospodarza, mo¿e dochodziæ np. do zahamowania eks-presji pewnych genów, co uwidacznia siê w fenotypie. Cechy genotypowe s¹ znacznie bardziej stabilne i nie podlegaj¹ tak du¿ym wp³ywom warunków rodowiska jak cechy fenotypowe. Dotychczas na temat zmien-noci genomowej C. pseudotuberculosis wiadomo nie-wiele.
Podsumowuj¹c, przeprowadzone badania wskazuj¹ na wystêpowanie ró¿nych fenotypowo i genotypowo, ale w ka¿dym przypadku zjadliwych, szczepów Cory-nebacterium pseudotuberculosis u kóz w Polsce. Czyn-niki przyczynowe stwierdzonej zmiennoci s¹ s³abo poznane. Uzyskane wyniki mog¹ byæ pomocne w ba-daniach epidemiologicznych i umo¿liwi¹ skuteczne monitorowanie zmiennoci genomowej izolowanych od zwierz¹t szczepów C. pseudotuberculosis.
Pimiennictwo
1.Bernheimer A., Linder R., Avigad L. S.: Stepwise degradation of membrane sphingomyelin by corynebacterial phospholipases. Infect. Immun. 1980, 29, 123--131.
2.Biberstein E. L., Knight H. D., Jang S.: Two biotypes of Corynebacterium pseudotuberculosis. Vet. Rec. 1971, 89, 691-692.
3.Brown C. C., Olander H. J., Biberstein E. L., Moreno D.: Serologic response and lesions in goats experimentally infected with Corynebacterium pseudo-tuberculosis of caprine and equine origins. Am. J. Vet. Res. 1985, 46, 2322-2326. 4.Connor K. M., Quirie M. M., Baird G., Donachie W.: Characterization of United Kingdom isolates of Corynebacterium pseudotuberculosis using pulsed-field gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 2633-2637.
5.Costa L. R. R., Spier S. J., Hirsh D. C.: Comparative molecular characterization of Corynebacterium pseudotuberculosis of different origin. Vet. Microbiol. 1998, 62, 135-143.
6.Foley J. E., Spier S. J., Mihalyi J., Drazenovich N., Leutenegger C. M.: Mole-cular epidemiologic features of Corynebacterium pseudotuberculosis isolated from horses. Am. J. Vet. Res. 2004, 65, 1734-1737.
7.Hommez J., Devriese L. A., Vaneechoutte M., Riegel P., Butaye P., Haese-brouck F.: Identification of nonlipophilic corynebacteria isolated from dairy cows with mastitis. J. Clin. Microbiol. 1999, 37, 954-957.
8.Krawczyk B., Lewandowski K., Bronk M., Samet A., Myjak P., Kur J.: Evalu-ation of a novel method based on amplificEvalu-ation of DNA fragments surrounding rare restriction sites (ADSRRS fingerprinting) for typing strains of vanco-mycin-resistant Enterococcus faecium. J. Microbiol. Methods 2003, 52, 341--351.
9.Lloyd S., Lindsay H. J., Slater J. D., Jackson P. G. G.: Corynebacterium pseudo-tuberculosis infection (caseous lymphadenitis) in goats. Goat Vet. Soc. J. 1990, 11, 55-62.
10.Masny A., P³ucienniczak A.: Fingerprinting of bacterial genomes by amplifica-tion of DNA fragments surrounding rare restricamplifica-tion sites. Biotechniques 2001, 31, 930-934.
11.Nowicki M., Stefañska I., Szalu O., Kaba J., Rzewuska M.: Wystêpowanie zaka¿eñ Corynebacterium pseudotuberculosis u kóz w Polsce. Sympozjum Zoonozy aktualne zagro¿enia. Wydzia³ Medycyny Wet. SGGW, Warszawa 2006, s. 70.
12.Rizvi S., Green L. E., Glover M. J.: Caseous lymphadenitis: an increasing cause for concern. Vet. Rec. 1997, 140, 586-587.
13.Rzewuska M., Kaba J., Nowicki M., Stefañska I., Frymus T., Binek M.: Suscep-tibility of Corynebacterium pseudotuberculosis strains isolated from goats in Poland. Annual Symposium Novelties in Pathology and Breeding of Domestic Animals, Faculty of Veterinary Medicine Cluj-Napoca 2003, 307-309. 14.Songer J. G., Bechenbach K., Marshall M. M., Olsen G. B., Kelley L.:
Bio-chemical and genetic characterization of Corynebacterium pseudotuberculosis. Am. J. Vet. Res. 1988, 49, 223-226.
15.Stefañska I., Rzewuska M., Binek M.: Corynebacterium pseudotuberculosis zaka¿enia u zwierz¹t. Post. Mikrobiol. 2007, 46 (2), 101-112.
16.Sutherland S. S., Hart R. A., Buller N. B.: Genetic differences between nitrate--negative and nitrate-positive Corynebacterium pseudotuberculosis strains using restriction fragment length polymorphisms. Vet. Microbiol. 1996, 49, 1-9.
Adres autora: prof. dr hab. Marian Binek, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa; e-mail: marian_binek@sggw.pl
